Chất chống oxi hóa là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏ tác dụngđộc hại của các gốc tựdo một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Chất chống oxi hóa có thểtrực tiếp phảnứng với các gốc tựdo hoạtđộngđểtạo ra những gốc tựdo mới kém hoạt động hơn, từ đó có thể ngăn cản chuỗi phản ứng dây chuyền được khơi mào bởi các gốc tự do.
Chất chống oxi hóa cũng có thểgián tiếp tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp trong phảnứng Fenton hoặc ức chếcác enzymee xúc tác cho các quá trình sinh ra gốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong cơ thể. Có nhiều cách phân loại chất chống oxi hóa dựa trên nguổn gốc, cấu trúc của chất chống oxi hóa, cụ thể ta có thể chia ra các nhóm chất chống oxi hóa dựa vào nguồn gốc của chúng như sau:
Hợp chất chống oxy hóa tự nhiên là những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa có nguồn gốc từ tự nhiên.
hóa nội sinh như: vitamin A, C, D, E, K, acid uric, bilirubin, carnozin, và ubiquinol, các acic amin như cysteine, metionin, tyrozin, tryptophan, lyzin; peptit như glutation,… cũng là hợp chất chống oxy hóa. Còn có một số hợp chất được lấy từ các cây gia vị khác như:
- Tocopherol:
Có trong nhiều loại cây thực vật. Trong tự nhiên, người ta đã tìm thấy bốn dạng đồng phân: α – tocopherol ( có hoạt động như vitamin E), β, γ và δ – tocopherol. Chức năng hoạt động của tocopherol cũng giống như BHA và BHT tức là sự két hợp với những gốc tự do, nhưng có điểm khác là chúng bềnở nhiệt độ cao và khó bay hơi. Hỗn hợp của hợp chất tocopherol và peptit cũng là những chất đồng tác dụng chống oxy hóa trong mỡvà dầu.
- Acid ascorbic ( vitamin C):
Là chất chống oxy hóa bền trong hệ nước. Nếu như được kết hợp với dung dịch prropylenglycol thì tính chống oxy hóa của nó sẽ được tăng lên rất nhiều. Một số chất khác như acid citic, EDTA, phospholipid và hợp chất amino acid cũng làm tăng khả năng chống oxy hóa của chất chống oxy hóa tự nhiên.
- Carotenoit:
Trong thực phẩm, bên cạnh chức năng tạo màu, các hợp chất caroten có khả năng ức chế những phản ứng làm giảm giá trị thực phẩm trong quá trình bảo quản, đặc biệt là sự ức chế phản ứng oxy hóa lipit. Một trong những chất đó là vitamin A, nhưng không phải tất cả các hợp chất carotene đều có khả năng đó. Các hợp chất carotene thuộc nhóm chất chống oxy hóa có khả năng loại gốc tự do. Có thể giải thích rằng β – carotene đã loại gốc peroxit bằng cách tạo ra sản phẩm cộng giữa β – carotene và gốc peroxit. Các hợp chất carotene chỉtạo sản phẩm cộng là những gốc caroten bền chứ không cho đi một nguyên tử H như những hợp chất phenol. Trong
thực phẩm, dưới một số điều kiện các hợp chất caroten hoạt động như những chất chống oxy hóa, điều đó phụ thuộc vào nồng độ của chúng, sự cân bằng động giữa tiền oxy hóa và chống oxy hóa là vô cùng nhạy cảm.
- Flavonoid:
Là một nhóm hợp chất mang màu lớn của thực vật và được hấp thụ thường xuyên qua thức ăn. Nhờ có cấu trúc polyphenol nên nhóm này có tính chống oxy hóa tốt bởi nó có thể khử các gốc tự do và liên kết với các ion kim loại. Các flavonoid có nhóm cacbonylởvịtrí C4và nhóm hydroxylở vịtrí C3hoặc C5đều dễtạo phức với kim loại.
Flavonoid có hai nhóm hydroxyl ở vị trí C3và C4 cũng tạo phức với kim loại. Các kim loại có thể là Al, Zn, Cr, Cu,…đây là những kim loại làm khơi mào quá trình oxy hóa trong thực phẩm.
Hiện nay, người ta đang tập trung nghiên cứu để lấy các hợp chất chống oxy hóa có trong các cây thực vật như cây chè, cây ớt, cây sả, cây trầu không, cây tỏi, cây hành, cây nghệ,…
Việc sử dụng các chất chống oxy hóa trong tự nhiên có một số ưu điểm như: Không độc, dễkiếm (vì có sẵn trong tựnhiên), giá thành rẻ và đặc biệt là được người tiêu dùng tin cậy,…những ưu điểm này thường không có trong chất chống oxy hóa tổng hợp.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Vỏhành tây
Vỏ hành tây sử dụng cho việc nghiên cứu là lớp vỏ ngoài đã khô, có màu vàng, không bịthối. Không sửdụng vỏhành tây non, có màu trắng. Vỏ hành tây được thu mua ở khu vực chợ Vĩnh Hải (Nha Trang), sau khi mang về được rửa sạch bằng nước và mang đi chiết lấy dịch.
2.1.2. Thịt gà
Thịt gà được mua tạixưởng giết mổ ở chợ Vĩnh Hải ( Nha Trang), tỉnh Khánh Hòa , thịt gàđược bảo quản lạnh trong thùng xốp và vận chuyển ngay vềphòng vềphòng thí nghiệm của Trường Ðại học Nha Trang đểtiến hành quá trình nghiên cứu.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và các thiết bị đo đạc
Trong quá trình nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết vỏhành tây vàứng dụng hạn chếsựoxi hóa chất béo thịt gà bảo quản lạnh” thì đã sử dụng một sốhóa chất, dụng cụvà thiết bịthí nghiệm sau:
Hóa chất:
Chloroform (CHCl3), Acid Acetic (CH3COOH), Acid Thiobarbituric (TBA), Trichloro Acetic Acid (TCA), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Kali iodua ( KI), Natri thiosunfat ( Na2S2O3), Hồ tinh bột.
Dụng cụ:
– Bình tam giác 500 ml, 250 ml, 100 ml, 50ml – Cốc thủy tinh 500 ml, 250 ml, 100 ml
– Micropippett 5 ml, 1 ml, 100 µl – Ống đong 100 ml, 10 ml
– Ống nghiệm thủy tinh,ống nghiệm nhựa PA Thiết bị đođạc:
– Máy do quang phổUV –VIS (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). – Máy vortex
– Bể ổn nhiệt (Elma, S 300H, Elmasonic, Germany).
– Máy đồng hóa mẫu (IKA, T18B, Ultra –Turax, Germany)
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình thu dịch chiết từ vỏ hành tây
Quy trình thu dịch chiết từ vỏ hành tây được xây dựng dựa trên quy trình chiết các chất có hoạt tính sinh học từ vỏ hành tây theo nghiên cứu của tác giả Freddy A. Ramos và cộng sự (2006). Tuy nhiên, quy trìnhđề xuất có một số cải biến phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và thực tế Việt Nam. Cụ thể sơ đồ quy trình được bố trí theo hình 2.1:
Rửa sạch Ngâm (240ml) nước Gia nhiệt Lọc Dịch đã lọc Dịch lọc thô
Hình 2.1 Sơ đồbốtrí thí nghiệm chuẩn bịdịch chiết vỏhành tây
Vỏhành khô (24g) Vỏhành khô (12g) Vỏhành khô (36g) Nước Nước cất Làm nhỏ 800C 12h Dịch hỗn hợp Giấy lọc Bã
Thuyết minh quy trình:
Với mục đích sửdụng dịch chiết trong chế biến thực phẩm, đảm bảo an toàn và chi phí thấp nên nước cất được sử dụng làm dung môi chiết với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20, 1:10, 1:7 (w/v) với lần lượt 12, 24, 36 g vỏhành tây/240 ml nước cất.
Hành tây thu mua về, lột vỏ khô ở ngoài, cân lấy 12 gam, 24 gam và 36 gam.
Rửa sạch vỏ hành tây đem rửa sạch để loại bỏ tạp chất và một số vi sinh vật bám
trên bề mặt vỏ.
Làm nhỏ: Sau khi rửa sạch, ta xay nhỏ mẫu để dịch chiết thu được cao nhất.
Gia nhiệt mẫu trong bể ổn nhiệt ở 800C trong 12 giờ
Lọc sơ bộ: sau khi gia nhiệt xong, tiến hành lọc sơ bộvới mục đích loại bỏphần bã của vỏhành.
Dịch đã lọc: dịch sau khi loại bỏ hết bã và tạp chất ta thu được dịch đã lọc.
Hình 2.4 Gia nhiệt mẫu trong bể ổn nhiệt
2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết vỏ hành tây để hạn chế sự oxyhóa lipid thịt gà bảo quản lạnh hóa lipid thịt gà bảo quản lạnh
Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu: Nguyên liệu được mua tại xưởng giết mổ thịt gà chợ Vĩnh Hải ( Nha Trang) được bảo quản lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm Trường Ðại
Thịt gà
Xử lý ngâm trong dịch chiết vỏhành tây
Ngâm trong nước Ngâm trong dịch chiết 10 phút
Ngâm trong dịch chiết 20 phút
Bảo quản lạnh
0 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày
Hình 2.6 Bốtrí thí nghiệm hạn chếsựoxi hóa lipid thịt gà bảo quản lạnh
Theo dõi sự oxy hóa lipid
Nguyên liệu đảm bảo chất lượng cho quá trình nghiên cứu: thịt gà tươi, có mùi tanh tự nhiên, cơ thịt không dập nát, biến dạng và không có dấu hiệu của sự hư hỏng.
Xử lý: Nguyên liệu được rửa bằng nước sạch để loại bỏtạp chất, nhớt và một
phần vi sinh vật trên nguyên liệu. Nguyên liệu được cân khối lượng, do chiều dàiđể
xác định các thông sốphục vụcho quá trình nghiên cứu.
Chặt khúc: Dụng cụ chuyên dụng đểchặt khúc là: dao, thớt, thau, rổ…được rửa sạch và để ráo.
Thịt gà nguyên liệu được đặt trên thớt, tay trái giữchặt lấy miếng thịt gà còn tay phải cầm dao để chặt khúc theo đúng yêu cầu kỹthuật để đảm bảo chất lượng của thịt gà.
Miếng thịt gà được cắt thành từng miếng nhỏdài khoảng 3– 5cm. Sau khi đã xửlý xong nguyên liệu và dịch chiết thì tiến hành ngâm nguyên liệu trong dịch chiết trong các khoảng thời gian khác nhau.
Nguyên liệu được chia làm 3 phần bằng nhau và lấy ngẫu nhiên và ngâm trong dịch chiết vỏ hành tây đãđược chuẩn bị trước đó.
Phần 1: ngâm trong dung dịch nuớc trong vòng 10 phút
Phần 2: ngâm trong dịch chiết vỏhành tây trong thời gian 10 phút Phần 3: ngâm trong dịch chiết vỏhành tây trong thời gian 20 phút
Trong quá trình ngâm phải đảm bảo nguyên liệu luôn luôn được ngập trong dung dịch chiết và đúng thời gian quy định. Sau đó vớt miếng thịt gà ra để ráo nước và tiến hành bao gói bằng túi PE hàn kín miệng rồi mang đi bảo quản lạnhở50C. Trong quá trình bảo quản ta lần lượt lấy các mẫu theo trình tựtừ ngày 0, 1, 3, 5, 7 đem đi xác định các chỉtiêu: chỉsốperoxyt (PoV), TBARS.
2.4.Phương pháp phân tích
- Nguyên lý : Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong nguyên liệu. Cân lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy khô. Từ đó tính ra phần trăm (%) nước có trong nguyên liệu.
- Tiến hành xác định: Lấy cốc cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt đ ộ 1050C đến trọng lượng không đổi, sau đó để trong bình hút ẩm để làm nguội và cân phân tích. Sau đó, cho vào cốc khoảng m (g) mẫu đã chuẩn bị sẵn cân trên cân phân tích với độ chính xác 10-4 cho tất cả vào tủ sấy ở nhiệt độ 105-1100C đến khối lượng không đổi khoảng 6h. Sau 6h, lấy ra để nguội trong bình hútẩm khoảng 30 phút rồi đem cân trên cân phân tích. Từ đó xác định độ ẩm. - Tính kết quả: = –– × 100(%) Trong đó: W1: Trọng lượng cốc (g) W2: Trọng lượng cốc + mẫu (g)
W3: Trọng lượng cốc + mẫu sau khi sấy (g)
2.4.2. Xác định khả năng khửgốc tựdo DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl)
a, Nguyên lý.
Khả năng khửgốc tự do DPPH của dịch chiết được xácđịnh theo phương pháp của
Fu et al.(2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thụtại 517 nm. Các chất có hoạt tính chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độhấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phảnứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
-Nước cất/Ethanol.
c, Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH.
- B1: Hòa tan mẫu thử ở các nồng độ khác nhau . Lấy 30 µl, 50 µl, 70 µl, 90 µl, 110µl mẫu thử ở các nồng độ khác nhau cho vàoống nghiệm 10 ml.Đồng thời chuẩn bị thêm 1ống nghiệm có chứa 3 ml nước cất (mẫu trắng).
- B2: Bổ sung thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,1 mM ( pha trong ethanol 99,5%) vào cácống nghiệm . Lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút.
- B3: So màu trên máy UV-Visở bước sóng 517 nm.
- B4: Tính toán khả năng khử gốc tự do DPPH bằng công thức. I = 100 × (ACT- ASP)/ACT (%).
từ đó tìm rađược thông số IC50của mẫu thử..
Trong đó:
+ ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết. + ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu thử.
* Chú ý:
+ Mỗi nồng độ (của mẫu thử) được thực hiện 3 lần, lấy giá trị trung bình. + Trong trường hợp mẫu thử có hoạt tính khử mạnh sẽ được thử tiếp ở nồng độ khácđể tìm ra giá trị IC50của mẫu thử.
+ IC50 (Inhibition Concentration): Là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có khả năng ức chế 50% gốc tự do. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50càng thấp.
2.4.3. Xácđịnh chỉ số peroxit
a, Nguyên lý
Chỉ số peroxit (PoV) là lượng chất có trong mẫu thử được tính bằng mili
đương lượng (miliequivalent) của oxi hoạt tính làm oxi hóa KI trên 1kg mẫu dưới
các điều kiện thao tác đãđư ợc qui định.
Chỉ số này phản ánh sự ôi hóa của dầu mỡ. Hiện tượng ôi hóa dầu mỡ hình thành chủ yếu oxi trong không khí kết hợp vào nối đôi ở trong phân tử acid béo không no tạo thành peroxit . Hiện tượng này được thể hiện qua phương trình:
Nguyên tắc : xác định chỉsốPoV dựa trên cơ sởcác peroxit của chất béo (tạo ra trong quá trình ôi của chất béo) trong môi trường a xít có khả năng phảnứng với KI giải phóng iod theo phảnứng sau:
RRrr
Iod tạo thành được định phân bằng dung dịch natrithiosunfat với chỉthịhồtinh bột
Dựa vào lượng Natrithiosunfat tiêu tốn khi chuẩn độ lượng iod được giải phóng ta xác định được chỉ sốperoxit .
Chú ý tiến hành thí nghiệm trong môi trường trung tính hoặc a xít yếu. Nếu tiến hành trong môi trường a xít mạnh hoặc kiềm dễ xảy ra phảnứng oxi hóa của iod với oxi không khí gây sai sốlớn.
2Na2S2O3 + I2 2NaI + Na2S4O6 O-O । । R-C=C-R’ + O2 R-C-C-R’ । । । । H H O-O 0 R1-CH-CH-R2
R1-CH-CH-R2 + 2KI + 2CH3COOH O + CH3COOK + H2O + I2 O - O
- Cân chính xác 1,5g mẫu thử vào erlen nút nhám 250ml. - Thêm vào 10ml clorofom.
- Lắc nhanh, mạnh.
- Thêm tiếp 15ml a xít acetic.
- Thêm vào 2ml dung dịch KI bão hòa.Đậy nắp.
- Lắc hỗn hợp cẩn thận trong 1 phút, để yên trong bóng tối 10 phút. - Thêm 25ml nước cất.
- Cho 2-3 giọt chỉ thị hồ tinh bột ( đun nóng).
- Chuẩn độ bằng dung dịchNa2S2O30.01N cho tới khi mất màu hoàn toàn. c, Tính kết quả
Chỉsốperoxit được tính theo công thức sau: PoV = ((Vth- Vtr) × N × 1000)/m
Trong đó :
PoV: chỉsốperoxyt (meq/kg).
Vth: sốmL Na2S2O30.01N dùng để định phân mẫu thực. Vtr : sốmL Na2S2O30.01N dùng để định phân mẫu trắng. m : khối lượng mẫu thí nghiệm (g)
1000: hệsố qui đổi theo 1kg chất béo . N : nồng độdung dịch Na2S2O3
2.4.4. Xác định khả năng oxy hóa chất béo bằng sử dụng TBARS(Thiobarbituric Acid Reactive Substances). (Thiobarbituric Acid Reactive Substances).
Các chất phảnứng với TBA được xác định theo phương pháp của Lemon (1975) với một sự hiệu chỉnh nhỏ.Trong quá trình chế biến và bảo quản (đối động vật và thực vật chứa nhiều a xítbéo, đặc biệt là các a xít béo chưa bão hòa cao) chất béo thường bị oxi hóa. Quá trình oxi hóa chất béo này tạo thành các sản phẩm bậc hai (là chất phản ứng) như malondialdehyde (MAD) và 4-hydroxynonenal (4-HNE). Sử dụng acid thiobarbituric là chất phảnứng (TBARS) với MAD (tạo màu hồng), so màu trên máy UV-Vis (bước sóng 532 nm) từ đó tính được hàm lượng MAD hình thành. b, Hóa chất
- A xít Thiobarbituric (TBA). - Trichloro Acetic a xít (TCA).
- 1, 1, 3, 3-tetra methoxy propane (TMP). c, Xác định khả năng oxy hóa chất béo.
