Năm 2007, Khoa Nông lâm thuộc trường ĐH Đà Lạt đã nhân giống thành công bằng biện pháp nuôi cấy mô gần 30 loài lan đặc hữu của VQG Cát Tiên trong đó có nhiều loài lan quý như: Kim Tuyến, Vân Hài, A rích, Kim hài…
Năm 2008, Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Sinh học thực nghiệm (Viện Ứng dụng công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ) đã thành công bước đầu trong việc nhân nhanh loài Lan Kim Tuyến bằng phương pháp giâm hom.
Phùng Văn Phê và cs (2009) [4], đã đưa ra kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và phân bố của loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus ở vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc. Về hình thái, Lan Kim Tuyến là cây thân cỏ, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước mang 2-6 lá mọc cách. Thân khí sinh và thân rễ thường nhẵn, không phủ lông, màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ. Hoa tự chùm mọc ở đầu ngọn thân, trục hoa dài từ 10-20 cm,
thường phủ lông màu nâu đỏ, mang từ 4-10 hoa. Mùa hoa nở tháng 10-12. Mùa quả chín tháng 12-3 năm sau. Về phân bố, Lan Kim Tuyến tập trung ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh, nơi đất giàu mùn, độẩm và độ xốp cao, thoáng khí. Có thể gặp Lan Kim Tuyến ở ven các khe suối, dưới tán rừng hoặc dưới rừng sát nơi ẩm ướt. Tại Vườn quốc gia Tam Đảo, Lan Kim Tuyến được phát hiện có khu phân bố và số lượng đang bị suy giảm rất nghiêm trọng.
Phùng Văn Phê và cs (2010) [14], đã chứng minh rằng thể chồi loài Lan Kim Tuyến - Anoectochilus roxborghii 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud bổ sung BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l + ND 100mg/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + sucrose 20g/l + agar 7g/l + AC 0,5g/l.
Nguyễn Thị Thảo và cs, (2011). Đặc điểm phân bố của loài Lan Kim Tuyến tơ (ANOECTOCHILUSSETACEAE Blume) Tại khu bảo tồn thiên nhiên CÔPIA, Thuận Châu, Sơn La đã nghiên cứu điều tra được thành phần loài tại khu vực nghiên cứu đa dang và phong phú biến động từ 16-18 loài.
Nguyễn Quang Thạch và cs (2012) [15], đã nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh in vitro loài Lan Kim Tuyến - Anoectochilus setaceus. Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knud + BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + αNAA 0,3mg/l + sucrose 20g/l + than hoạt tính 0,5g/l + agar 7g/l cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu. Các chồi có chiều cao từ 3-4cm được sử dụng để ra rễ in vitro. Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 1mg/l αNAA.
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu đề tài là cây Lan Kim Tuyến được phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH - CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thu thập từ các tỉnh Lào Cai, Vĩnh Phúc và trồng thử nghiệm tại vườn lan khoa CNSH - CNTP
Nguồn mẫu bình giống tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH - CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng, khả năng nhân nhanh và ra rễ Lan Kim Tuyến bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
+ Địa diểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH - CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
+ Thời gian từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014 3.2. Hóa chất và thiết bị 3.2.1. Hóa chất - Hóa chất khử trùng (NaClO 1%, HgCl2 , Cồn 70 %, H2O2 10%). - Môi trường MS cơ bản. - Saccharose. - Agar. -Than hoạt tính.
- Các chất kích thích sinh trưởng: BA, TDZ, GA3, IAA.
3.2.2. Thiết bị
- Cân điện tử (Olhous - Vietlabcu) - Nồi hấp khử trùng (ALP)
- Tủ sấy (Memmert)
- Máy chuẩn pH (Hanna HI2210)
- Ngoài ra còn có các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm của Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Điều kiện nuôi cấy
- Nhiệt độ phòng cấy: 25 ± 2oC
- Cường độ chiếu sáng: 2000 ÷ 3000 lux - Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày
- Độẩm phòng nuôi: 60% - 70%
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.
3.3.1. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch nấm và vi khuẩn của mẫu chồi Lan Kim Tuyến.
- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng (bóng tối, 1000lux, 2000lux) tới khả năng ra rễ của Lan Kim Tuyến.
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1.1. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch nấm và vi khuẩn của mẫu chồi Lan Kim Tuyến.
- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:
+ Mẫu cấy là các đoạn thân, sau khi lấy mẫu về đem vào rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bọt, tiếp tục tráng lại 3-4 lần bằng nước cất.
+ Khử trùng mẫu: Mẫu sau khi được làm sạch bụi bẩn, cắt bỏ phần thừa tiến hành khử trùng sơ bộ bằng cồn 700 và tráng lại bằng nước cất nhiều lần cho sạch cồn và bụi bẩn trong box cấy. Tiến hành khử trùng bằng các hóa chất khử trùng
+ Sử dụng đoạn thân Lan Kim Tuyến đã khử trùng cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn.
+ Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 22 - 250C, cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux, ẩm độ: 60 - 65%, quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu 20 ngày (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 1.: Nghiên cứu nhằm xác định loại hóa chất khử trùng phù hợp nhất cho vật liệu nuôi cấy.
Vật liệu vào mẫu: thân non Môi trường nuôi mẫu: MS Thao tác tiến hành vào mẫu
Bước 1: Mẫu được xử lý bên ngoài bằng dung dịch xà phòng loãng và được rửa sạch dưới vòi nước chảy.
Bước 2: Mẫu được đưa vào trong box cấy và khử trùng sơ bộ mẫu bằng cồn trong 1 phút sau. Sau đó được xử lývới các công thức thí nghiệm trong 5 phút.
Bước 3: Sau khi xử lý mẫu được tráng sạch bằng nước cất khử trùng, sử dụng panh, dao cắt những đoạn thân non, bánh tẻ có kích thước 2 cm đưa vào môi trường nuôi cấy.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình 1 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự biến đổi hình thái, mầu sắc của mẫu cấy. Chất khử trùng:
+ CT1 nước cất khử trùng + CT2 NaClO 1%
+ CT3 H2O210% + CT4 Cồn 70 %
Chỉ tiêu quan sát: Số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu chết.
Hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp nhất ở thí nghiệm 1 (Kí hiệu là A) dược sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
Thí nghiệm 2 Nghiên cứu thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl20,1% kết hợp với A đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình 1 mẫu.
+ CT1 A+HgCl20,1% trong (0 phút) + CT2 A+HgCl20,1% trong (5 phút) + CT3 A+HgCl20,1% trong (10 phút) + CT4 A+HgCl20,1% trong (15 phút)
Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự biến đổi hình thái, mầu sắc của mẫu cấy. Chỉ tiêu quan sát: Số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu chết.
3.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
- Phương pháp nhân nhanh in vitro:
+ Sử dụng dao (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) tách chồi đã tái sinh từđoạn thân.
+ Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5-1cm, dùng pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường đã được chuẩn bị trước.
+ Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi. Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng (BA,GA3,TDZ) đến khả năng nhân nhanh Lan Kim Tuyến
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu. Công thức Nồng độ Kinetin (mg/l) 1 (Đ/C) MT nền 2 MT nền + BA 3 MT nền + GA3 4 MT nền + TDZ
Chú ý:
MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
Chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến xác định ở thí nghiệm 3 (ký hiệu B) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiêm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của B kết hợp với nồng độ Auxin (IAA) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu. Công thức Nồng độ Auxin (mg/l) 1 (Đ/C) MT nền + B + 0,0 2 MT nền + B + 0,1 3 MT nền + B + 0,3 4 MT nền + B + 0,5 5 MT nền + B + 1,0
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100 mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
3.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ tự nhiên (nước dừa) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
- Phương pháp nghiên cứu:
+ Để tăng hệ số nhân và bảo đảm chất lượng chồi ta sử dụng các dịch nước dừa. Sau đó tìm ra công thức tối ưu nhất trong quá trình nhân nhanh chồi.
Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của B kết hợp với hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh của Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.
Công thức Hàm lượng nước dừa mg/l
CT1 Nền + B + 0,0 mg/l CT2 Nền + B + 50 mg/l CT3 Nền + B + 100 mg/l CT4 Nền + B + 150 mg/l
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
3.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng (bóng tối, 1000 lux, 2000 lux) tới khả năng ra rễ của Lan Kim Tuyến
+ Sau khi cấy vào môi trường nhân nhanh, rễ hình thành và phát triển. Lựa chọn chồi Lan Kim Tuyến có từ 2-3 lá chuyển sang môi trường ra rễ. Môi trường ra rễ dựa trên môi trường MS có bổ sung các nồng độ NAA và nồng độ IAA khác nhau để kích thích tạo rễ bất định, hình thành cây con hoàn chỉnh. Sử dụng cường độ ánh sáng khác nhau, bố trí thí nghiệm tìm ra cường độ ánh sáng thích hợp nhất cho khả năng ra rễ.
Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 3 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.
+ CT1 (bóng tối) + CT2 (l000 lux) + CT3 (2000 lux)
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Tỷ lệ cây sống, tỷ lệ cây chết. Chất lượng rễ:
+ Rễ tốt: Rễ khoẻ, dài.
+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn + Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn.
3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi đánh giá
- Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (mẫu nhiễm):
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm (mẫu)
x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
- Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (mẫu sống):
Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Tỷ lệ mẫu chết: Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Tỷ lệ tái sinh:
Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = Tổng số mẫu tái sinh (mẫu)
x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Hệ số nhân: Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi (chồi) Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Chất lượng chồi bật: + Chồi tốt: Chồi khoẻ, xanh. + Chồi trung bình: Chồi khỏe, xanh nhạt + Chồi kém: Chồi yếu, xanh nhạt. - Số rễ trung bình/cây: Chất lượng rễ: + Rễ tốt: Rễ khoẻ, dài. + Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn + Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn. - Tỷ lệ cây sống:
Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống (cây)
x 100% Tổng số cây ban đầu (cây)
Tỷ lệ cây chết:
Tỷ lệ cây chết (%) = Tổng số cây chết (cây)
x 100% Tổng số cây ban đầu (cây)
Chất lượng cây con (tình trạng, màu sắc)
- Thu thập và xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê toán học Microsoft Excel 2003 và phần mềm IRISTAT 5.0
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả ảnh hưởng một số chất khử trùng tới tỉ lệ sống của mẫu chồi Lan Kim Tuyến Lan Kim Tuyến
Khử trùng mẫu là giai đoạn đầu tiên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, mẫu cấy được lấy từ bên ngoài tự nhiên nên dễ bị nhiễm các loại như: nấm, vi khuẩn, virus… Do đó ngay ở giai đoạn này các mẫu cần phải đạt tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu tái sinh cao… Phương pháp khử trùng mẫu cấy thường được áp dụng hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt khuẩn do tính chất dễ thao tác, đòi hỏi thiết bịđơn giản và hiệu quả cao. Các chất hóa học thường được sử dụng như: Ca(OCl)2, HgCl2, H2O2... Sử dụng chất nào, nồng độ cao hay thấp, thời gian dài hay ngắn hoàn toàn phụ thuộc vào đặc điểm và tình trạng mẫu. Với đặc điểm Lan Kim Tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân khí sinh mọng nước nên việc khử trùng tương đối khó. Vì vậy, trong đề tài này tôi sử dụng thân khí sinh là vật liệu để khử trùng. Chất khử trùng được sử dụng là NaClO 1% và H2O2 10%, Cồn 70%, HgCl2. Đây là những loại hóa chất dễ tìm, rẻ tiền, dễ sử dụng và ít gây độc cho người thao tác.
4.1.1 Nghiên cứu nhằm xác định loại hóa chất khử trùng phù hợp nhất cho vật liệu nuôi cấy cho vật liệu nuôi cấy
Bảng 4.1.: Kết quả ảnh hưởng của một số hóa chất diệt nấm, vi khuẩn đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn mẫu chồi Lan Kim Tuyến
(sau 10 ngày nuôi cấy) Công thức Chất khử trùng Tổng số mẫu/CT (mẫu) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu sống không nhiễm (%) Biểu hiện mẫu CT1 (ĐC) Nước cất vô trùng 45 100 0 0,0 Bị nấm, khuẩn. Nhiễm nấm trên bề mặt, trong môi trường CT2 NaClO 1% 45 51,1 0 49,9 Xanh CT3 H2O2 10% 45 68,8 0 32,2 Trắng xanh CT4 Cồn 70% 45 88,9 0 11,1 Thâm đen CV% 4,8 LSD.05 4,9
Chú thích: Các CT trong thí nghiệm bố trí theo bảng trên sử dụng hóa chất khử
trùng thay đổi lần lượt từ CT1 đến CT4 hóa chất cho tỉ lệ mẫu sống không nhiễm