3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.3.2. Kết quả phân tích hàm lượng axit amin tự do
Mẫu nghiên cứu gồm 8 loại mẫu nấm được tiến hành phân tích theo lược đồ quy trình phân tích tại mục 2.3.2.2. Kết quả phân tích cụ thể hàm lượng các axit amin trong 1g mẫu nấm lỗ được chỉ ra ở các bảng 3.11 và sắc đồ hình 3.42.
Bảng 3.11: Hàm lượng axit amin tự do trong mẫu nấm lỗ TT Axit amin Diện tích Hàm lượng trong mẫu phân tích (μg/ml) Hàm lượng trong mẫu nấm (μg/g) 1 Thr 1,12021x 104 14,86960 148,70 2 Val KPH KPH KPH 3 Met 2984,53589 4,12373 41,24 4 Ile 1,71013x 104 25,46835 254,68 5 Leu KPH KPH KPH 6 Phe 1696,33459 2,64661 26,47 7 Lys 3722,83276 16,79515 167,95 8 His KPH KPH KPH
Tổng axit amin thiết yếu 639,04
9 Asp KPH KPH KPH 10 Glu 5491,36914 12,25883 122,59 11 Ser 2473,07471 2,83271 28,33 12 Gly KPH KPH KPH 13 Cys-SS- Cys 3248,15186 11,51328 115,13 14 Ala 2115,60400 2,14129 21,41 15 Arg 2510,76147 4,29585 42,96 16 Tyr 900,38782 1,68213 16,82 17 Pro 1301,58557 2,80958 28,10
Tổng axit amin không thiết yếu 375,31
Tổng 1014,35
Hình 3.42: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm lỗ
Hàm lượng các mẫu nấm 01, 02, 619, HKG 401, HKG 406, 621 được tính toán tương tự, kết quả được chỉ ra ở bảng 3.12 và các sắc đồ từ hình 3.43 đến 3.48.
Hình 3.44: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 02
Hình 3.45: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 619
Hình 3.47: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm HKG 401
Bảng 3.12: Hàm lượng axit amin tự do trong các mẫu nấm (μg/g) TT amin Axit Nấm 01 Nấm 02 Nấm 619 Nấm 621 Nấm HKG 401 Nấm HKG 406 1 Thr 136,36 80,25 205,95 7,22 128,72 207,22 2 Val KPH 11,49 KPH 0,09 KPH 3,65 3 Met 56,06 0,57 52,72 6,60 6,69 35,57 4 Ile 71,19 62,43 211,49 13,93 195,95 127,56 5 Leu 15,26 KPH KPH 3,13 KPH 3,00 6 Phe 10,06 KPH 20,82 15,48 11,30 23,30 7 Lys 113,82 84,46 205,40 95,10 173,95 121,09 8 His 7,87 KPH 20,19 KPH 12,84 29,03 Tổng axit amin thiết yếu 410,62 239,20 716,57 141,55 529,45 550,42 9 Asp KPH KPH KPH KPH KPH KPH 10 Glu 77,14 53,72 110,27 9,43 126,57 144,07 11 Ser 1,82 4,75 6,19 13,23 9,83 9,03 12 Gly KPH KPH KPH KPH KPH KPH 13 Cys- SS- Cys 81,36 28,03 143,12 11,54 172,57 12,37 14 Ala 10,91 8,52 14,17 1,47 22,93 31,96 15 Arg 16,63 KPH 24,87 11,54 39,95 36,71 16 Tyr 265,18 140,33 337,96 33,23 285,73 221,41 17 Pro 49,54 53,92 280,45 17,76 320,25 112,18 Tổng axit amin không thiết yếu 502,58 289,27 917,03 98,20 977,83 567,73 Tổng 913,20 528,47 1633,60 239,75 1507,28 1118,15 EAA/TAA 44,96% 45,26% 43,86% 59,04% 35,13% 49,23%
Kết quả ở bảng 3.11 và 3.12 cho thấy, trong các loại nấm nghiên cứu thì nấm 619 có tổng hàm lượng các axit amin tự do cao nhất (1633,60 μg/g), sau đó là nấm HKG 401 (1507,28 μg/g) và thấp nhất là nấm 621 (239,75 μg/g). Khi so sánh với loài nấm tự nhiên C. gigantean (ở bảng 2.2 mục 1.2.5) (có tổng hàm lượng axit amin tự do = 199,65mg/100g = 1996,5 (μg/g)) là cao hơn so với các loài nấm nuối cấy này.
Các axit amin thiết yếu như lysin, isoleucin, threonin, tyrosin có hàm lượng khá cao. Trong nấm HKG 406 có đầy đủ các axit amin thiết yếu. Tỉ lệ EAA/TAA trong nấm lỗ là cao nhất (63,00%) và thấp nhất là trong nấm HKG 401 (35,13%), như vậy tỉ lệ hàm lượng axit amin thiết yếu trong các nấm nghiên cứu là cao.
Hàm lượng axit aspartic và glycin trong cả 7 loại nấm; histidin trong nấm lỗ, nấm 02 và nấm 621; valin trong nấm lỗ, nấm 01, nấm 619 và nấm HKG 401; leucin trong nấm lỗ, nấm 02, nấm 619 và HKG 401 là quá nhỏ nên không định lượng được.
So sánh bảng 3.8, 3.9 với bảng 3.11, 3.12 cho thấy trong từng loại nấm thì tổng hàm lượng axit amin thủy phân là lớn hơn nhiều so với axit amin tự do.
KẾT LUẬN
Trên cơ sở các nhiệm vụ được đặt ra và các kết quả đã đạt được chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã khảo sát tối ưu hóa một số điều kiện trong quy trình thủy phân xử lý mẫu xác định hàm lượng axit amin trong nấm:
+ Thời gian thủy phân mẫu tối ưu là 24h + Nồng độ HCl thủy phân tối ưu là 6M
2. Đã xây dựng được các phương trình đường chuẩn của 17 axit amin và xác định được khoảng nồng độ nghiên cứu nằm trong khoảng tuyến tính.
3. Xác định được giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ của phương pháp là rất nhỏ: LOD từ 0,016 - 0,042 pmol, LOQ từ 0,053 - 0,14 pmol.
4. Quy trình phân tích đưa ra đã được đánh giá bằng đường chuẩn, độ lặp lại, độ thu hồi. Độ lặp lại của phương pháp tốt với độ lệch chuẩn tương đối từ 0,9 - 4,6%. Độ thu hồi với các loại axit amin nằm trong khoảng 85,6 - 102,7% trong vùng đường chuẩn tuyến tính.
5. Xác định được hàm lượng axit amin thủy phân và axit amin tự do trong: + Tám mẫu nấm nuôi cấy Hexagonia apiaria (thủy phân là 4094,05 và tự do là 1014,35 μg/g); Ganoderma lucidum (thủy phân 1457,33 và tự do 913,20 μg/g); Amauroderma niger (thủy phân 1247,91 và tự do 528,47 μg/g);
Ganoderma spongium (thủy phân 3176,06 và tự do 1633,60 μg/g);
Ganoderma microporus (thủy phân 667,51 và tự do 239,75 μg/g); Ganoderma pfleifferi (thủy phân 1249,01 và tự do 1507,28 μg/g); Amauroderma schmburgki (thủy phân 4806,30 và tự do 1118,15 μg/g); Ganoderma sessile
+ Ba mẫu nấm tự nhiên: Amauroderma niger (thủy phân 11862,79 μg/g); Ganoderma lucidum (thủy phân 4595,52 μg/g); Ganoderma pfleifferi
(thủy phân 12805,11μg/g).
Từ các kết quả thu được chúng tôi thấy phương pháp phân tích hàm lượng axit amin trong các mẫu nấm có độ tin cậy cao và đề nghị được áp dụng phương pháp phân tích axit amin này cho nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau.
Chúng tôi mong muốn được tiếp tục nghiên cứu để hoàn chỉnh và mở rộng trong những đề tài khác, tiếp tục đánh giá các kết quả để có thể so sánh được hàm lượng axit amin trong những loài nấm khác nhau từ đó đánh giá được giá trị của các loài nấm và bổ sung số liệu vào bảng thành phần thực phẩm Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Trung thuần, Phạm Thị Thu, (2002), Bách khoa dinh dưỡng, Nhà xuất bản Phụ Nữ-Hà Nội, trang 28-52.
2. Phạm Luận (1987), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Khoa Hóa học, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội.
3. Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao, Khoa Hóa học - Trường ĐHKHTN, Hà Nội.
4. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận (1978), Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật-Hà Nội, trang 128- 183.
5. Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam tập I, Nhà xuất bản khoa học Tự nhiên và Công nghệ.
6. Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Tam Bảo (2008), Thành phần loài nấm dược liệu của Việt Nam, Tạp chí di truyền học và ứng dụng – chuyên san công nghệ sinh học, 4, 39-42.
Tiếng Anh
7. AOAC Official Method (2000), Monosodium Glutamate in food,
Potentiometric Titration Method, C. 970.37.
8. Bailey J.L. (1962), Estimation of amino acids by ninhydrin,
Techniques in Protein Chemistry, Elsevier, Amsterdam, pp 73-81. 9. Bano Z., Rajarathnam S. (1988), Pleurotus mushroom, CRC Crit Rev
Food Sci Nutr, 27, 87–158.
10. Bano Z., Rajathnam S. (1982), Tropical Mushroom Biological Nature and Cultivation Methods, Chinese University Press, Hong Kong, 363-380, 1982.
11. Barros L., Baptista P., Correira D. M., Casa, S., Oliveira, B., & Ferreira, I. C. F. R. (2007a), Fatty acid and sugar compositions, and nutritional value of five wild edible mushrooms from Northeast Portugal, Food Chem., 105, 140–145.
12. Barros L., Cruz T., Baptista P., Estevinho L.M., Ferreira I.C.F.R. (2008), Food Chem. Toxicol., 46, 2742–7.
13. Barros L., Venturini B. A., Baptista P., Estevinho L. M., & Ferreira, I. C. F. R. (2008), Chemical composition and biological properties of Portuguese wild mushrooms: A comprehensive study, J. Agric. Food Chem., 56(10) 3856-62.
14. Bauer-Petrovska, B. (2001), Protein fractions in edible Macedonian mushrooms. Eur. Food Res. Technol., 212, 469–472.
15. Belitz H.D., & Grosch W. (1999), Food Chem., Berlin: Springer. 16. Cavalieri C., Bolzoni L., & Bandini M. (2010), Nicotine
determination in mushrooms by LC-MS/MS with preliminary studies on the impact of drying on nicotine formation. Learning, Media and Technology, 27, 473.
17. Chang S.T. (1980), Mushroom as human food, Bioscience, 30, 399- 401.
18. Chen S.Y., Ho K.J., Hsieh Y.J., Wang L.T., & Mau J.L. (2012), Contents of lovastatin, c-aminobutyric acid and ergothioneine in mushroom fruiting bodies and mycelia, LWT-Food Science and Technology, 47, 274–278.
19. Colak A., Faiz Z., & Sesli E. (2009), Nutritional composition of some wild edible mushrooms, Turkish Journal of Biochemistry, 34, 25–31. 20. Colak A., Kolcuoglu Y., Sesli E., & Dalman O. (2007), Biochemical
21. Constantinos K. Z., Georgios A. T., Anastasios N. V. (2005), Coupling of sequential injection with liquid chromatography for the automated derivatization and on-line determination of amino acids,
Talanta, 68, 448-458.
22. Dany H., Genevieve L., Christophe F., Eric V. (1988), Full automated precolumn derivatization, on-line dialysis and highperformance liquid chromatographic analysis of amino acids in food, beverages and feedstuff, Journal of chromatography A, 798, 9- 17.
23. Díez A. A., & Alvarez A. (2001), Compositional and nutritional studies on two wild edible mushrooms from northwest Spain, Food Chem., 75, 417-422.
24. Diplock A.T., Aggett P.J., Ashwell M., Bornet F., Fern E.B., Roberfroid M.B. (1999), Br. J. Nutr., 81 S1–S27.
25. Eva G., Ana G. L., Miguel L., Matilde D., Mauricio A. R., Ana V., José A. M. (2010), Edible mushrooms: Role in the prevention of cardiovascular diseases, Fitoterapia, 81, 715-723.
26. Falandysz J. (2008), J. Environ. Sci. Health C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol Rev.; 26,256–99.
27. FAO (Food and Agriculture Organization) (1991), Protein Quality Evaluation, Rome: Food and Agricultural Organization of the United Nations.
28. Gratzfeld-Huesgen A (1999), Sensitive and Reliable Amino Acid Analysis in Protein Hydrolysates using the Agilent 1100 Series HPLC, Technical Note, Agilent Technologies Publication Number 5968-5658E.
Characteristics, analysis and production, Sciences des Aliments, 9, 427–454.
30. Guo Y. J., Deng G. F., Xu X. R., Wu S., Li S., Xia E. Q., et al. (2012), Antioxidant capacities, phenolic compounds and polysaccharide contents of 49 edible macro-fungi, Food & Function, 3, 1195–1205.
31. Hayes W.A., Haddad N. (1976), The foof value of the cultivated mushroom and its importance to the mushroom industry, Mushroom J., 40, 104-110.
32. Ibrahim K., Seyda K., Mansur H., (2014), Free amino acid profiling in the giant puffball mushroom (Calvatia gigantea) using UPLC– MS/MS, Food Chem., 158, 88-92.
33. Kim M. Y., Chung L. M., Lee S. J., Ahn J. K., Kim E. H., Kim, M. J., et al. (2009), Comparison of free amino acid, carbohydrates concentrations in Korean edible and medicinal mushrooms, Food Chem., 113, 386–393.
34. Kwang J. L., In J. Y., Kyung H. K., Sang H. L,, Hun J. H., Won S. E., Jin H. J. (2011), Amino acid and fatty acid compositions of Agrocybe chaxingu, an edible mushroom, J. Food Comp. Anal.
24, 175–178.
35. Li G. S. F., Chang S.T. (1982), Tropical Mushroom Biological Nature and Cultivation Methods, Chinese University Press, Hong Kong, 199-219.
36. Liu P., Li H. M., & Tang Y. J. (2012), Comparison of free amino acids and 5’ -nucleotides between Tuber fermentation mycelia and natural fruiting bodies, Food Chem., 132, 1413–1419.
Chemical composition of five wild edible mushrooms collected fromsouthwest China and their antihyperglycemic and antioxidant activity, Food Chemi. Toxicol. 50, 1238–1244.
38. Lourdes B., Amparo A., Rosaura F. (2006), Application of the 6- aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RP-HPLC determination of amino acids in infant foods, J. Chromatog. B, 831, P. 176-183.
39. M. Ummadi, B. C.Weiner (2002), Use of capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence for attomole detection of amino acids,
J. Chromatog. A, 964, 243-253.
40. Mantovani M.S., Bellini M.F., Angeli J.P.F., Oliveira R.J., Silva A.F., Ribeiro L.R.(2008), Mutat .Res., 658:154–61.
41. Manzi P., Grambelli L., Marconi S., Vivanti V., Pizzoferrato L. (1999), Food Chem., 65, 477–82.
42. Manzi P., Marconi P., Aguzzi A., & Pizzoferrato L. (2004), Commercial mushrooms: Nutritional quality and effect of cooking,
Food Chem, 84, 201–206.
43. Marekov L., Momchilova S., Grung B., Nikolova D. B. (2012), Fatty acid composition of wild mushroom species of order Agaricales— Examination by gas chromatography–mass, J. Chromatog. B, Volume 910, 54-60.
44. Mattilda P, Könkö K, Eurola M, Pihlava JM, Astola J, Vahteristo L, et al.( 2001), Contents of vitamins, mineral elements, and some phenolic compounds in cultivated mushrooms, J. Agric. Food Chem., 49, 2343–8.
45. Molnar-Per (2000), Role of chromatography in the analysis of sugars, carboxylic acids and amino acids in food, Journal of chromatography
A, 891, 1-32.
46. Moore S., Stein W.H., (1948), Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids, J. Biol. Chem., 176, 367-388. 47. Moore S., Stein W.H., (1951), Determination amino acid by post-
columm derivatization, J.Biol. Chem. 192, 663.
48. Moore S., Stein W.H., (1954), A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds, J. Biol. Chem., 211, 907-913.
49. Nathalie L. F., Bernard S. (2007), Biological roles of tryptophan and its metabolism: Potential implications for pig feeding, Livestock Science, 112(1-2) 23–32.
50. Nedelcheva D., Antonova D., Tsvetkova S., Marekov I., Momchilova, S., Nikolova D., B., et al. (2007). TLC and GC–MS probes into the fatty acid composition of some Lycoperdaceae mushrooms. J. Liquid Chromatogr. & Related Tech., 30, 2717–2727. 51. Pavel K. (2009), Chemical composition and nutritional value of
European species of wild growing mushrooms, Food Chem., 113, 9- 16.
52. Rai M., Tidke G., & Wasser S. P. (2005), Therapeutic potential of mushrooms, Nat. Prod. Rad., 246–257.
53. Satoshi M. (2014), Current topics in the biotechnological production of essential amino acids, functional amino acids, and dipeptides, Curr. Opinion Biotech., 26, 38–44.
54. Shu-ting Chang and Philip G.Miles (1930), Mushroom culvation, nutritional value, medicinal effect, and environmental impact, 2nd ed. 55. Sun C., Lin J.,Wan Y. P., Liu Y., & Xu H. K. (2012), Amino acids contents of common wild edible mushrooms in Yunnan province,
Plant Diversity and Resources, 34, 89–92.
56. Sun S.W., Lin Y. C., Weng Y.M., Chen M. J. (2006), Effciency improvement on ninhydrin method for amino acids quantification, J. Food Analys., 19, 112-117.
57. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, USDA Nutrient Data Laboratory (2009), USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 22. www.ars.usda.gov/nutrientdata.
58. University of Maryland Medical Center (2009). "Lysine", Retrieved 59. Vaz J. A., Barros L., Martins A., Santos B. C., Vasconcelos M. H., & Vasconcelos I. C. F. R. (2011), Chemical composition of wild edible mushrooms and antioxidant properties of their water soluble polysaccharidic and ethanolic fractions, Food Chemistry, 126, 610– 616.
60. Vetter J. (2000), Trypsin inhibitor activity of basidiomycetous mushrooms, European Food Research and Technology, 211, 346– 348.
61. Wang X. M., Zhang Z., Wu L., H., Zhao Y. L., Li T., Li Z. Q., Wang Y. Z., Liu H. G. (2014), A mini-review of chemical composition and nutritional value of edible wild-grown mushroom from China, Food Chemistry, 151, 279–285.
62. Whittaker R. H. (1969), New concepts of kingdoms of organisms,
Science, 163, 150–160.
63. Wu G. (2009), Amino acids: metabolism, functions, and nutrition,
Amino Acids, 37, 1-17.
64. Yaru S., Ming S.W., Zhao S.L., Hou D.Y., Liu Y.M. (2005), Enantiomeric separation of amino acids derivatized with 7-fluoro-4-
nitrobenzoxadiazole by capillary liquid chromatographyltandem mass spectrometry, J. Chromatog. A, 1091, 102-109.
65. Yiannis C. F., Constantine D. S. (2006), Gas chromatographic determination of amino acids via one-step phase-transfer catalytic pentafluorobenzylation-preconcentration, J. Chromatog., 1110(1-2) 66-72.
66. Yin J. Z., & Zhou L. X. (2008), Analysis of nutritional components of 4 kinds of wild edible fungi in Yunnan, Food Research and Development, 29, 133–136.