2.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Dòng làm mẹ: Lúa Sỏi Đột Biến (CTUS1).
Dòng làm cha: Nàng Quớt Biển Đột Biến (CTUS8).
Hai giống: IR28 (chuẩn nhiễm) và Đốc Phụng (chuẩn kháng).
Đặc tính nông học và chỉ tiêu phẩm chất các giống/dòng cha, mẹ được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1 Một số chỉ tiêu nông học và phẩm chất của cây cha mẹ ban đầu Tên giống/dòng TGST (ngày) Cao Cây (cm) Đặc tính giống Amylose (%) Protein (%)
CTUS1 124 125-130 Sỏi đột biến, chịu
mặn 10‰ 18,55 5,98
CTUS8 128 130-160 Nàng quớt biển đột
biến, chịu mặn 12‰ 23,12 7,23
2.2.2 Thiết bị, hóa chất
Dụng cụ thí nghiệm: water bath, pipet, ống nghiệm 13 x 100 mm, bình định mức 100 ml, máy li tâm,…
Dụng cụ lai: kéo, giấy bóng mờ, kẹp…
Hóa chất: NaCl, HCl, NaOH 1N, Ethanol 95%, Iod, KOH, Na2CO3, CuSO4, Tris, acrylamide, bis acrylamide, 2-mercapto ethanol (2-ME), TEMED, amonium persulfat (AP), sodium dodecyl sulfat (SDS), ethanol, phenol phatalein, amylose chuẩn…
2.3 PHƢƠNG PHÁP
2.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu
Bước 1: Nhận dòng cha mẹ, tiến hành trồng cha mẹ. Bước 2: Tiến hành lai theo phương pháp lai đơn. Bước 3: Trồng thế hệ F1 (khoảng 10 hạt F1).
Bước 4: Trồng thế hệ F2, theo dõi sự phân ly của các cá thể. Thu chọn các cá thể ưu tú theo hướng chỉ tiêu nông học thời gian sinh trưởng và chiều cao cây.
Bước 5: Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng ưu tú chọn được (thế hệ F2) ở nồng độ 12‰, 14‰, 16‰, 18‰. Điện di protein tổng số thế hệ F2.
Bước 6: Trồng cây F3 (trong nhà lưới). Thu hạt F4, đánh giá chỉ tiêu nông học, phẩm chất. Đánh giá khả năng chịu mặn các dòng ưu tú chọn được ở lần thử mặn của thế hệ F2.
2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể
2.3.2.1 Phương pháp lai tạo
Chuẩn bị cây cha mẹ: những cây cha mẹ được trồng trong chậu và trồng ba lần, mỗi lần cách nhau 10-14 ngày để đủ đảm bảo trổ hoa cùng lúc.
Khử nhị đực là tiến hành lấy nhị đực ra khỏi cây lúa, những cây được khử đực thường dùng làm mẹ (quá trình khử đực thường được tiến hành vào buổi chiều mát).
Kỹ thuật đơn giản nhất và hiệu quả nhất là cắt vỏ trấu và rút bỏ nhị đực bằng kẹp nhỏ.
Chọn bông phải trổ khỏi bẹ khoảng 50-60%, cẩn thận tách bông được chọn ra khỏi bông xung quanh để dễ làm, tách bông được chọn ra khỏi bẹ lá đừng làm gảy lá cờ.
Dùng kéo cắt bỏ tất cả hoa đã nở từ chóp bông (nhị đực đã phơi ra) và hoa còn non ở cuối bông, là những hoa mà nhị đực bên trong chưa nhô lên tới nữa bề cao của trấu.
Dùng kéo cắt xuyên vỏ trấu, bỏ đi từ 1/3 đến 1/2 vỏ trấu để lộ ra những túi phấn. Không nên cắt quá thấp kẻo làm tổn thương nướm nhụy cái, nếu cắt quá cao sẽ khó khử nhị đực và phấn đem thụ sẽ khó rơi xuống nướm nhụy cái.
Loại bỏ nhị đực: gấp lần lượt từng bao phấn ra ngoài (6 bao phấn) phải thật cẩn thận để không thiệt hại đến nướm nhụy.
Ghi ký hiệu trên bao: dùng bao bằng giấy bóng mờ, chi tiết cần ghi: ngày khử đực, tên người lai, tên tổ hợp lai.
Bao bông lúa: khi cả bông lúa đã được khử, bao cả bông lúa bằng giấy bóng mờ. Xếp túm phần miệng bao lại và kẹp chổ đó vào gần cổ bông để giữ bông cho chặc.
* Phương pháp thụ phấn
Kiểm tra lại những bông đã khử đực xem còn xót lại túi phấn nào không. Lấy những bông cho phấn: dự kiến đủ thời gian để lấy những bông cho phấn trước khi nở hoa (tùy thuộc vào thời tiết).
Lấy phấn của cây cha và lần lượt gấp cho vào các bông đã khử đực sau đó bao giấy bóng mờ lại.
Bảo vệ các chậu lúa tránh mưa gió nhưng phải được hưởng ánh sáng đầy đủ. Ngừa chuột, chim và những dịch hại khác.
2.3.2.2 Phương pháp điện di protein tổng số
Được tiến hành theo phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Doecyl sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) (Bộ Nông nghiệp Nhật Bản, 1980).
* Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
- Dung dịch ly trích: Kit L (Tris HCl 0,05 M (pH= 8) + SDS 0,02% + Ure 5 M) và 2-Mercaptoethanol (2-ME) 1%.
- Dung dịch làm gel A: Tris HCl 3 M (pH= 8,5), SDS 0,4%. - Dung dịch làm gel B: Tris HCl (pH= 6,5), SDS 0,4%.
- Dung dịch làm gel C: Acrylamide 29,2%, bis Acrylamide 0,8% thêm nước cất đến 100 ml.
- Dung dịch điệm điện di: Tris HCl 0,025%, Glycine 0,192 M và SDS 0,125%. - Thuốc nhộm: 0,225 M CBBR–250 trong Methanol 0,225 M, acid acetic, nước cất theo tỉ lệ 44 : 0,6 : 50
* Bước 2: Ly trích mẫu
- Lấy 3 mg bột nội nhũ (không có phần phôi) nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml. - Thêm 100 µl dung dịch ly trích.
- Lắc ít nhất trong 3 giờ hoặc để qua đêm. - Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
* Bước 3: Làm gel
- Tùy theo chiều dài, rộng và độ dày của khuông làm gel mà thể tích mỗi gel thay đổi. Sau khi tính được thể tích và phần trăm gel cần có, tra bảng tương giữa lượng và phần gel để xác định thành phần các dung dịch.
- Làm gel phân tách 12% Polyacrylmide và gel cô mẫu 5% Polyacrylamide theo quy trình của Sambrook (1989).
- Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide
- Lắp kính bộ gel, trộn dung dịch A, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều, cho vào bộ gel.
- Thêm 2 giọt nước trên bề mặt dung dịch gel, để yên trong 30-60 phút gel sẽ đông. - Làm gel cô mẫu 5% Polyacrylamide
- Loại bỏ lớp nước trên bề mặt gel phân tách, trộn dung dịch B, C + nước trong cốc nhỏ. Thêm AP, TEMED và khuấy đều, cho vào bộ gel.
- Cài răng lược giữa hai tấm kính của gel để tạo giếng, thêm 1 giọt nước, để yên trong 30-60 phút, lấy răng lược ra, lắp vào khung điện di, cho dung dịch điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.2 Công thức pha dung dịch tạo gel
* Bước 4: Tiến hành điện di
- Bơm 10 µl dung dịch ly trích mẫu/giếng.
- Chạy điện di với hiệu điện thế 20 V ở gel cô mẫu và 40 V ở gel phân tách. * Bước 5: Nhuộm gel
- Gel được nhuộm trong 2 giờ bằng dung dịch nhuộm Coomasie 0,2% Brilliant Blue R250.
Hóa chất (1gel) Gel phân tách 12% (ml) Gel cô mẫu 5% (ml)
Nước cất 1,6 0,68 30% Acrylamide 2,0 0,17 1,5 Tris HCl (pH= 8,8) 1,3 - 1M Tris HCl (pH= 6,8) - 0,13 10% SDS 1,1 0,03 10% Amonium Persulfate 0,05 0,01 TEMED 0,002 0,001
- Rửa gel trong dung dịch acid acetic : methanol : nước theo tỉ lệ 20 : 0,5 : 75, hoặc rửa trong microwave trong 30 phút.
* Bước 6: Đọc kết quả, Scan và bảo quản mẫu gel.
2.3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein
Tiến hành theo phương pháp Lowry O.H. (1951). * Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ly trích
- Dung dịch NaOH 0,1 N.
- Dung dịch A (Na2CO3 2% +Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1 N). - Dung dịch B (CuSO4 0,1%).
- Dung dịch C (A : B = 45 : 5). - Dung dịch Folin 1 N
* Bước 2: Chuẩn bị mẫu
- Cân 10 mg bột gạo +1 ml NaOH 0,1 N. - Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm. * Bước 3: Pha loãng mẫu và đo
- Ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
- Hút 100 µl mẫu + 1000 µl nước cất + 5 ml dung dịch C. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 100 µl NaOH 0,1 N.
- Trộn đều và để yên trong 10 phút.
- Thêm 50 µl Folin 1 N, trộn đều và để yên trong 30 phút.
- Lắc đều mẫu, sau đó cho vào cuvette và đo ở bước sóng 580 nm. * Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
- Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). - Đường chuẩn có dạng:
Y = aX + b
Trong đó Y: Độ hấp thụ OD.
X: Lượng protein có trong mẫu đem đo. - Hàm lượng protein được tính theo công thức:
%Protein = 100
m X
m = 14 100 %) 100 ( 10 H
trọng lượng thực của mẫu.
H% là độ ẩm của mẫu.
2.3.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng Amylose
Tiến hành theo phương pháp Cagampang and Rodriguez (1980). * Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
- Ethanol 95%. - HCL 30%. - NaOH 1 N.
- Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI). * Bước 2: Chuẩn bị mẫu
- Cân 50 mg bột gạo đã được nghiền mịn, cho vào ống 50 ml. - Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều.
- Thêm 9,5 ml NaOH 1 N. - Để qua đêm ở nhiệt độ phòng. * Bước 3: Pha loãng và đo mẫu.
- Rút 100 µl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100 µl NaOH 1 N).
- Thêm nước cất khoảng 1/2 bình, lắc đều. - Thêm nước cất đến vạch định mức.
- Chuyển sang ống 50 ml, lắc đều và để yên trong 30 phút.
- Lắc đều trước khi cho vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 580 nm. * Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
- Đường chuẩn có dạng: Y = aX +b
Trong đó Y: Độ hấp thụ OD
X: Lượng Amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml). - Tính hàm lượng Amylose theo công thức:
% Amylose = 100
5 , 0X
Đánh giá hàm lượng Amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) được trình bày như ở bảng 2.3.
Bảng 2.3 Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lƣợng Amylose cho lúa (IRRI, 1988)
2.3.2.5 Phương pháp xác định cấp nhiệt trở hồ
- Tiến hành theo phương pháp của IRRI (1979).
- Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào dĩa Petri.
- Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi dĩa.
- Đậy dĩa Petri, để yên khoảng 23 giờ nhiệt độ phòng.
- Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1979) được trình bày ở Bảng 2.4.
Bảng 2.4 Bảng phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979) CẤP Độ lan rộng
1 Hạt gạo còn nguyên. 2 Hạt gạo phòng lên.
3 Hạt gạo phòng lên; viền còn nguyên hay rõ nét. 4 Hạt gạo phòng lên; viền còn nguyên và nở rộng. 5 Hạt gạo rã ra; viền hoàn toàn nở rộng.
6 Hạt gạo tan ra hòa chung với viền.
7 Hạt gạo tan hoàn toàn và quyện vào nhau.
STT Phân nhóm Amylose (%) Cấp độ
1 Nếp 1-2 Rất thấp
2 Lúa dẻo cơm 8-20 Thấp 3 Lúa mềm cơm 21-25 Trung bình 4 Lúa cứng cơm >25 Cao
- Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức: Cấp độ trở hồ = N n xi Trong đó: xi: cấp độ trở hồ. n: số hạt có cấp độ trở hồ xi N: số hạt thử nghiệm.
- Cấp độ trở hồ được đánh giá theo thang điểm của IRRI (1979) (Bảng 2.5)
Bảng 2.5 Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979) CẤP Độ trở hồ
1-3 Cao
4-5 Trung bình 6-7 Thấp
2.3.2.6 Phương pháp xác định độ bền thể gel
Theo phương pháp của Tang et al., (1991). Bước 1: Chuẩn bị mẫu
- Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.
- Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%). Bước 2: Hòa tan mẫu
- Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% thymol blue.
- Thêm 0,2 ml KOH 0,2 N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex.
- Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 1000C) khoảng 5 phút. - Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 10 phút. Bước 3: Đọc và ghi kết quả
- Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chạy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).
- Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm của IRRI (1996) như được trình bày ở Bảng 2.6.
Bảng 2.6 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996) CẤP Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel
1 80-100 Rất mềm
3 61-80 Mềm
5 41-60 Trung bình
7 35-40 Cứng
9 <35 Rất cứng
2.3.2.7 Trắc nghiệm tính thơm bằng KOH 1,7% (IRRI, 1988)
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
- Lấy khoảng 30-40 hạt gạo cho vào ống nghiệm 15 ml
- Bơm vào mỗi ống nghiệm 5 ml KOH 1,7%, đậy kín ống nghiệm bằng giấy bạc. Bước 2: Đun và ngửi mùi
- Mang ống cho vào Waterbath đun ở 500C trong 30 phút.
- Sau đó đem ra ngửi mùi (5 người ngửi ở 3 mức độ: thơm, thơm nhẹ và không thơm, tính kết quả trung bình)
So sánh kết quả và cho kết luận sau cùng.
2.3.2.8 Phương pháp đánh giá khả năng chịu mặn giai đoạn mạ (IRRI, 1997)
Bước 1: Hạt giống được ngâm ủ cho nảy mầm. Giống IR28, IR29 được chọn làm giống chuẩn nhiễm, Đốc Phụng được chọn làm giống chuẩn kháng.
Bước 2: Gieo mỗi hạt nảy mầm trên mỗi lỗ trên các tấm xốp (10 lỗ tương ứng với 20 hạt/giống/dòng). Trong 3 ngày đầu chỉ để cây con trên khay xốp chứa đầy nước cất. (Lưu ý: Giữ cây con nguyên vẹn, hạn chế tác động đến cây con. Bất kỳ thiệt hại nào cho các rễ nhỏ, chồi sẽ phá hủy cơ chế chịu mặn chính của lúa).
Bước 3: Sau 3 ngày, khi cây con phát triển tốt, thay thế nước cất với dung dịch dinh dưỡng mặn. (Lưu ý: Hằng ngày kiểm tra mực nước, thêm nước cất đúng 3 lít vào các khay thử mặn).
Bước 4: Đổi mới mỗi 8 ngày các dung dịch dinh dưỡng và duy trì pH 5,0 hàng ngày. Ghi nhận diễn biến của mặn bằng EC (đơn vị của dung dịch dS m-1) (EC là nồng độ dung dịch muối NaCl).
- Công thức qui đổi EC đơn vị “dS m-1” thành “‰”. ‰ = EC x 0,64
Bước 5: Đánh giá khả năng chịu mặn:
- Thường xuyên theo dõi thí nghiệm, đến khi giống chuẩn nhiễm (IR28, IR29) gần như chết hoàn toàn (cấp 9).
- Đánh giá cấp chống chịu mặn: Sử dụng tiêu chuẩn đánh giá (xem Bảng 2.7) trong đánh giá các triệu chứng nhiễm mặn.
Bảng 2.7 Tiêu chẩn đánh giá chống chịu mặn (IRRI, 1997)
2.3.2.9 Phương pháp lấy chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất
* Thời gian sinh trưởng (ngày): từ khi lúa nẩy mầm cho đến ngày thu hoạch. * Chiều cao cây (cm): được đo từ mặt đất đến chóp bông của chồi cao nhất.
* Chiều dài bông (cm): đo từ cổ bông đến chóp hạt cuối cùng của bông, đo ngẫu nhiên 3 bông/bụi và tính trung bình.
*Tổng số chồi: đếm tổng số chồi lúc thu hoạch.
*Số hạt chắc/bông (hạt): đếm tổng số hạt chắc/bông của 3 bông và tính trung bình. *Trọng lượng 1000 hạt (g): cân trọng lượng 1000 hạt và quy trọng lượng về độ ẩm chuẩn (14%).
W0: Trọng lượng mẫu lúc cân. H0: Ẩm độ lúc cân
W14%: Trọng lượng hạt ở ẩm độ 14% (g)
*Phần trăm hạt chắc =
Cấp Mô tả chịu chứng Đánh giá
1 Tăng trưởng bình thường, không có vết lá cháy Chống chịu tốt
3 Gần như bình thường, nhưng đầu lá hoặc vài lá có vết trắng, lá hơi cuốn lại
Chống chịu
5 Tăng trưởng chậm, hầu hết lá bị khô, một vài cây bị chết
Chống chịu trung bình
7 Tăng trưởng bị ngưng lại hoàn toàn, hầu hết lá bị khô, nhiều cây bị chết
Nhiễm
9 Tất cả cây bị chết hoặc khô Rất nhiễm
86 ) 100 ( 0 0 % 14 H W W Tổng chắc (hạt) Tổng chắc + tổng lép
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 ĐẶC ĐIỂM CÂY CHA MẸ BAN ĐẦU
Dòng CTUS1 được chọn làm mẹ và dòng CTUS8 được chọn làm cha, nhận từ phòng thí nghiệm Chọn giống và ứng dụng Công nghệ sinh học thuộc bộ môn Di truyền giống Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ.
Kết quả lai tạo
Các dòng cha mẹ đã được trồng riêng biệt trong từng chậu và tiến hành lai tạo khi bắt đầu trổ. Do 2 dòng CTUS1 và CTUS8 đã được xử lý đột biến phá bỏ được đặc tính chịu ảnh hưởng bởi quang kỳ của lúa mùa nên 2 dòng đã có thời gian trổ bông tương đương nhau (với dòng cha CTUS8 là 128 ngày và dòng mẹ CTUS1