Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại và phát triển mạnh trong những năm 80, 90. Nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh hóa, hóa học, môi trường và đặc biệt với việc phân tích các vitamin và axit amin. Những nghiên cứu tách và xác định axit amin đã có số lượng lớn các bài báo công bố với các quy trình tách và xác định axit amin.

Đây là phương pháp phổ biến nhất để xác định axit amin. Sau thủy phân các axit amin sẽ được dẫn xuất để tạo sản phẩm phát huỳnh quang. Các dẫn xuất này sẽ được tách nhờ hệ thống HPLC, được phát hiện và định lượng bằng detector huỳnh quang (RF).

Bằng phương pháp HPLC-RF, tác giả L. Bosch và cộng sự [38] đã tách và định lượng được 17 axit amin trong thức ăn trẻ em sử dụng tác nhân dẫn xuất 6- aminoquimolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamat (AQC). Tất cả các axit amin (trừ Cys và Met) được tách ra khỏi nền mẫu bằng sự thủy phân với HCl 6M trong môi trường khí trơ, ở 110°c trong 23 giờ. Quá trình dẫn xuất với AQC được thực hiện trong môi trường bazơ. Các dẫn xuất được tách trên cột Nova-Pak™, rửa giải bằng hỗn hợp đệm acetat-phosphat, acetonitril, nước theo chương trình gradient, phát hiện bằng detectơ huỳnh quang (ex = 250 nm, em = 395 nm). Khoảng tuyến tính: 0,0025 - 0,2 mM; độ chính xác của phương pháp CV: 0,2 - 3,5% ; hiệu suất dẫn xuất: 86 - 106%; hiệu suất thu hồi của phương pháp: 88,3 - 118,2%. Giới hạn phát hiện: 0,016 - 0,367 mM; giới hạn định lượng: 0,044 - 1,073 mM.

Sử dụng hai tác nhân dẫn xuất o-phthalaldehyd-3-mercaptopropionic axit (OPA) và 9-florenylmethyl cloroformat (FMOC) để dẫn xuất cho cả axit amin bậc 1 và bậc 2, tác giả D. Heems và cộng sự [22] đã tách và định lượng được 25 axit amin trong thức ăn, đồ uống. Các mẫu sau khi thủy phân axit với

HCl 6M, được bay hơi tới khô dưới chân không và hòa tan lại cặn bằng HCl 0,1M. Quá trình dẫn xuất trước cột của các mẫu lỏng được thực hiện tự động bởi thiết bị ASTED, sử dụng phản ứng kết hợp OPA/FMOC và được làm sạch bởi sự thẩm tích, rồi bơm vào hệ thống HPLC. Phổ huỳnh quang của các dẫn xuất OPA-3-MPA được ghi lại tại ex = 335 nm, em = 440 nm; còn các dẫn xuất FMOC tại ex =260 nm, em = 315 nm. Với hầu hết các axit amin, giới hạn phát hiện < 100 g/l, khoảng tuyến tính từ 0,5-100mg/l.

Bằng quá trình dẫn xuất trước cột tự động (SI) kết hợp với sắc ký lỏng (LC), C.K. Zacharis và cộng sự [21] đã xác định được 14 axit amin trong dược phẩm sử dụng chất dẫn xuất là o-phthaldialdehyd (OPA). Hệ thống SI có tác dụng lấy mẫu và hóa chất dẫn xuất, trộn và tự động đưa đến hệ thống bơm mẫu của LC. Bằng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược cho phép tách và xác định 14 axit amin trong vòng 35 phút bằng phổ huỳnh quang với ex = 340 nm, em = 455 nm. Giới hạn phát hiện dưới 30g/1 cho tất cả các axit amin, khoảng tuyến tính 0,05-10 mg/l. Hiệu suất thu hồi của phương pháp nằm trong giới hạn xác định từ 93,8-108,6%.

Phương pháp HPLC rất thích hợp để tách và xác định đồng thời nhiều chất trong các hỗn hợp khó như retinoit, carotenoit, axit amin mà trước đây các phương pháp khác gặp khó khăn. Ưu điểm nổi bật của HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất. Riêng đối với việc phân tích axit amin, phương pháp HPLC còn có một số ưu điểm mà ít có phương pháp khác có thể được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống kín, quá trình dẫn xuất có thể sử dụng dẫn xuất trước hoặc sau cột, dung môi chạy chủ yếu là đệm, quá trình thủy phân mẫu và hòa tan mẫu là các axit vô cơ không tốn kém. Chính vì những ưu điểm trên mà nhiều tác giả cho rằng phương pháp HPLC là phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axit amin.

Phương pháp cần được nghiên cứu và phát triển để ứng dụng phân tích trong mẫu thực phẩm và sinh học.

Chương 2

PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.1.1. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1100 series. - Cân phân tích độ chính xác 0,0001g.

- Tủ sấy.

- Hệ thống hút chân không. - Máy đo pH.

- Máy nghiền mẫu. - Máy siêu âm. - Máy đo pH Dụng cụ - Pipet: 1, 2, 5 ,10 ml; micropipet - Ống ly tâm dung tích 10, 50ml - Các bình định mức: 10, 20, 50, 100ml - Cốc có dung tích 25, 50, 250, 500, 1000 ml - Ống đong 50, 100, 200, 250 ml - Màng lọc 0,45µm 2.1.2. Hóa chất

Các loại hóa chất dùng trong phân tích đều thuộc loại tinh khiết phân tích. - Dung dịch chuẩn: hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10pmol/µl, 25pmol/µl và 100pmol/µl của hãng Merck.

- Natri acetate trihydrate NaCH3COO.3H2O (NaAc) - Dung dịch HCl đặc 37%

- Thuốc thử FMOC (9- fluorenylmethylchloroformat trong acetonitril)

- Trietylamin (TEA) C6H15N; tetrahidrofuran (THF) - Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O)

- Acetonitril và methanol dùng cho HPLC

 Axit acetic 2%: Dùng pipet hút 2 ml axit acetic cho vào bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng nước cất đề ion thu được axit axetic 2%.

 Natri tetraborat (Na2B4O7) 0,25M: Cân 47,75g Na2B4O7.10H2O hòa tan trong nước cất đề ion, định mức về 500 ml bằng nước cất đề ion.

 Pha động A

 Cân 1,36  0,025 g NaCH3COO.3H2O + 500 ml H2O + 90µl triethylamine (TEA). Điều chỉnh pH về pH = 7,2  0,05 bằng axit acetic 2%. Thêm 1,5 ml tetrahydrofuran (THF).

 Pha động B

 Cân 1,36  0,025 g NaCH3COO.3H2O + 100 ml H2O. Điều chỉnh pH về pH = 7,2  0,05 bằng axit acetic 2%. Thêm hỗn hợp gồm 200 ml acetonitril và 200 ml methanol.

- Chất tạo dẫn xuất

OPA (ortho-phthaladehyde) phản ứng với các axit amin bậc 1 trong sự có mặt của các hợp chất thiol hình thành các sản phẩm huỳnh quang. Phản ứng này được sử dụng cho việc tạo các dẫn xuất trong phân tích các axit amin bằng sắc kí trao đổi ion. Trên cơ sở điều kiện phòng thí nghiệm, để xác định các axit amin trong nấm chúng tôi tiến hành dẫn xuất trước cột các axit amin bằng dẫn xuất OPA và FMOC.

Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất tiền cột là tạo dẫn xuất của các axit amin bậc 1 với OPA, tiếp theo là tách HPLC pha ngược, sắc ký lỏng được trang bị một đầu dò fluorescence để phát hiện các dẫn xuất axit amin. Cường độ huỳnh

quang của phức OPA-axit amin được theo dõi với bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm. Dẫn xuất này có độ nhạy rất cao.

Cơ chế phản ứng như sau:

Isoindole

Theo cơ chế trên thì OPA phản ứng bước 1 có thể với cả amin bậc 1 và bậc 2 nhưng chỉ có amin bậc 1 mới cho sản phẩm là isoindol có vòng kín 5 cạnh và phát huỳnh quang. Vì vậy, với việc dẫn xuất bằng OPA không cho phép xác định axit amin bậc 2. Để xác định axit amin bậc 1 bằng OPA phải thực hiện khi có mặt của axit 3-mercapto proionic (3-MPA) ở pH=10, cơ chế:

CHO CHO + H2N-CH-COOH R + HS-CH2 -CH2 -COOH N -CH -COOH S-CH2 - CH2 - COOH R

OPA axit amin bậc 1 axit 3-mecapto propionic dẫn xuất isoindol

Không như những axit amin bậc 1 ban đầu, các dẫn xuất isoindol được tạo thành sẽ phát huỳnh quang. Bằng cách dẫn xuất các axit amin với OPA và đo ở bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm.

CH2-OCO-Cl + H2N-CH-COO- R pH=8-9 CH2-OCO-NH-CH-COO- R + HCl

FMOC-Cl axit amin

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC được vận dụng để tách xác định thành phần axit amin trong nấm. Đây là phương pháp có hiệu quả phân tích cao, độ chính xác cao cũng như có thể tự động hóa được trong trường hợp phân tích hàng loạt mẫu.

2.3. Thực nghiệm

2.3.1. Thu thập mẫu nấm

- Mẫu nấm tự nhiên được thu thập từ các rừng Quốc Gia Phù Mát và rừng Phong Nha Kẻ Bàng vào 8-2013 được PGS. TS Ngô Anh đại học Huế định danh, sau khi đưa về phòng thí nghiệm được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó bảo quản trong tủ lạnh.

- Mẫu nấm nuôi cấy: mẫu sau khi thu thập được phân lập và nuôi cấy tại phòng thí nghiệm vi sinh - Trung tâm thực hành thí nghiệm - Trường Đại học Vinh.

Mẫu nấm tự nhiên:

- Mẫu nấm 03 - Amauroderma niger

- Mẫu nấm 04 - Ganoderma lucidum

- Mẫu nấm 05 - Ganoderma pfleifferi

Mẫu nấm nuôi cấy:

- Mẫu nấm lỗ - Hexagonia apiaria

- Mẫu nấm 01 - Ganoderma lucidum

- Mẫu nấm 02 - Amauroderma niger

- Mẫu nấm 608 - Ganoderma sessile

- Mẫu nấm 619 - Ganoderma spongium

- Mẫu nấm 621 - Ganoderma microporus

- Mẫu nấm HKG 401 - Ganoderma pfleifferi

- Mẫu nấm HKG 406 - Amauroderma schmburgki

Hình 2.1: Mẫu nấm 03 Hình 2.2: Mẫu nấm 04 Hình 2.3: Mẫu nấm 05

Hình 2.7: Mẫu nấm 608 Hình 2.8: Mẫu nấm 619 Hình 2.9: Mẫu nấm 621

Hình 2.10: Mẫu nấm HKG 401 Hình 2.11: Mẫu nấm HKG 406

2.3.2. Xử lí mẫu

2.3.2.1. Đối với quy trình phân tích axit amin thủy phân

Chuẩn bị mẫu nấm đã được đồng nhất, xay nhỏ cho vào lọ đựng.

Cân chính xác 1g nấm bằng cân phân tích chính xác 0,0001 cho vào ống chịu nhiệt. Cho 3 ml dung dịch HCl 6M vào ống đựng mẫu lắc đều và làm hòa tan mẫu bằng cách đặt ống vào máy siêu âm trong vòng 10 phút, loại bỏ không khí trong vòng 15 phút. Thủy phân mẫu bằng cách cho vào tủ sấy và đặt nhiệt độ tủ sấy ở 1250C trong 24h. Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy để nguội, điều chỉnh về pH = 56 bằng Na2B4O7 0,25M. Lọc qua giấy lọc thường và định mức vào bình 50ml với nước cất đề ion. Điều chỉnh về pH = 910 bằng

Na2B4O7 0,25M. Lọc qua màng lọc 0,45µm, cho mẫu vào vial tiến hành chạy trên máy HPLC.

Quá trình chẩn bị mẫu được tóm tắt bằng sơ đồ sau:

Hình 2.12: Quy trình phân tích axit amin thủy phân

Cân 1g mẫu

Ống nghiệm 3ml HCl 6M

Đánh siêu âm mẫu 10 phút

Loại bỏ không khí bằng máy hút chân không Thủy phân mẫu ở nhiệt độ 1250C và thời gian 24h

tợp

Để nguội, mở ống nghiệm, điều chỉnh về pH = 5 – 6 bằng Na2B4O7 0,25M

Định mức vào bình 50ml Lọc qua giấy lọc

Điều chỉnh về pH =9 ÷10 bằng Na2B4O7 0,25M

Chạy mẫu trên hệ thống HPLC

Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy

2.3.2.2. Đối với quy trình phân tích axit amin tự do

Chuẩn bị mẫu nấm đã được đồng nhất, xay nhỏ cho vào lọ đựng.

Cân chính xác 1g nấm bằng cân phân tích chính xác 0,0001. Cho vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần. Sau đó tiến hành siêu âm trong 15 phút, cho vào ống ly tâm dung tích 10ml, tiến hành li tâm trong 30 phút với tốc độ 5000 vòng/phút. Lọc mẫu qua giấy lọc, chỉnh về pH = 910 bằng Na2B4O7 0,25M. Lọc qua màng lọc 0,45µm cho mẫu vào vial tiến hành chạy trên máy HPLC.

Tóm tắt quá trình chuẩn bị và xử lí mẫu bằng sơ đồ sau:

Hình 2.13: Quy trình phân tích axit amin tự do

Cân 1g mẫu

Cho vào bình định mức 10ml và định mức tới vạch Siêu âm 15 phút

Cho vào ống li tâm và tiến hành li tâm trong 30 phút với tốc độ 5000 vòng/phút vòng/phút

Lọc mẫu

Chỉnh pH=9-10 bằng Na2B4O7 0,25M Lọc qua màng lọc 0,45 μm Chạy mẫu trên hệ thống HPLC

2.3.3. Tiến hành phân tích trên máy

 Cột sắc ký: cột C18 150  4,6mm, kích thước hạt 5μm.

 Nhiệt độ cột: 400C.

 Tốc độ dòng: 0,45ml/phút.

 Pha động: Pha động A: hỗn hợp dung môi nước và tetrahydrofuran; Pha động B: hỗn hợp dung môi nước, axetonitril và methanol theo gradient:

TT Time (min) A % B % Flow (ml/min)

1 0 100 0 0,45 2 18 0 100 0,45 3 18,1 0 100 0,45 4 18,5 0 100 0,8 5 23,9 0 100 0,8 6 24 0 100 0,45 7 25 100 0 0,45

- Chương trình bơm mẫu:

TT Chương trình

1 Hút 5 μl từ vial 10 - Đệm borate 2 Hút 1 μl từ vial 11 - Dẫn suất OPA 3 Hút 0 μl từ vial 12 - Nước 4 Hút 1 μl từ vial chứa mẫu 5 Hút 0 μl từ vial 11 - Nước 6 Trộn mẫu 7 Hút 1 μl từ vial 14 – FMOC 8 Hút 0 μl từ vial 12 - Nước 9 Trộn mẫu 10 Bơm mẫu

- Huỳnh quang bước sóng kích thích  = 340nm, bước sóng phát xạ  = 450 nm [28].

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu xử lý mẫu tối ưu

3.1.1. Khảo sát nồng độ HCl

Để chọn nồng độ axit HCl phù hợp cho sự thủy phân mẫu chúng tôi khảo sát một dãy mẫu thực (mẫu nấm 01) cùng với chuẩn axit amin 10pmol được thêm vào và thủy phân trong môi trường HCl ở các nồng độ: 5M; 5,5M; 6M; 6,5M. Ở nhiệt độ thủy phân 1250C trong thời gian 24h. Kết quả thực nghiệm cho thấy nồng độ HCl ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất thủy phân. Khi nồng độ HCl thấp, mẫu thủy phân không hoàn toàn, hiệu suất thấp, còn khi nồng độ HCl đủ lớn mẫu thủy phân hoàn toàn.

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi

TT Nồng độ HCl (M) Axit amin Nồng độ (pmol) Cs+mẫu - Cmẫu Cos (pmol) H% Cs+mẫu Cmẫu 1 5 Asp 63,699 52,284 11,415 10 114,15 5,5 Asp 27,502 19,744 7,758 10 77,58 6 Asp 39,465 29,741 9,724 10 97,24 6,5 Asp 40,729 31,057 9,672 10 96,72 2 5 Ser 28,940 24,229 4,712 10 47,12 5,5 Ser 17,966 11,135 6,831 10 68,31 6 Ser 27,432 17,864 9,568 10 95,68 6,5 Ser 25,794 16,387 9,407 10 94,07 3 5 Gly 66,221 54,316 11,905 10 119,05 5,5 Gly 37,371 28,154 9,217 10 92,17 6 Gly 49,686 39,943 9,743 10 97,43 6,5 Gly 49,356 39,574 9,782 10 97,82 4 5 Arg 101,279 94,478 6,801 10 68,01 5,5 Arg 18,831 12,892 5,939 10 59,39 6 Arg 29,931 21,072 9,543 10 95,43 6,5 Arg 29,668 20,541 9,126 10 91,26

Trong đó: Cos là nồng độ chuẩn thêm vào (pmol) Cs+mẫu là nồng độ mẫu thêm chuẩn (pmol)

Cmẫu là nồng độ mẫu phân tích (pmol)

Hình 3.1: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl

Từ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi các axit amin vào nồng độ HCl thủy phân cho thấy khi nồng độ HCl chưa đủ để thủy phân mẫu thì các axit amin chưa tách khỏi nhau dẫn đến hiệu suất thu hồi của một số axit amin lớn hơn 100% (do lẫn tạp chất và các pic khác chưa tách). Còn các axit amin đã tách được thì hiệu suất thu hồi cũng thấp có thể do lẫn tạp chất hoặc chưa tách được hoàn toàn. Từ nồng độ 6-6,5M thì hiệu suất thu hồi ổn định và các hiệu suất thu được đều lớn hơn 90%. Từ kết quả này chúng tôi chọn nồng độ axit HCl 6M làm môi trường thủy phân mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.2: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 5M

Hình 3.3: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 5,5M

Hình 3.4: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 6M