- Định tính ancaloit bằng thuốc thử Dragendoff và bằng thuốc thử Mayer.
- Định tính các Flavonoit bằng phản ứng với FeCl3 và phản ứng với dung dịch kiềm.
- Định tính Sterol bằng phản ứng với thuốc thử Liberman–Buchar. - Định tính Cumarin bằng 0,5ml dung dịch NaOH 10%, sau đó trung hoà bằng dung dịch HCl đặc.
- Định tính Saponin bằng phản ứng Fontan – Kaudel theo. - Định tính chất béo bằng giấy lọc.
2.4. Các phƣơng pháp sắc ký để phân lập các chất từ dịch chiết
Phân lập các hợp chất tinh khiết từ các dịch chiết bằng việc sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký như: sắc ký cột thường (SKC), sắc ký bản mỏng phân tích (TLC), sắc ký bản mỏng điều chế (PTLC)…
2.5. Các phƣơng pháp hoá lý để nhận dạng cấu trúc
Cấu trúc của các chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ: hồng ngoại (IR), tử ngoại (UV-VIS), phổ khối ion hoá bụi
electron (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR, các bon
13
C-NMR và DEPT.
2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê.
Giá trị trung bình: X=xi /n Sai số tuyệt đối: x t(, f ).Sx
Phương sai: 1 ) ( 2 2 n x x S i Sai chuẩn: n S Sx
Kết quả: x= x x Khoảng giới hạn tin cậy: x= t(,f).Sx
Trong đó: xi: giá trị số liệu thực nghiệm
x: trung bình cộng
n: số lần thí nghiệm
Chƣơng 3 Phần thực nghiệm 3.1. Dụng cụ, thiết bị và hoá chất
a, Dụng cụ và thiết bị chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
+ Bình chiết 30l
+ Máy cất quay chân không
+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm + Tủ sấy chân không
+ Máy sấy + Micropipet
+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Cột sắc ký pha thường các loại đường kính + Cột sắc ký pha ngược trung áp
+ Máy phun dung dịch thuốc thử + Bếp điện
b, Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc
+ Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR Spectro-meter + Máy sắc ký lỏng cao áp ghép nối khối phổ (ESI) AGILENT 1100 LC-MSD Trap spectrometer
+ Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro-hostage + Thiết bị đo độ quay cực JASCO (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c, Hoá chất
- Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản nhôm tráng sẵn Silicagel 60
F254 (Merck) độ dày 0,2 mm.
- Sắc ký cột: sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 100-160 mesh và cỡ hạt 0,063- 0,200 mesh.
- Dung môi chạy cột: dung môi được sử dụng chạy cột là n-hexan, etylaxetat, metanol, clorofoc,… Tất cả các dung môi chạy sắc ký đều được cất lại và làm khan trước khi sử dụng.
- Phát hiện vệt chất: đèn UV 254 nm và 368nm, thuốc thử xerisunphat
+ H2SO4 hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
d, Thiết bị
- Điểm chảy: được đo trên máy BOTIUS (Heiztisch Mikroskop) của Đức.
- Phổ khối ion hoá bụi electron ESI-MS: được đo trên máy Thermo Finnigan LCQ Avantage spectrometer.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- (500MHZ), 13H- (125MHZ) và
DEPT được ghi trên máy Bruker AM500-FT-NMR.
3.2. Điều chế các phần chiết
15,0 kg (tươi) cây Dischidia acuminata được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy
khô ở nhiệt độ 400C thu được 2,5kg; sau đó đem nghiền nhỏ thành dạng bột
mịn và ngâm chiết với metanol 4 lần ở 400C. Gộp các dịch chiết metanol, lọc
qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 82 gam cặn chiết metanol tổng.
Phần còn lại của dịch chiết tổng được chiết tiếp với etyl axetat, cất loại dung môi thu được 18,2 gam cặn etylaxetat kí hiệu là: DA1B. Bổ sung n- butanol vào phần còn lại sau khi chiết với etyl axetat cất loại dung môi ta thu được 5,3 gam cặn n-butanol kí kiệu là: DA1C và lớp nước còn lại của cả quá trình kí hiệu là: DA1D.
3.3. Phân tích định tính các cặn chiết bằng phản ứng màu
3.3.1. Phản ứng định tính các Ancaloit
Lấy 0,01 gam cặn chiết cho thêm 5 ml H2SO4 5%, lắc kỹ lọc qua giấy
lọc, sau đó lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống cho một ml nước lọc axít này. ống 1: cho 1-2 giọt thuốc thử Dragendoff, nếu thấy xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
ống 2: cho 1-2 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính.
3.3.2. Phản ứng định tính các Flavonoit
* Phản ứng với FeCl3
Cho vài giọt dung dịch FeCl3 5% vào 1 ml dịch chiết cần thử, nếu thấy
xuất hiện kết tủa xanh đen thì phản ứng là dương tính. * Phản ứng với dung dịch kiềm
Nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10% vào 1 ml dung dịch cần thử. Nếu thấy xuất hiện màu vàng đậm thì phản ứng là dương tính.
3.3.3. Phản ứng định tính các sterol
Phản ứng với thuốc thử Liberman-Buchard. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách pha thuốc thử : trộn hỗn hợp gồm 2 dung dịch anhydrit axetic và CHCl3 theo tỷ lệ 1:1 để lạnh đến 00C, sau đó nhỏ vào vài giọt H2SO4 đặc.
Cách tiến hành phản ứng: cho 2 ml dung dịch NaOH 10% vào 0,01 gam phần chiết cần thử, đun cách thuỷ tới khô. Hoà tan phần chiết bằng
Buchard. Sau một thời gian thấy dung dịch chuyển sang màu xanh là dương tính.
3.3.4. Phản ứng định tính các cumarin
Cho 0,5 ml dung dịch NaOH 10% vào một ml dung dịch cần thử, đun cách thuỷ đến sôi, để nguội rồi thêm vào 4 ml nước cất. Sau đó trung hoà dung
dịch bằng HCl đặc đến phản ứng axit. Nếu dung dịch bị đục hoặc xuất hiện kết tủa thì phản ứng là dương tính.
3.3.6. Phản ứng định tính saponin
*Nhỏ vài giọt cần thử vào 2 ống nghiệm ống 1: chứa 5ml HCl 0,1 N
ống 2: chứa 5ml NaOH 0,1 N
-Nếu bọt xuất hiện trong 2 ống giống nhau–dịch cần thử chứa tritepen glicozit
- Nếu bọt xuất hiện trong 2 ống khác nhau thì dịch cần thử chứa steroid glicozit
* Phản ứng Fontan- kaudel
Cho vài giọt dịch cần thử vào dung dịch NaOH 0,5 N
- Nếu có nhiều bọt, không bền-dịch cần thử có chứa saponin steroid - Nếu ít bọt, không bền-dịch cần thử ít saponin steroid
3.3.6. Phản ứng định tính chất béo
Cho dịch cần thử lên giấy lọc, nếu thấy có dầu bám vào-dịch cần thử có saponin.
15gam cặn chiết etylaxetat của Dischidia acuminata được hoà với một lượng metanol cho tan hết. Sau đó được trộn với 5 gam silicagel, cỡ hạt 0,063- 0,200mm, rồi đuổi hết dung môi thu được bột tơi màu nâu sẫm. Hỗn hợp bột này được phân tách bằng sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel, dung
môi rửa giải là hỗn hợp CHCl3: MeOH theo độ phân cực tăng dần. Mỗi phân
đoạn (20ml) được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, vệt chất được phát hiện dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm, 365 nm và với thuốc thử xerisunfat +H2SO4. Các phân đoạn giống nhau được gộp lại thành các nhóm. Kết quả chúng tôi thu được 4 nhóm chính. Đó là các phân đoạn được kí hiệu là DA1B- 1, DA1B-4, DA1B-7 và DA1B-9. Phân đoạn có ký hiệu là DA1B-4 được phân tách bằng sắc ký cột pha đảo, chất hấp phụ RP-18 với hệ dung môi
MeOH: H2O (65:35), thu được chất 1 (12mg) dạng bột màu trắng (kí hiệu là
DA-1).
Phân đoạn DA1B-7 cũng được phân tách trên cột pha đảo, chất hấp phụ
RP-18 với hệ dung môi MeOH: H2O (60:40) thu được chất 2 (15mg) dạng bột
màu trắng (kí hiệu là DA-2).
3.5. Xác định cấu trúc các hợp chất
3.5.1. Dữ kiện phổ của sec-butyl--D-glucopyranoside (1):
Bột màu trắng (12 mg), mp.123-124°C, ESI-MS m/z 235 [M-H]-, 161 [M-H-74]- (M=236, CTPT C10H20O6) 1 H-NMR (CD3OD): (ppm) 0.95 (3H, t, H-4), 1.24 (3H, d, J=6.0 Hz, H-1), 1.56 (2H, m, H-3), 3.67 (1H, dd, J=12.0 and 5.0 Hz, H-6’a), 3.75 (1H, m, H-2), 3.88 (1H, dd, J=12.0 and 3.0 Hz, H-6’b), 4.33 (1H, d, J=8.0 Hz, H- 1’). 13 C-NMR: (ppm) 9.9 (C-4), 21.3 (C-1), 30.1 (C-3), 62.9 (C-6’), 71.8 (C-4’), 75.4 (C-2’), 77.8 (C-5’), 78.2 (C-3’), 78.6 (C-2), 103.8 (C-1’).
Bột màu trắng (15 mg), mp. 129-130°C, []D23 -35.9° (c 1.1, MeOH), ESI-MS m/z 221 [M-H]- (M=222, CTPT C9H18O6) 1 H-NMR (CD3OD): (ppm) 1.20 (3H, d, J=6.0 Hz, H-1), 1.23 (3H, d, J=6.0 Hz, H-3), 3.67 (1H, dd, J=12.0 and 5.0 Hz, H-6’a), 3.87 (1H, dd, J=12.0 and 3.5 Hz, H-6’b), 4.04 (1H, m, H-2), 4.33 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1’). 13 C-NMR: (ppm) 22.1 (C-3), 23.8 (C-1), 62.9 (C-6’), 71.7 (C-4’), 72.6 (C-2), 75.2 (C-2’), 77.9 (C-3’), 78.5 (C-5’), 102.6 (C-1’). chƣơng 4
Kết quả và thảo luận
4.1. Thu hái và xác định tên khoa học cây Dischidia acuminata Cost (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Đặc điểm nhận dạng:
Hình 4.1. Cây Tai Chuột (Dischidia acuminata Cost)
- Chúng tôi đã thu đựơc cây Tai Chuột với các đặc điểm sau: cây leo nhỏ, phụ sinh, có nhiều rễ mọc bám vào các cây khác hoặc trên đá vôi, lá mẫn, màu xanh lục nhạt, trông như hơi mốc do có lông mịn, phiến lá hình
thuôn dài, đầu hơi nhọn, dài từ 14 -24mm, rộng 8 -14 mm, cuống đài 4 -6 mm. Hoa giống hình nhạc.
- Đã xác định được tên khoa học là Dischidia acuminata cost thuộc họ
thiên lý (Asclepiadaceae) do PGS. Nguyễn Phương, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật giám định. Tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.
- Thời điểm và địa điểm thu hái: toàn cây được thu hái vào tháng 3 năm 2005 tại Vườn quốc gia Tam Đảo.
4.2. Điều chế các phần chiết
15,0kg toàn cây Tai Chuột tươi được rửa sạch, phơi khô thu được 2,5kg sau đó đem nghiền nhỏ và ngâm chiết với metanol (4 lần, mỗi lần 60
phút, ở 400C) bằng thiết bị siêu âm. Lọc các dịch chiết qua giấy lọc, gộp lại và
cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng metanol. Cặn chiết tổng này được bổ xung nước và phân bố lại bằng các dung môi có độ
phân cực tăng dần: n-hexan, etyl axetat và n-butanol, các dịch chiết tương ứng
đem loại dung môi thu được các cặn chiết tương ứng, kết quả được trình bày ở bảng 4.1 và sơ đồ 4.1.
Bảng 4.1. Hàm lượng các cặn chiết từ cây Tai chuột
STT Tên Thể tích dung
môi (lít)
Khối lượng (gam)
Hàm lượng (%) so với mẫu khô
1 Cặn metanol
tổng 13,0 82,0 3,28
4 Cặn n-butanol 2,5 5,3 0,21
DA1A: cặn n-hexan (10,5g)
Bột khô cây D. acuminata
(2,5 kg)
Chiết với MeOH, 400 cất loại dung môi Cặn chiết metanol tổng
(82g)
Bổ sung nước, chiết với n-hexan
cất loại dung môi
DA1B: cặn etyl axetat (18,2g) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cất loại dung môi
Lớp nước, bổ sung EtOAc
Lớp nước, bổ sung
Sơ đồ 4.1. Qui trình chiết các phân đoạn từ cây Tai chuột
4.3. Phân tích định tính các phần chiết
Để có hiểu biết sơ bộ về thành phần hoá học của cây Tai chuột chúng tôi đã tiến hành thử định tính một số lớp chất chính trên cơ sở các phản ứng định tính đặc trưng .
Cách tiến hành các phản ứng định tính được trình bày cụ thể ở phần thực nghiệm (xem mục 3.3). Kết quả nhận biết sơ bộ các nhóm chất có mặt trong các cặn chiết được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả phân tích định tính các cặn chiết n-hexan, etyl axetat và n-
butanol của cây Tai chuột S
T
T Nhóm chất
Phản ứng định tính
Cặn n-hexan Cặn etyl axetat Cặn n-butanol
Kết quả Kết luận Kết quả Kết luận Kết quả Kết luận
1 Ancaloit 1. Mayer - Không - không - không
2. Dragendoff - Không - không - không
2 Flavonoit 1. Thuốc thử kiềm - Không ++ có + Có 2. FeCl3 - Không ++ có + Có DA1C: cặn n- butanol (5,3g) DA1D: lớp nước còn lại
3 Sterol TT Liberman –
Buchard ++ có + có - không
4 Cumarin NaOH/H2O/HCl - Không - không - không
5 Saponin - không - không + Có
6 Chất béo Thử trên giấy ++ có + có - không
Ghi chú: ++: dấu hiệu phản ứng rất rõ +: dấu hiệu có phản ứng
Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy với các phản ứng định tính thử nghiệm các dịch chiết cây Tai chuột không thấy có ancaloit và cumarin.
- Cặn chiết n-hexan có thể chứa các nhóm chất sterol và chất béo.
- Cặn chiết etyl axetat chứa flavonoi có và có thể có sterol, ít chất béo.
- Cặn chiết n-butanol có thể có flavonoit và saponin.
4.4. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ cặn chiết etyl axetat cây Tai chuột chuột
Bằng việc sử dụng lặp lại sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel pha (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thường và pha đảo, dung môi rửa giải là CHCl3-MeOH với độ phân cực tăng
Sơ đồ 4.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây D. acuminata
4.5. Xác định cấu trúc các hợp chất
4.5.1. Xác định cấu trúc chất 1
Chất 1 phân lập được ở dạng bột màu trắng. Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân 1H-NMR của chất 1 cho thấy sự có mặt của nhóm sec-butyl trong phân
tử với các tín hiệu của hai nhóm metyl (CH3-) tại 1.24 (3H, d, J=6.0 Hz, H-
1), 0.95 (3H, t, H-4); một nhóm metylen (CH2-) tại 1.58 (2H, m, H-3) và
một nhóm metin (CH-) tại 3.15 (1H, m, H-2). Ngoài ra còn có tín hiệu của
một proton anomer tại 4.33 (1H, d, J =8.0Hz) cùng với các proton của các
nhóm CH-OH trong vùng từ 3.31-3.38. Độ dịch chuyển hoá học và hằng số
Cặn etyl axetat cây
D. acuminata (15gam) DA1B-1 DA 1B- 4 DA 1B- 9 DA 1B- 7 Chất 1 (12mg) (DA-1) Chất 2 (15mg) (DA-2) SKC CHCl3 - MeOH (99:1 – 1:1) SKC RP-18 MeOH : H2O (60:40) SKC RP-18 MeOH : H2O (65:35)
đường có mặt trong chất 1 là -D-glucose. Điều này được khẳng định thêm bởi 10 tín hiệu xuất hiện trên phổ cộng hưởng từ 13C-NMR bao gồm: 6 tín
hiệu của một đơn vị đường glucose [tín hiệu của các bon anomer tại 103.8
và 5 tín hiệu còn lại của phân tử đường tại 62.9 (C-6’), 71.8 (C-4’), 75.4 (C- 2’), 77.8 (C-5’) và 78.2 (C-3’)]; bốn tín hiệu của nhóm sec-butyl tại 9.9 (C- 4), 21.3 (C-1), 30.1 (C-3) và 78.6 (C-2). Phân tích các dữ liệu phổ NMR cho phép dự đoán chất 1 là một glycoside có phần aglycol là nhóm sec-butyl và
phần đường là -D-glucose. Cấu trúc này của 1 hoàn toàn phù hợp với dữ liệu
thu được từ phổ khối ion hoá bụi electron với pic phân tử tại m/z 235 [M-H]-
tương ứng với công thức phân tử là C10H20O6 (M=236). Như vậy, chất 1 được
xác định là sec-butyl--D-glucopyranoside, các dữ liệu phổ của nó hoàn toàn
phù hợp với dữ liệu của sec-butyl--D-glucopyranoside đã được báo cáo trong
tài liệu [12]. Hợp chất này được phân lập như là một thành phần chính từ
Acripeza reticulata Guer. (Orthoptera), nó có vị đắng và được coi là thành phần quan trọng để bảo vệ côn trùng khỏi các tác nhân có hại [12].
O OH OH HO OH O CH H2 C CH3 H3C 1 1' 6' 2' 3' 4' 5' 1 2 3 4 Hình 4.2. Cấu trúc của chất 1
4.5.2. Xác định cấu trúc chất 2
Chất 2 thu được dạng bột màu trắng. Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR của
2 xuất hiện tín hiệu của hai nhóm metyl tại 1.20 (3H, d, J=6.0 Hz, H-1) và
1.23 (3H, d, J=6.0 Hz, H-3). So sánh phổ cộng hưởng từ của chất 1 và 2 cho
thấy chúng tương tự nhau, điểm khác biệt của chất 2 so với chất 1 là không
thấy xuất hiện tín hiệu của nhóm metylen trong phân tử. Sự có mặt của một (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phân tử đường --D-glucopyranose trong phân tử chất 2 được xác nhận bởi tín
hiệu của proton anomeric tại 4.33 (1H, d, J=8 Hz) và 102.6. Các tín hiệu
còn lại là của nhóm isopropyl- gồm: hai nhóm metyl tại 1.20 (3H, d, J=6.0
Hz) và 1.23 (3H, d, J=6.0 Hz); một nhóm CH tại 4.04 (1H, m, H-2). Phổ khối
khối ion hoá bụi electron của chất 2 với pic phân tử tạim/z 221 [M-H]- tương
ứng với công thức phân tử là C9H18O6 (M=222) phù hợp với cấu trúc của
isopropyl--D-glucopyranoside. Kết hợp các dữ liệu phổ của chất 2 và so sánh
với các dữ liệu phổ của isopropyl--D-glucopyranoside trong tài liệu [13] cho
thấy hoàn toàn phù hợp, do vậy chất 2 được xác định là isopropyl--D-
glucopyranoside, hợp chất này cũng đã được phân lập từ quả Foeniculum