3.3.1.1. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch nấm và vi khuẩn của mẫu chồi Lan Kim Tuyến.
- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:
+ Mẫu cấy là các đoạn thân, sau khi lấy mẫu về đem vào rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bọt, tiếp tục tráng lại 3-4 lần bằng nước cất.
+ Khử trùng mẫu: Mẫu sau khi được làm sạch bụi bẩn, cắt bỏ phần thừa tiến hành khử trùng sơ bộ bằng cồn 700 và tráng lại bằng nước cất nhiều lần cho sạch cồn và bụi bẩn trong box cấy. Tiến hành khử trùng bằng các hóa chất khử trùng
+ Sử dụng đoạn thân Lan Kim Tuyến đã khử trùng cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn.
+ Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 22 - 250C, cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux, ẩm độ: 60 - 65%, quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu 20 ngày (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 1.: Nghiên cứu nhằm xác định loại hóa chất khử trùng phù hợp nhất cho vật liệu nuôi cấy.
Vật liệu vào mẫu: thân non Môi trường nuôi mẫu: MS Thao tác tiến hành vào mẫu
Bước 1: Mẫu được xử lý bên ngoài bằng dung dịch xà phòng loãng và được rửa sạch dưới vòi nước chảy.
Bước 2: Mẫu được đưa vào trong box cấy và khử trùng sơ bộ mẫu bằng cồn trong 1 phút sau. Sau đó được xử lývới các công thức thí nghiệm trong 5 phút.
Bước 3: Sau khi xử lý mẫu được tráng sạch bằng nước cất khử trùng, sử dụng panh, dao cắt những đoạn thân non, bánh tẻ có kích thước 2 cm đưa vào môi trường nuôi cấy.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình 1 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự biến đổi hình thái, mầu sắc của mẫu cấy. Chất khử trùng:
+ CT1 nước cất khử trùng + CT2 NaClO 1%
+ CT3 H2O210% + CT4 Cồn 70 %
Chỉ tiêu quan sát: Số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu chết.
Hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp nhất ở thí nghiệm 1 (Kí hiệu là A) dược sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
Thí nghiệm 2 Nghiên cứu thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl20,1% kết hợp với A đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình 1 mẫu.
+ CT1 A+HgCl20,1% trong (0 phút) + CT2 A+HgCl20,1% trong (5 phút) + CT3 A+HgCl20,1% trong (10 phút) + CT4 A+HgCl20,1% trong (15 phút)
Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự biến đổi hình thái, mầu sắc của mẫu cấy. Chỉ tiêu quan sát: Số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu chết.
3.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
- Phương pháp nhân nhanh in vitro:
+ Sử dụng dao (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) tách chồi đã tái sinh từđoạn thân.
+ Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5-1cm, dùng pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường đã được chuẩn bị trước.
+ Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi. Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng (BA,GA3,TDZ) đến khả năng nhân nhanh Lan Kim Tuyến
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu. Công thức Nồng độ Kinetin (mg/l) 1 (Đ/C) MT nền 2 MT nền + BA 3 MT nền + GA3 4 MT nền + TDZ
Chú ý:
MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
Chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim
Tuyến xác định ở thí nghiệm 3 (ký hiệu B) được sử dụng cho các thí nghiệm
tiếp theo.
Thí nghiêm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của B kết hợp với nồng độ Auxin (IAA) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu. Công thức Nồng độ Auxin (mg/l) 1 (Đ/C) MT nền + B + 0,0 2 MT nền + B + 0,1 3 MT nền + B + 0,3 4 MT nền + B + 0,5 5 MT nền + B + 1,0
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100 mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
3.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ tự nhiên (nước dừa) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
- Phương pháp nghiên cứu:
+ Để tăng hệ số nhân và bảo đảm chất lượng chồi ta sử dụng các dịch nước dừa. Sau đó tìm ra công thức tối ưu nhất trong quá trình nhân nhanh chồi.
Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của B kết hợp với hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh của Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.
Công thức Hàm lượng nước dừa mg/l
CT1 Nền + B + 0,0 mg/l CT2 Nền + B + 50 mg/l CT3 Nền + B + 100 mg/l CT4 Nền + B + 150 mg/l
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
3.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng (bóng tối, 1000 lux, 2000 lux) tới khả năng ra rễ của Lan Kim Tuyến
+ Sau khi cấy vào môi trường nhân nhanh, rễ hình thành và phát triển. Lựa chọn chồi Lan Kim Tuyến có từ 2-3 lá chuyển sang môi trường ra rễ. Môi trường ra rễ dựa trên môi trường MS có bổ sung các nồng độ NAA và nồng độ IAA khác nhau để kích thích tạo rễ bất định, hình thành cây con hoàn chỉnh. Sử dụng cường độ ánh sáng khác nhau, bố trí thí nghiệm tìm ra cường độ ánh sáng thích hợp nhất cho khả năng ra rễ.
Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 3 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.
+ CT1 (bóng tối) + CT2 (l000 lux) + CT3 (2000 lux)
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Tỷ lệ cây sống, tỷ lệ cây chết. Chất lượng rễ:
+ Rễ tốt: Rễ khoẻ, dài.
+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn + Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn.
