Nghiên cứu di truyền số lượng cho thấy cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn (Mishra và ctv., 1990; Gregorio và Senadhira, 1993; Lee, 1995). Trong giai đoạn mạ của cây lúa, các tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na+
và K+ ở trong chồi, trọng lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa giống kháng và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do hoạt động của nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính trạng như vậy rất thấp (Tang et al., 1991).
Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn. Một giống lúa có ưu thế hoạt động gen cộng tính đối với năng suất sẽ là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống trong môi trường mặn. Trong phân tích di truyền số lượng thông qua lai diallel 9 x 9, tính trạng chống chịu mặn được xem xét qua tỉ lệ thấp của Na+/K+ ở trong chồi, tính trạng này được kiểm soát bởi hoạt động của hai nhóm gen cộng tính và không cộng tính. Tính trạng Na+/K+ thấp còn thể hiển ảnh hưởng siêu trội và được điều khiển bởi ít nhất hai nhóm gen trội. Ảnh hưởng của môi trường rất có ý nghĩa và hệ số di truyền thấp (19,18%) (Gregorio và Senadhira, 1993). Từ đó, các tác giả đề nghị quần thể con lai phải thật lớn, và việc tuyển chọn nên được thực hiện
ở các thế hệ sau cùng, dưới điều kiện mặn được kiểm soát chặt chẽ, giảm thiểu thấp nhất ảnh hưởng biến động của môi trường.
1.6MỘT SỐ CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ PHẨM CHẤT HẠT GẠO 1.6.1 Hàm lƣợng Amylose
Theo Phan Thị Bích Trâm (2007), Amylose là chuỗi polysaccharide có cấu tạo mạch thẳng không phân nhánh gồm các gốc α-D glucose kết hợp lại với nhau bằng liên kết α (1,4) O-glycoside.
Cơ chế di truyền về hàm lượng amylose do gen qui định. Gen trội A quy định hàm lượng amylose cao và gen đồng hợp tử lặn aa quy định hàm lượng amylose thấp. Hạt dị hợp tử có hàm lượng amylose trung bình nhưng không ổn định. Nếu cần hạt có hàm lượng amylose trung bình thì cha mẹ hoặc mẹ hoặc cả hai phải có hàm lượng amylose trung bình (P.R. Jenning, W.R. Coffman and H.E. Kauffman, 1979).
Hàm lượng amylose ảnh hưởng chủ yếu lên đặc tính của cơm, nó tương quan nghịch với độ dẻo, độ mềm cơm và độ nở của gạo. Tùy vào hàm lượng amylose của các giống lúa có thể phân thành các nhóm:
Bảng 1.1 Phân nhóm lúa theo hàm lƣợng amylose (IRRI, 1998)
Theo Jenning, Coffman and Kauffman (1979), cho rằng lượng amylose bị môi trường biến đổi một phần theo những phương cách chưa được biết rõ như: nhiệt độ cao lúc lúa chín làm giảm hàm lượng amylose hay hàm lượng amylose của một giống lúa có thể khác nhau đến 6% từ mùa này sang mùa khác.
Chất lượng nấu nướng được xác định bởi hàm lượng amylose và nhiệt trở hồ mà ít phụ thuộc vào hàm lượng protein. Người Việt Nam lại thích cơm mềm nhưng lại ráo và đậm. Nếu hàm lượng amylose trung bình từ 22-24% thì nhiệt trở hồ cũng trung bình và cơm sẽ mềm; nếu hàm lượng amylose từ 25-26% thì cơm khô nhưng lại cứng; hàm lượng amylose nhỏ hơn 22%, cơm dẻo nhưng hơi ướt và nhạt (Nguyễn Thị Trâm, 2001).
STT Phân nhóm Amylose (%) Cấp độ
1 Nếp 1-2 Rất thấp
2 Lúa dẻo cơm 8-20 Thấp 3 Lúa mềm cơm 21-25 Trung bình 4 Lúa cứng cơm >25 Cao
1.6.2 Hàm lƣợng protein
Các thành phần protein trong hạt lúa chia làm 4 loại: Albumin, globulin, prolamin, glutein.
Albumin: tan trong nước, bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4)2SO4 khá cao (70- 80%). Theo Yamagata et al (1982) trong lúa thành phần albumin có hàm lượng lysine cao nhất, kế đến là glutelin và prolamin. Hai thành phần albumin và globulin tập trung ở lớp aleuron, không giữ được ở gạo xay chà trắng (Fecson et al., 1971).
Globulin: không tan hoặc tan rất ít trong nước, trong dung dịch muối trung hòa NaCl, KCl, Na2SO4, K2SO4. Thành phần globulin tập trung ở lớp aleuron của hạt (Juliano, 1972).
Prolamin: tan trong cồn 70-80%. Nó chiếm khoảng 18-20% protein tổng trong nội nhủ của hạt lúa và được tổng hợp ở mạng lưới nội chất (Juliano, 1972).
Glutelin: tan trong dung dịch kiềm và acid loãng. Đây là thành phần protein chiếm tỷ lệ cao nhất trong tổng số protein trong nội nhủ (Juliano, 1972).
Theo Nguyễn Ngọc Đệ (2008), so với amylose thì protein là một yếu tố thứ yếu trong phẩm chất hạt, nhưng nó đóng góp rất cơ bản vào chất dinh dưỡng của gạo. Gạo có hàm lượng protein càng cao càng có giá trị dinh dưỡng cao.
Theo Jennings et al. (1979) hàm lượng protein trong hạt tùy thuộc vào sự chuyển vị đạm trong hạt đang phát triển. Chúng chịu ảnh hưởng của điều kiện môi trường, mức độ phân bón và thời gian sinh trưởng. Lượng protein di truyền một cách phức tạp, ở lúa người ta chưa tìm ra được gen đơn nào làm tăng một loại acid amin nào đó. Chang and Somrith (1979) thì cho rằng tính trạng protein do đa gen điều khiển và có hệ số di truyền khá thấp.
Ngoài ra hàm lượng protein cũng chịu ảnh hưởng bởi bức xạ mặt trời. Giống lúa ở vùng nhiệt đới trong giai đoạn chín, đặc biệt giai đoạn 14-21 ngày sau khi trổ có ảnh hưởng đến tính chất tinh bột và hàm lượng protein (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Tương tự Gomez and De Datta (1975) cũng cho rằng hàm lượng protein có khuynh hướng giảm khi bức xạ mặt trời cao trong thời gian hạt đang phát triển. Hàm lượng protein cũng giảm theo thời gian tồn trữ, do đó khâu bảo quản sau thu hoạch thì rất quan trọng (Nguyễn Phước Tuyên, 1997).
1.6.3 Nhiệt trở hồ
Nhiệt trở hồ cũng là một yếu tố ảnh hưởng không kém phần quan trọng bên cạnh hàm lượng amylose lên phẩm chất của gạo.
Nhiệt trở hồ của tinh bột hạt gạo là nhiệt độ nấu mà khi lên đến nhiệt độ đó nước sẽ bị hấp thụ và tinh bột phồng lên không hoàn nguyên, đồng thời dạng tinh thể biến
mất. Nhiệt trở hồ thường từ 55-790C và được chia làm ba nhóm chính (P.R.Jenning, W.R. Coffman and H.E. Kauffman, 1979):
- Thấp: < 700C
- Trung bình: 70-740C - Cao: > 740C
Theo P.R. Coffman and H.E.Kauffman. (1979) cho rằng nhiệt trở hồ có thể liên hệ một phần với hàm lượng amylose của tinh bột, nhiệt đông hồ thấp không liên hệ chặt với hàm lượng amylose thấp hay trung bình. Tuy nhiên, nó là yếu tố quyết định phẩm chất hạt gạo khi đã nấu. Sự liên hệ hạn chế này rất quan trọng vì trong một số trường hợp nó cho phép các nhà chọn giống dùng cách thử nghiệm nhiệt trở hồ đơn giản để ước lượng hàm lượng amylose của tinh bột mà nếu đo trực tiếp thì rất khó.
Gạo có nhiệt trở hồ cao cần nhiều nước và thời gian để nấu hơn là gạo có nhiệt trở hồ thấp hay trung bình. Nhiệt trở hồ phụ thuộc vào nhiệt độ không khí. Nhiệt độ không khí cao sau khi trổ làm tăng nhiệt trở hồ (phẩm chất hạt giảm) và nhiệt độ không khí thấp làm giảm nhiệt trở hồ (Jennings et al., 1979). Tính di truyền của nhiệt trở hồ chưa được phân tích rõ. Theo Jennings et al., (1979) thì nhiệt trở hồ được điều khiển bởi một hoặc hai gen.
Nhiệt trở hồ đo bằng phản ứng kiềm hóa hạt gạo, ngâm hạt gạo đã cạo sạch vỏ cám và bỏ phôi trong dung dịch KOH (1,7%) trong 23 giờ ở nhiệt độ phòng (Little et al., 1958). Nhiệt trở hồ trung bình là tiêu chuẩn cần thiết trong chương trình lai tạo giống cải tiến (P.R.Coffman and H.E.Kauffman, 1979).
1.6.4 Độ bền thể gel
Độ bền thể gel là giá trị đo lường đặc tính chảy của hồ (10 mg) trong 20 ml KOH 0,2 N và được thể hiện bằng chiều dài hồ nguội đặc theo chiều ngang, tính bằng mm trong ống nghiệm 13 x 100 mm. Nó được chia làm ba loại theo chiều dài thể gel (Cagampang và ctv., 1980).
- 25-40 mm: cứng cơm - 41-60 mm: trung bình - 61-100 mm: mềm cơm
Theo kết quả nghiên cứu của Jennings và ctv. (1979) thì lúa có hàm lượng amylose thấp dưới 24% thường có thể gel mềm. Các giống có hàm lượng amylose cao như nhau có thể khác nhau về độ bền thể gel. Độ bền thể gel đo lường xu hướng cứng cơm khi để nguội, trong nhóm có cùng hàm lượng amylose, các giống có độ bền thể gel mềm thì được ưa thích hơn vì mềm cơm (Jennings et al., 1979).
Hiện nay vẫn chưa có ý kiến thống nhất về qui luật di truyền độ bền thể gel. Chang và Li (1981) thì cho rằng nó do gen điều khiển, trong đó gen cứng trội hơn gen mềm. Tang và ctv., (1991) lại cho rằng độ bền thể gel do gen đơn điều khiển và có nhiều gen phụ bổ sung.
Tuy nhiên môi trường cũng góp phần ảnh hưởng không nhỏ đến độ bền thể gel. Nó biến động rất lớn giữa hai vụ Đông-Xuân và Hè-Thu và giữa các vùng canh tác khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).
1.6.5 Mùi thơm
Mùi thơm của được xác định là do chất 2-acetyl-pyrroline tìm thấy trong thành phần dầu dễ bay hơi của cơm (Buttery và ctv., 1983), gây ra do một loại hóa chất có khả năng khuếch tán trong không khí, đó là este-acetone-aldehyde (Lê Doãn Biên và Nguyễn Bá Trinh, 1981). Theo Vương Đình Tuấn (2001) thì 2-acetyl- pyrroline cũng hiện diện trong lúa thường nhưng với hàm lượng thấp hơn 15 lần so với lúa thơm và tính thơm của hạt gạo không chỉ do một hợp chất này tạo nên mà do sự phối hợp của trên 100 hợp chất bay hơi khác trong nội nhũ như hydrocacbons, alcohols, aldehydes, acid, phenols, pydrydine 2-acetyl-pyrroline,… (Lorieux và ctv., 1996).
Ảnh hưởng của môi trường đến tính trạng mùi thơm cũng được ghi nhận, nhưng cơ chế cho đến nay vẫn chưa biết rõ. Ví dụ, các giống đặc sản của Việt Nam như Tám Xoan, Tám Thơm, Nàng Hương, Nàng Thơm Chợ Đào… chỉ cho mùi thơm ở những vùng đất nhất định, nếu gieo trồng ở những vùng đất khác thì không có mùi thơm hoặc thơm nhẹ. Có thể chúng phụ thuộc vào mùa vụ gieo trồng, loại đất và độ phì của đất (Vương Đình Tuấn, 2001).
Về mặt di truyền của tính trạng mùi thơm rất phức tạp. Có nhiều ý kiến khác nhau về gen mã hóa tính trạng mùi thơm. Kadam và Panntakar (1938) cho rằng tính trạng mùi thơm do một gen trội điều khiển. Theo Dhulappnavar (1969) ghi nhận là 2 gen thơm trội tương tác với nhau theo nguyên tắc bổ sung. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng chỉ một gen lặn mã hóa mùi thơm. Theo Berner và ctv.
(1986) lại cho rằng tính trạng mùi thơm được kiểm soát bởi một gen lặn. Nhưng theo Đỗ Khắc Thịnh (1994) thì cho rằng nó do hai hay ba gen lặn kiểm soát.
1.7CHIỀU DÀI VÀ HÌNH DẠNG HẠT GẠO
Nhu cầu về chất lượng gạo trên thị trường thế giới là rất khác nhau. Chiều dài hạt gạo là một thông số quan trọng để phân loại gạo xuất khẩu và phụ thuộc rất lớn vào thị hiếu tiêu dùng của từng quốc gia. Ví dụ, thị trường Nhật yêu cầu gạo hạt tròn, hàm lượng amylose thấp, cơm dẻo, nhưng thị trường Thái Lan thì thích gạo hạt dài, hàm lượng amylose trung bình, cơm mềm nhưng không dính. Với yêu cầu
gạo hạt dài thì chiều dài hạt gạo trên thị trường thế giới phải lớn hơn 7 mm (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).
Bảng 1.2 Phân loại theo số đo chiều dài hạt gạo (Tiêu chuẩn Việt Nam, 2001)
Bảng 1.3 Phân loại theo tỉ số chiều dài/rộng hạt (Tiêu chuẩn Việt Nam, 2001)
Chiều dài hạt gạo là tính trạng ổn định nhất, nó ít bị ảnh hưởng của điều kiện môi trường và được điều khiển bởi đơn gen hay đa gen (Bollich et al., 1992). Tuy nhiên, theo Sormith (1979), chiều dài hạt gạo do đa gen điều khiển. Thứ tự tính trội được ghi nhận như sau: hạt dài>hạt trung bình>hạt ngắn>hạt rất ngắn.
1.8KỸ THUẬT ĐIỆN DI SDS-PAGE
Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dedecyl Sulfate- PolyAcrylamide Gel) được Laemmli (1970) phát hiện từ sự hiệu chỉnh bằng cách thêm 0,1% SDS (chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Omstein-Davis (1964) nhằm xác định trọng lượng phân tử các loại protein trong phổ điện di (Davis.E.Garfin, 1995). Phương pháp điện di protein được xem như là một công cụ mạnh trong việc ứng dụng các thành phần protein của sinh vật (cây trồng, vật nuôi, thủy sản cũng như trên sinh vật). Ngoài ra, phương pháp này còn được áp dụng trong y học để phát hiện nhanh bệnh SIDA (Steve K.Alexander, 2001).
Protein dự trữ được sử dụng như là các dấu hiệu di truyền để tìm hiểu về protein mong muốn. Để biết rõ đặc điểm dấu di truyền cần phải hiểu rõ tính đa hình protein dự trữ bên trong loài, ảnh hưởng của môi trường, kiểm soát di truyền, tính phức tạp của phân tử và mối quan hệ protein dự trữ giữa các loài khác nhau. Dựa trên phân tích trọng lượng phân tử khác nhau của protein dự trữ mà người ta đánh
STT Dạng hạt Chiều dài (mm) Thang điểm
1 Rất dài >7,5 1
2 Dài 6,61 – 7,5 3
3 Trung Bình 5,51 – 6,6 5
4 Ngắn <5,51 7
STT Dạng hạt Chiều dài (mm) Thang điểm
1 Thon dài >3 1
2 Trung bình 2,1-3 3
3 Hơi tròn 1,1-2 5
giá được tính đa hình. Do vạch protein trong phổ điện di là kết quả của một chuỗi phức tạp mức độ phân tử nên không có một vạch protein nào có thể xuất hiện hai lần (Phạm Văn Phượng, 2001).
CHƢƠNG 2
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2012 đến tháng 12/2013.
Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Nhà lưới và Phòng thí nghiệm Chọn giống cây trồng và Ứng Dụng Công Nghệ Sinh học, Bộ môn Di Truyền– Giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
2.2PHƢƠNG TIỆN 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Dòng làm mẹ: Lúa Sỏi Đột Biến (CTUS1).
Dòng làm cha: Nàng Quớt Biển Đột Biến (CTUS8).
Hai giống: IR28 (chuẩn nhiễm) và Đốc Phụng (chuẩn kháng).
Đặc tính nông học và chỉ tiêu phẩm chất các giống/dòng cha, mẹ được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1 Một số chỉ tiêu nông học và phẩm chất của cây cha mẹ ban đầu Tên giống/dòng TGST (ngày) Cao Cây (cm) Đặc tính giống Amylose (%) Protein (%)
CTUS1 124 125-130 Sỏi đột biến, chịu
mặn 10‰ 18,55 5,98
CTUS8 128 130-160 Nàng quớt biển đột
biến, chịu mặn 12‰ 23,12 7,23
2.2.2 Thiết bị, hóa chất
Dụng cụ thí nghiệm: water bath, pipet, ống nghiệm 13 x 100 mm, bình định mức 100 ml, máy li tâm,…
Dụng cụ lai: kéo, giấy bóng mờ, kẹp…
Hóa chất: NaCl, HCl, NaOH 1N, Ethanol 95%, Iod, KOH, Na2CO3, CuSO4, Tris, acrylamide, bis acrylamide, 2-mercapto ethanol (2-ME), TEMED, amonium persulfat (AP), sodium dodecyl sulfat (SDS), ethanol, phenol phatalein, amylose chuẩn…
2.3 PHƢƠNG PHÁP
2.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu
Bước 1: Nhận dòng cha mẹ, tiến hành trồng cha mẹ. Bước 2: Tiến hành lai theo phương pháp lai đơn. Bước 3: Trồng thế hệ F1 (khoảng 10 hạt F1).
Bước 4: Trồng thế hệ F2, theo dõi sự phân ly của các cá thể. Thu chọn các cá thể ưu tú theo hướng chỉ tiêu nông học thời gian sinh trưởng và chiều cao cây.
Bước 5: Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng ưu tú chọn được (thế hệ F2) ở nồng độ 12‰, 14‰, 16‰, 18‰. Điện di protein tổng số thế hệ F2.
Bước 6: Trồng cây F3 (trong nhà lưới). Thu hạt F4, đánh giá chỉ tiêu nông học, phẩm chất. Đánh giá khả năng chịu mặn các dòng ưu tú chọn được ở lần thử mặn của thế hệ F2.
2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể
2.3.2.1 Phương pháp lai tạo
Chuẩn bị cây cha mẹ: những cây cha mẹ được trồng trong chậu và trồng ba lần, mỗi lần cách nhau 10-14 ngày để đủ đảm bảo trổ hoa cùng lúc.
Khử nhị đực là tiến hành lấy nhị đực ra khỏi cây lúa, những cây được khử đực thường dùng làm mẹ (quá trình khử đực thường được tiến hành vào buổi chiều mát).
Kỹ thuật đơn giản nhất và hiệu quả nhất là cắt vỏ trấu và rút bỏ nhị đực bằng kẹp nhỏ.
Chọn bông phải trổ khỏi bẹ khoảng 50-60%, cẩn thận tách bông được chọn ra khỏi bông xung quanh để dễ làm, tách bông được chọn ra khỏi bẹ lá đừng làm gảy lá cờ.
Dùng kéo cắt bỏ tất cả hoa đã nở từ chóp bông (nhị đực đã phơi ra) và hoa còn non ở cuối bông, là những hoa mà nhị đực bên trong chưa nhô lên tới nữa bề