3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.3. Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin
1.3.1. Các phương pháp sắc ký cổ điển
1.3.1.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng
Phương pháp sắc ký bản mỏng được triển khai bởi Bailey J. L. rất dễ thực hiện [8]. Vì thế nó cũng được sử dụng để xác định axit amin. Tác giả Phạm Văn sổ và Bùi Thị Như Thuận (1978) đã dùng pyriđin làm dung môi triển khai chạy sắc ký bản mỏng, sau khi các axit amin được tách riêng trên bản mỏng, dựa vào chiều cao, diện tích vết của mẫu so với vết mẫu chuẩn sẽ tính ra được hàm lượng các axit amin. Phương pháp này tách tốt nhưng phải sử dụng dung môi rất độc, độ chính xác không cao. Ngày nay, với sự phát triển của các phương pháp sắc ký hiện đại, việc tách và xác định axit amin không áp dụng trên sắc ký lớp mỏng nữa.
1.3.1.2. Phương pháp sắc ký cột
Phương pháp sắc ký cột là một phương pháp sắc ký cơ bản, đơn giản, nó là nền tảng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau này.
Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột dùng ninhydrin đã được áp dụng xác định axít amin từ những năm 1940 bởi Moore, S., Stein, W, H. [46- 48] và sau này được nhiều tác giả áp dụng và cải tiến và được áp dụng trong xác định axit amin ở nhiều đối tượng khác nhau.
Nguyên lý cơ bản là axit amin được tách ra bằng cột trao đổi ion, phản ứng với ninhydrin tạo phức chất màu vàng, đo độ hấp thụ quang của phức màu thu được bằng quang kế có bước sóng 440 nm và 570 nm cho giới hạn xác định đến 10 pM với hầu hết các axit amin và 50 pM với prolin. Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã thực sự phát triển và áp dụng xác định axit amin ở nhiều đối tượng, nhưng phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột ninhydrin vẫn được áp dụng và tiếp tục hoàn thiện cho tận đến ngày nay do sử dụng thiết bị rẻ tiền, thuận tiện cho phân tích lượng lớn [54].
Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột là o-phthalaldehyd (OPA), các axit amin sau khi được tách ra khỏi cột trao đổi ion được dẫn xuất bằng OPA tạo phức chất có tính chất phát huỳnh quang, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 348nm và bước sóng phát xạ 450 nm. Phương pháp có thể tách và xác định đồng thời các axit amin bậc 1 với giới hạn phát hiện đạt tới 20 pM [45]. Dẫn xuất OPA có hạn chế lớn là không phản ứng được với các axit amin bậc 2.
Phương pháp tách sắc ký cột cổ điển là phương pháp đơn giản có thể áp dụng cho bất kỳ phòng thí nghiệm nào. Tuy nhiên, do thời gian tách lâu, khả năng tách không cao so với các kỹ thuật hiện đại nên nó chỉ được áp dụng trong các đối tượng tách đơn giản.
1.3.1.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế
ra khỏi nền mẫu và loại các chất ảnh hưởng, các axit amin sẽ được tách trên cột sắc ký: 500 - 22 mm, 30 ml, Dovvex 50W-X8 (dạng H+) và chuẩn độ điện thế theo từng phân đoạn tách. Ser, Thr, Asp sẽ được rửa giải với HCl 0,8M với tốc độ dòng qua cột là 0,5ml/phút, sau khi HC1 0,8M đi ra khỏi cột. Thêm HCl 1M và điều chỉnh tốc độ dòng đến 25-30 giọt/phút để rửa giải Glu và Gly. Các phần dịch rửa giải ở các phân đoạn khác nhau được được cho vào các cốc thuỷ tinh và điều chỉnh pH=7 với NaOH 0,1M. Dung dịch HCHO 37% cũng được điều chỉnh về pH=7 với NaOH 0,1M. Sau đó phần mẫu thử và dung dịch HCHO được trộn với nhau theo tỷ lệ 1:9 bằng máy khuấy từ 10 phút. Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng phương pháp đo điện thế với NaOH 0,1M. Song song mẫu trắng được tiến hành bằng việc chuẩn độ tới pH = 8,9 hỗn hợp của HCHO với HCl 1M (1:9) đã được trung hòa tới pH= 7 [7] .
Từ lượng NaOH 0,1 M tiêu tốn để chuẩn độ mẫu thử và mẫu trắng tính ra được hàm lượng các axit amin bằng bảng quy đổi.
1.3.2. Phương pháp sắc ký khí
Sắc ký khí (Gas chromatography: GC) là một kỹ thuật tách và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu ở trạng thái khí, phương pháp này rất phát triển trong những năm gần đây sử dụng để phân tích định tính và định lượng các chất hữu cơ trong một hỗn hợp mẫu phức tạp.
Tác giả Y. c. Fiamegos, c. D. Stalikas đã tách và xác định được 19 axit amin trong nước tiểu, nước hoa quả và bột mì bằng phương pháp sắc ký khí với detector khối phổ (GC/MS) và detector ion hóa ngọn lửa (GC/FID). Theo phương pháp này, các axit amin tự do được chuyển thành dạng pentaflorobenzyl nhờ xúc tác chuyển pha tetrabutylamoni bromua, được dẫn xuất hóa thành dạng dễ bay hơi với pentaflorobenzyl bromid, chiết bằng diclorometan rồi phân tích bằng phương pháp GC/MS và GC/FID. Còn đối với các axit amin liên kết với protein sẽ được phân tích sau bước thủy phân bằng NaOH 5M. Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm trong khoảng 0,7 - 2,3 pM với
GC/MS và từ 1,7 - 6,9 pM với GC/FID [65].
Phương pháp sắc ký khí là một phương pháp tách rất hiệu quả và cũng đã được nhiều tác giả trên thế giới áp dụng để tách và xác định axit amin trong một số đối tượng khác nhau, nhưng để áp dụng phân tích axit amin thông dụng là rất phức tạp và giá thành cao do axit amin là hợp chất không dễ bay hơi và không tan tốt trong các dung môi hữu cơ nên quá trình thực hiện khá phức tạp và tốn dung môi. Ngoài ra khí mang là Heli là rất tốn kém nên phương pháp sắc ký khí không được áp dụng rộng rãi trong tách và xác định axit amin.
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao, hay còn gọi là điện di mao quản thế cao là một kỹ thuật tách và xác định đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo nguyên lý của sự điện di của các chất trong ống mao quản nhỏ có chứa dung dịch đệm điện di với giá trị pH nhất định và được điều khiển bởi cưòng độ điện trường E do nguồn điện thế cao một chiều V (14-30 KV) đặt vào hai đầu mao quản. Phương pháp này tách các chất là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp đặt trong điện trường, do điện tích và linh độ điện di của các chất khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [3].
M. Umrnadi, B. C. Weimer đã phát triển phương pháp điện di mao quản huỳnh quang laze (CE-LIF) để phát hiện và định lượng 17 axit amin tại nồng độ mM, các axit amin được dẫn xuất với 3-(4-carboxybenzoyl)-2- quinolin-carboxaldehyd trước khi phân tích bằng CE-LIF. Môi trường tách là hệ đệm chứa: borat 6,25 mM, SDS 150 mM, và THF 10 mM (pH = 9,66) tại 25°C, điện thế 24 kV. Độ biến động của phương pháp trong giới hạn từ 0,3 - 0,9% trong một ngày và từ 0,7 - 1,5% giữa các ngày. Các tác giả đã ứng dụng phương pháp này để theo dõi sự thay đổi nồng độ axit amin trong quá trình
chuyển hóa vi khuẩn [39].
1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại và phát triển mạnh trong những năm 80, 90. Nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh hóa, hóa học, môi trường và đặc biệt với việc phân tích các vitamin và axit amin. Những nghiên cứu tách và xác định axit amin đã có số lượng lớn các bài báo công bố với các quy trình tách và xác định axit amin.
Đây là phương pháp phổ biến nhất để xác định axit amin. Sau thủy phân các axit amin sẽ được dẫn xuất để tạo sản phẩm phát huỳnh quang. Các dẫn xuất này sẽ được tách nhờ hệ thống HPLC, được phát hiện và định lượng bằng detector huỳnh quang (RF).
Bằng phương pháp HPLC-RF, tác giả L. Bosch và cộng sự [38] đã tách và định lượng được 17 axit amin trong thức ăn trẻ em sử dụng tác nhân dẫn xuất 6- aminoquimolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamat (AQC). Tất cả các axit amin (trừ Cys và Met) được tách ra khỏi nền mẫu bằng sự thủy phân với HCl 6M trong môi trường khí trơ, ở 110°c trong 23 giờ. Quá trình dẫn xuất với AQC được thực hiện trong môi trường bazơ. Các dẫn xuất được tách trên cột Nova-Pak™, rửa giải bằng hỗn hợp đệm acetat-phosphat, acetonitril, nước theo chương trình gradient, phát hiện bằng detectơ huỳnh quang (ex = 250 nm, em = 395 nm). Khoảng tuyến tính: 0,0025 - 0,2 mM; độ chính xác của phương pháp CV: 0,2 - 3,5% ; hiệu suất dẫn xuất: 86 - 106%; hiệu suất thu hồi của phương pháp: 88,3 - 118,2%. Giới hạn phát hiện: 0,016 - 0,367 mM; giới hạn định lượng: 0,044 - 1,073 mM.
Sử dụng hai tác nhân dẫn xuất o-phthalaldehyd-3-mercaptopropionic axit (OPA) và 9-florenylmethyl cloroformat (FMOC) để dẫn xuất cho cả axit amin bậc 1 và bậc 2, tác giả D. Heems và cộng sự [22] đã tách và định lượng được 25 axit amin trong thức ăn, đồ uống. Các mẫu sau khi thủy phân axit với
HCl 6M, được bay hơi tới khô dưới chân không và hòa tan lại cặn bằng HCl 0,1M. Quá trình dẫn xuất trước cột của các mẫu lỏng được thực hiện tự động bởi thiết bị ASTED, sử dụng phản ứng kết hợp OPA/FMOC và được làm sạch bởi sự thẩm tích, rồi bơm vào hệ thống HPLC. Phổ huỳnh quang của các dẫn xuất OPA-3-MPA được ghi lại tại ex = 335 nm, em = 440 nm; còn các dẫn xuất FMOC tại ex =260 nm, em = 315 nm. Với hầu hết các axit amin, giới hạn phát hiện < 100 g/l, khoảng tuyến tính từ 0,5-100mg/l.
Bằng quá trình dẫn xuất trước cột tự động (SI) kết hợp với sắc ký lỏng (LC), C.K. Zacharis và cộng sự [21] đã xác định được 14 axit amin trong dược phẩm sử dụng chất dẫn xuất là o-phthaldialdehyd (OPA). Hệ thống SI có tác dụng lấy mẫu và hóa chất dẫn xuất, trộn và tự động đưa đến hệ thống bơm mẫu của LC. Bằng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược cho phép tách và xác định 14 axit amin trong vòng 35 phút bằng phổ huỳnh quang với ex = 340 nm, em = 455 nm. Giới hạn phát hiện dưới 30g/1 cho tất cả các axit amin, khoảng tuyến tính 0,05-10 mg/l. Hiệu suất thu hồi của phương pháp nằm trong giới hạn xác định từ 93,8-108,6%.
Phương pháp HPLC rất thích hợp để tách và xác định đồng thời nhiều chất trong các hỗn hợp khó như retinoit, carotenoit, axit amin mà trước đây các phương pháp khác gặp khó khăn. Ưu điểm nổi bật của HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất. Riêng đối với việc phân tích axit amin, phương pháp HPLC còn có một số ưu điểm mà ít có phương pháp khác có thể được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống kín, quá trình dẫn xuất có thể sử dụng dẫn xuất trước hoặc sau cột, dung môi chạy chủ yếu là đệm, quá trình thủy phân mẫu và hòa tan mẫu là các axit vô cơ không tốn kém. Chính vì những ưu điểm trên mà nhiều tác giả cho rằng phương pháp HPLC là phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axit amin.
Phương pháp cần được nghiên cứu và phát triển để ứng dụng phân tích trong mẫu thực phẩm và sinh học.
Chương 2
PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1100 series. - Cân phân tích độ chính xác 0,0001g.
- Tủ sấy.
- Hệ thống hút chân không. - Máy đo pH.
- Máy nghiền mẫu. - Máy siêu âm. - Máy đo pH Dụng cụ - Pipet: 1, 2, 5 ,10 ml; micropipet - Ống ly tâm dung tích 10, 50ml - Các bình định mức: 10, 20, 50, 100ml - Cốc có dung tích 25, 50, 250, 500, 1000 ml - Ống đong 50, 100, 200, 250 ml - Màng lọc 0,45µm 2.1.2. Hóa chất
Các loại hóa chất dùng trong phân tích đều thuộc loại tinh khiết phân tích. - Dung dịch chuẩn: hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10pmol/µl, 25pmol/µl và 100pmol/µl của hãng Merck.
- Natri acetate trihydrate NaCH3COO.3H2O (NaAc) - Dung dịch HCl đặc 37%
- Thuốc thử FMOC (9- fluorenylmethylchloroformat trong acetonitril)
- Trietylamin (TEA) C6H15N; tetrahidrofuran (THF) - Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O)
- Acetonitril và methanol dùng cho HPLC
Axit acetic 2%: Dùng pipet hút 2 ml axit acetic cho vào bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng nước cất đề ion thu được axit axetic 2%.
Natri tetraborat (Na2B4O7) 0,25M: Cân 47,75g Na2B4O7.10H2O hòa tan trong nước cất đề ion, định mức về 500 ml bằng nước cất đề ion.
Pha động A
Cân 1,36 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 500 ml H2O + 90µl triethylamine (TEA). Điều chỉnh pH về pH = 7,2 0,05 bằng axit acetic 2%. Thêm 1,5 ml tetrahydrofuran (THF).
Pha động B
Cân 1,36 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 100 ml H2O. Điều chỉnh pH về pH = 7,2 0,05 bằng axit acetic 2%. Thêm hỗn hợp gồm 200 ml acetonitril và 200 ml methanol.
- Chất tạo dẫn xuất
OPA (ortho-phthaladehyde) phản ứng với các axit amin bậc 1 trong sự có mặt của các hợp chất thiol hình thành các sản phẩm huỳnh quang. Phản ứng này được sử dụng cho việc tạo các dẫn xuất trong phân tích các axit amin bằng sắc kí trao đổi ion. Trên cơ sở điều kiện phòng thí nghiệm, để xác định các axit amin trong nấm chúng tôi tiến hành dẫn xuất trước cột các axit amin bằng dẫn xuất OPA và FMOC.
Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất tiền cột là tạo dẫn xuất của các axit amin bậc 1 với OPA, tiếp theo là tách HPLC pha ngược, sắc ký lỏng được trang bị một đầu dò fluorescence để phát hiện các dẫn xuất axit amin. Cường độ huỳnh
quang của phức OPA-axit amin được theo dõi với bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm. Dẫn xuất này có độ nhạy rất cao.
Cơ chế phản ứng như sau:
Isoindole
Theo cơ chế trên thì OPA phản ứng bước 1 có thể với cả amin bậc 1 và bậc 2 nhưng chỉ có amin bậc 1 mới cho sản phẩm là isoindol có vòng kín 5 cạnh và phát huỳnh quang. Vì vậy, với việc dẫn xuất bằng OPA không cho phép xác định axit amin bậc 2. Để xác định axit amin bậc 1 bằng OPA phải thực hiện khi có mặt của axit 3-mercapto proionic (3-MPA) ở pH=10, cơ chế:
CHO CHO + H2N-CH-COOH R + HS-CH2 -CH2 -COOH N -CH -COOH S-CH2 - CH2 - COOH R
OPA axit amin bậc 1 axit 3-mecapto propionic dẫn xuất isoindol
Không như những axit amin bậc 1 ban đầu, các dẫn xuất isoindol được tạo thành sẽ phát huỳnh quang. Bằng cách dẫn xuất các axit amin với OPA và đo ở bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm.
CH2-OCO-Cl + H2N-CH-COO- R pH=8-9 CH2-OCO-NH-CH-COO- R + HCl
FMOC-Cl axit amin
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC được vận dụng để tách xác định thành phần axit amin trong nấm. Đây là phương pháp có hiệu quả phân tích cao, độ chính xác cao cũng như có thể tự động hóa được trong trường hợp phân tích hàng loạt mẫu.
2.3. Thực nghiệm
2.3.1. Thu thập mẫu nấm
- Mẫu nấm tự nhiên được thu thập từ các rừng Quốc Gia Phù Mát và rừng Phong Nha Kẻ Bàng vào 8-2013 được PGS. TS Ngô Anh đại học Huế