Đối tượng nghiên cứu đề tài là cây Lan Kim Tuyến được phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH - CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thu thập từ các tỉnh Lào Cai, Vĩnh Phúc và trồng thử nghiệm tại vườn lan khoa CNSH - CNTP
Nguồn mẫu bình giống tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH - CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng, khả năng nhân nhanh và ra rễ Lan Kim Tuyến bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
+ Địa diểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa CNSH - CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
+ Thời gian từ tháng 12/2013 đến tháng 5/2014 3.2. Hóa chất và thiết bị 3.2.1. Hóa chất - Hóa chất khử trùng (NaClO 1%, HgCl2 , Cồn 70 %, H2O2 10%). - Môi trường MS cơ bản. - Saccharose. - Agar. -Than hoạt tính.
- Các chất kích thích sinh trưởng: BA, TDZ, GA3, IAA.
3.2.2. Thiết bị
- Cân điện tử (Olhous - Vietlabcu) - Nồi hấp khử trùng (ALP)
- Tủ sấy (Memmert)
- Máy chuẩn pH (Hanna HI2210)
- Ngoài ra còn có các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm của Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Điều kiện nuôi cấy
- Nhiệt độ phòng cấy: 25 ± 2oC
- Cường độ chiếu sáng: 2000 ÷ 3000 lux - Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày
- Độẩm phòng nuôi: 60% - 70%
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.
3.3.1. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch nấm và vi khuẩn của mẫu chồi Lan Kim Tuyến.
- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng (bóng tối, 1000lux, 2000lux) tới khả năng ra rễ của Lan Kim Tuyến.
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1.1. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch nấm và vi khuẩn của mẫu chồi Lan Kim Tuyến.
- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:
+ Mẫu cấy là các đoạn thân, sau khi lấy mẫu về đem vào rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bọt, tiếp tục tráng lại 3-4 lần bằng nước cất.
+ Khử trùng mẫu: Mẫu sau khi được làm sạch bụi bẩn, cắt bỏ phần thừa tiến hành khử trùng sơ bộ bằng cồn 700 và tráng lại bằng nước cất nhiều lần cho sạch cồn và bụi bẩn trong box cấy. Tiến hành khử trùng bằng các hóa chất khử trùng
+ Sử dụng đoạn thân Lan Kim Tuyến đã khử trùng cấy vào môi trường đã được chuẩn bị sẵn.
+ Sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi với điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng từ 22 - 250C, cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux, ẩm độ: 60 - 65%, quang chu kì 16h sáng/8h tối. Tiến hành theo dõi mẫu 20 ngày (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 1.: Nghiên cứu nhằm xác định loại hóa chất khử trùng phù hợp nhất cho vật liệu nuôi cấy.
Vật liệu vào mẫu: thân non Môi trường nuôi mẫu: MS Thao tác tiến hành vào mẫu
Bước 1: Mẫu được xử lý bên ngoài bằng dung dịch xà phòng loãng và được rửa sạch dưới vòi nước chảy.
Bước 2: Mẫu được đưa vào trong box cấy và khử trùng sơ bộ mẫu bằng cồn trong 1 phút sau. Sau đó được xử lývới các công thức thí nghiệm trong 5 phút.
Bước 3: Sau khi xử lý mẫu được tráng sạch bằng nước cất khử trùng, sử dụng panh, dao cắt những đoạn thân non, bánh tẻ có kích thước 2 cm đưa vào môi trường nuôi cấy.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình 1 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự biến đổi hình thái, mầu sắc của mẫu cấy. Chất khử trùng:
+ CT1 nước cất khử trùng + CT2 NaClO 1%
+ CT3 H2O210% + CT4 Cồn 70 %
Chỉ tiêu quan sát: Số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu chết.
Hóa chất và thời gian khử trùng thích hợp nhất ở thí nghiệm 1 (Kí hiệu là A) dược sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
Thí nghiệm 2 Nghiên cứu thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl20,1% kết hợp với A đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 15 bình, mỗi bình 1 mẫu.
+ CT1 A+HgCl20,1% trong (0 phút) + CT2 A+HgCl20,1% trong (5 phút) + CT3 A+HgCl20,1% trong (10 phút) + CT4 A+HgCl20,1% trong (15 phút)
Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự biến đổi hình thái, mầu sắc của mẫu cấy. Chỉ tiêu quan sát: Số mẫu nhiễm, số mẫu sống, số mẫu chết.
3.3.1.2. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
- Phương pháp nhân nhanh in vitro:
+ Sử dụng dao (lưỡi dao số 11 đã được khử trùng) tách chồi đã tái sinh từđoạn thân.
+ Sử dụng chồi sạch bệnh, sinh trưởng tốt có chiều dài từ 0,5-1cm, dùng pank đã được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội rồi gắp chồi đưa vào môi trường đã được chuẩn bị trước.
+ Cấy chồi trên bề mặt môi trường với mật độ đồng đều, sau khi cấy xong đưa vào phòng nuôi. Sau đó tiến hành theo dõi số chồi và chất lượng chồi (quan sát bằng mắt thường).
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng (BA,GA3,TDZ) đến khả năng nhân nhanh Lan Kim Tuyến
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu. Công thức Nồng độ Kinetin (mg/l) 1 (Đ/C) MT nền 2 MT nền + BA 3 MT nền + GA3 4 MT nền + TDZ
Chú ý:
MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
Chất kích thích sinh trưởng thích hợp cho nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến xác định ở thí nghiệm 3 (ký hiệu B) được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiêm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của B kết hợp với nồng độ Auxin (IAA) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu. Công thức Nồng độ Auxin (mg/l) 1 (Đ/C) MT nền + B + 0,0 2 MT nền + B + 0,1 3 MT nền + B + 0,3 4 MT nền + B + 0,5 5 MT nền + B + 1,0
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100 mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
3.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ tự nhiên (nước dừa) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
- Phương pháp nghiên cứu:
+ Để tăng hệ số nhân và bảo đảm chất lượng chồi ta sử dụng các dịch nước dừa. Sau đó tìm ra công thức tối ưu nhất trong quá trình nhân nhanh chồi.
Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của B kết hợp với hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh của Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 4 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.
Công thức Hàm lượng nước dừa mg/l
CT1 Nền + B + 0,0 mg/l CT2 Nền + B + 50 mg/l CT3 Nền + B + 100 mg/l CT4 Nền + B + 150 mg/l
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Hệ số nhân, chất lượng chồi.
Chú ý: MT nền = MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin) + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 6g/l, pH = 5,6-5,8.
3.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu ứng với nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng (bóng tối, 1000 lux, 2000 lux) tới khả năng ra rễ của Lan Kim Tuyến
+ Sau khi cấy vào môi trường nhân nhanh, rễ hình thành và phát triển. Lựa chọn chồi Lan Kim Tuyến có từ 2-3 lá chuyển sang môi trường ra rễ. Môi trường ra rễ dựa trên môi trường MS có bổ sung các nồng độ NAA và nồng độ IAA khác nhau để kích thích tạo rễ bất định, hình thành cây con hoàn chỉnh. Sử dụng cường độ ánh sáng khác nhau, bố trí thí nghiệm tìm ra cường độ ánh sáng thích hợp nhất cho khả năng ra rễ.
Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan Kim Tuyến.
Cách bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Với 3 công thức thí nghiệm, mỗi công thức thí nghiệm nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.
+ CT1 (bóng tối) + CT2 (l000 lux) + CT3 (2000 lux)
Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Tỷ lệ cây sống, tỷ lệ cây chết. Chất lượng rễ:
+ Rễ tốt: Rễ khoẻ, dài.
+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn + Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn.
3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi đánh giá
- Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (mẫu nhiễm):
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm (mẫu)
x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)
- Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (mẫu sống):
Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Tỷ lệ mẫu chết: Tỷ lệ mẫu chết (%) = Tổng số mẫu chết (mẫu) x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Tỷ lệ tái sinh:
Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = Tổng số mẫu tái sinh (mẫu)
x 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) - Hệ số nhân: Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi (chồi) Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu) Chất lượng chồi bật: + Chồi tốt: Chồi khoẻ, xanh. + Chồi trung bình: Chồi khỏe, xanh nhạt + Chồi kém: Chồi yếu, xanh nhạt. - Số rễ trung bình/cây: Chất lượng rễ: + Rễ tốt: Rễ khoẻ, dài. + Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn + Rễ kém: Rễ nhỏ, ngắn. - Tỷ lệ cây sống:
Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống (cây)
x 100% Tổng số cây ban đầu (cây)
Tỷ lệ cây chết:
Tỷ lệ cây chết (%) = Tổng số cây chết (cây)
x 100% Tổng số cây ban đầu (cây)
Chất lượng cây con (tình trạng, màu sắc)
- Thu thập và xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê toán học Microsoft Excel 2003 và phần mềm IRISTAT 5.0
PHẦN 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả ảnh hưởng một số chất khử trùng tới tỉ lệ sống của mẫu chồi Lan Kim Tuyến Lan Kim Tuyến
Khử trùng mẫu là giai đoạn đầu tiên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, mẫu cấy được lấy từ bên ngoài tự nhiên nên dễ bị nhiễm các loại như: nấm, vi khuẩn, virus… Do đó ngay ở giai đoạn này các mẫu cần phải đạt tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu tái sinh cao… Phương pháp khử trùng mẫu cấy thường được áp dụng hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt khuẩn do tính chất dễ thao tác, đòi hỏi thiết bịđơn giản và hiệu quả cao. Các chất hóa học thường được sử dụng như: Ca(OCl)2, HgCl2, H2O2... Sử dụng chất nào, nồng độ cao hay thấp, thời gian dài hay ngắn hoàn toàn phụ thuộc vào đặc điểm và tình trạng mẫu. Với đặc điểm Lan Kim Tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân khí sinh mọng nước nên việc khử trùng tương đối khó. Vì vậy, trong đề tài này tôi sử dụng thân khí sinh là vật liệu để khử trùng. Chất khử trùng được sử dụng là NaClO 1% và H2O2 10%, Cồn 70%, HgCl2. Đây là những loại hóa chất dễ tìm, rẻ tiền, dễ sử dụng và ít gây độc cho người thao tác.
4.1.1 Nghiên cứu nhằm xác định loại hóa chất khử trùng phù hợp nhất cho vật liệu nuôi cấy cho vật liệu nuôi cấy
Bảng 4.1.: Kết quả ảnh hưởng của một số hóa chất diệt nấm, vi khuẩn đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn mẫu chồi Lan Kim Tuyến
(sau 10 ngày nuôi cấy) Công thức Chất khử trùng Tổng số mẫu/CT (mẫu) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu sống không nhiễm (%) Biểu hiện mẫu CT1 (ĐC) Nước cất vô trùng 45 100 0 0,0 Bị nấm, khuẩn. Nhiễm nấm trên bề mặt, trong môi trường CT2 NaClO 1% 45 51,1 0 49,9 Xanh CT3 H2O2 10% 45 68,8 0 32,2 Trắng xanh CT4 Cồn 70% 45 88,9 0 11,1 Thâm đen CV% 4,8 LSD.05 4,9
Chú thích: Các CT trong thí nghiệm bố trí theo bảng trên sử dụng hóa chất khử
trùng thay đổi lần lượt từ CT1 đến CT4 hóa chất cho tỉ lệ mẫu sống không nhiễm khác nhau ở mức độ tin cậy 95%. CT2 cho tỉ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất 49,9%, thấp nhất CT4 đạt 11,1% 0 49,9 32,2 11,1 0 10 20 30 40 50 60 ĐC NaClO 1% H2O2 10% Cồn 70% Hóa chất T ỷ l ệ % m ẫ u s ố n g k h ô n g n h i ễ m
1 2
Hình 4.1. Đoạn thân Lan Kim Tuyến được nuôi cấy trên môi trường MS sau khi khử trùng bằng các hóa chất
1, Hình mẫu nhiễm sau 10 ngày nuôi cấy CT1 sử sụng nước cất vô trùng thí nghiệm 1 tỉ lệ mẫu sống 0%
2, Hình ảnh mẫu sống không nhiễm sau 10 ngày nuôi cấy CT3 sử dụng H2O2 10% trong 5 phút thí nghiệm 1 tỉ lệ mẫu sống không nhiễm là 32,2%
Từ bảng 4.1. và hình 4.1. cho thấy:
Tỉ lệ mẫu sống không nhiễm: Với giá trị LSD.05 đạt 4,92 các công thức đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Ở CT ĐC (sử dụng Nước cất vô trùng) tỉ lệ mẫu sống không nhiễm là 0%. Khi sủ dụng các hóa chất khử trùng thì tỉ lệ mẫu sống không nhiễm tăng lên. CT2 cho tỉ lệ mẫu sống không nhiễm cao nhất là 49,9%, tiếp đến là CT3 và CT4 lần lượt là 32,2% và 11,1%.
Kết quả trên được giải thích như sau: sử dụng nước cất vô trùng không có khả năng diệt khuẩn nên không có tỉ lệ mẫu sống không nhiễm nào. Đối với các chất khử trùng như: NaClO 1%, Cồn 70%, H2O2 là những chất có khả năng diệt khuẩn, nấm mạnh dẫn tới tỉ lệ mẫu sống không nhiễm cao hơn lên tới 49,5%.
Tác giả Đặng Ngọc Phúc và Cs (2011) [17] nghiên cứu nhân giống in vitro
cây Sa nhân tím công bố: Thời gian khử trùng 12 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt 91,11% đối với đỉnh sinh trưởng và 86,67% đối với đoạn thân.
So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả nghiên cứu ở trên thấy kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn. Vì với đặc Lan Kim Tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân khí sinh mọng nước nên việc khử trùng tương đối khó.
4.1.2 Nghiên cứu hiệu quả của chất khử trùng NaCLO 1% kết hợp HgCl20,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến HgCl20,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến
Sau 10 ngày nuôi cấy kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.2
Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch NaClO 1% kết hợp HgCl20,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy
chồi Lan Kim Tuyến (sau 10 ngày nuôi cấy)
Công thức Hóa chất Thời gian (phút) Số mẫu đưa vào (mẫu) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) 1 (ĐC) NaClO 1% Trong 5 phút HgCl2 0,1% 0 45 0,0 46,6 44,4 2 HgCl2 0,1% 5 45 0,0 8,8 91,2