nhất hóa tiểu phân liposom
3.1.1.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình đẩy qua màng
Liposom không mang dược chất được chế tạo theo phương pháp Bangham. Liposom sau khi tạo thành được giảm kích thước và đồng nhất bằng phương pháp đẩy qua màng. Tiến hành với mẫu 25ml, đầu tiên đẩy 8 lần qua màng có kích thước lỗ 400nm và sau đó mẫu tiếp tục được đẩy 14 lần qua màng có kích thước lỗ 80nm. Lấy các mẫu đại diện với thể tích khoảng 0.5ml ở các lần đẩy thứ 0, 2, 4, 6, 8 ở màng 400nm và ở các lần đẩy thứ 2, 4, 6, 8, 11, 12, 14 ở màng 80nm. Sau đó, các tiểu phân liposom được đánh giá thông qua việc xác định kích thước tiểu phân trung bình, chỉ số đa phân tán, phân bố kích thước tiểu phân liposom của các mẫu trên máy ZETASIZER ZS90. Kết quả như sau :
Với các mẫu liposom qua các lần đẩy ở màng 400nm, kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Các thông số đánh giá tiểu phân liposom thu được sau các lần đẩy qua màng 400nm Thứ tự lần đẩy Hệ số đa phân tán (PDI) Kích thước trung bình theo đường kính (nm) Phân bố kích thước theo % thể tích 0 0.876 7184 80.9 567.4 19.1
2 0.452 5952 80.8 437.7 19.2 4 0.369 5256 57.4 384.6 42.6 6 0.353 4778 65.6 356.3 34.4 8 0.307 4623 68.3 318.2 31.7
Kết quả cho thấy PDI của hệ liposom qua các lần đẩy giảm dần.Biến thiên PDI thể hiện trên đồ thị hình 3.1
Hình 3.1 Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 400nm
Đồ thị cho trên cho thấy PDI giảm dần, điều này chứng tỏ hệ trở nên đồng nhất hơn. PDI giảm rõ rệt ở lần đẩy thứ 2, PDI giảm 50% (0.876 xuống 0.452) và giảm 20% ở lần đẩy thứ 4 (0.452 xuống 0.369). Tuy nhiên sau đó, ở các lần đẩy 4, 6, 8, sự giảm PDI không đáng kể, PDI của hệ trở nên ổn định và thấp nhất ở lần đẩy thứ 8, PDI là 0.307.
%
Bảng 3.1 cũng cho thấy, kích thước tiểu phân liposom ở các lần đẩy qua màng 400 nm đều phân bố ở 2 vùng: vùng các phân tử kích thước lớn (>4000 nm) và vùng các phân tử kích thước nhỏ hơn (<600 nm). Sự biến thiên % phân bố theo thể tích của các phân tử vùng kích thước nhỏ và kích thước lớn được thể hiện rõ hơn ở biểu đồ hình 3.2 và 3.3.
Hình 3.3 Biểu đồ phân bố kích thước theo % thể tích qua các lần đẩy của các phân tử kích thước lớn
Hình 3.2 Biểu đồ phân bố kích thước theo % thể tích qua các lần đẩy của các phân tử kích thước nhỏ
%
(nm) (nm)
Biểu đồ hình 3.2 cho thấy, ở vùng các tiểu phân kích thước nhỏ, % phân bố theo thể tích tăng và có giá trị lớn nhất ở lần đẩy thứ 4 (42.6%). Tuy nhiên, từ các lần đẩy tiếp theo, % phân bố theo thể tích lại giảm đi và sự kích thước liposom giảm qua các lần đẩy không đáng kể .
Biểu đồ hình 3.3 cho thấy, vùng các tiểu phân kích thước lớn, % phân bố theo thể tích giảm và có giá trị thấp nhất ở lần đẩy thứ 4 là 57.4 %. Tuy nhiên, từ các lần đẩy tiếp theo, % phân bố theo thể tích lại tăng lên và sự giảm kích thước liposom qua các lần đẩy không đáng kể .
Mục đích của quá trình đẩy qua màng 400nm là làm tăng % phân bố theo thể tích của các tiểu phân kích thước nhỏ và giảm % phân bố theo thể tích của các tiểu phân kích thước lớn. Kết quả thu được từ các biểu đồ ở hình 3.2 và 3.3 đều cho thấy từ sau lần đẩy thứ 4, các tiểu phân liposom có kích thước và phân bố dần trở nên ổn định và hệ số PDI thấp nhất ở lần đẩy thứ 8 (hình 3.1). Do vậy lựa chọn số lần đẩy qua màng 400nm là 8 lần cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mẫu chứa các tiểu phân liposom thu được sau khi được đẩy 8 lần qua màng 400nm ở trên, tiếp tục được đẩy 14 lần qua màng có kích thước lỗ 80nm.
Kết quả các thông số đánh giá thu được về kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán của hệ liposome sau các lần đẩy qua màng 80nm thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 Các thông số đánh giá tiểu phân liposom thu được sau các lần đẩy qua màng 80nm
Số thứ tự lần đẩy Chỉ số đa phân tán (PDI) Kích thước trung bình theo đường kính (nm) Phân bố kích thước theo % thể tích 2 0.126 137 100 4 0.092 114.6 100 6 0.084 108.9 100 8 0.079 107 100 11 0.065 103 100 12 0.058 99.87 100 14 0.053 98.24 100
nhỏ, kích thước liposom phân bố tập trung trong khoảng 140-100nm và chiếm 100% thể tích mẫu. Sự thay đổi PDI và kích thước tiểu phân liposom qua các lần đẩy được thể hiện rõ hơn thông qua biểu diễn trên đồ thị hình 3.4 và hình 3.5 tương ứng.
Hình 3.4 Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 80nm Hình 3.5 Kích thước tiểu phân qua các lần đẩy qua màng 80nm
Trên đồ thị hình 3.4 cho thấy, qua các lần đẩy qua màng 80nm, PDI giảm dần về 0, chứng tỏ hệ phân tán càng trở nên đồng nhất.Đồ thị ở hình 3.5 cho thấy kích thước tiểu phân giảm dần theo sự tăng số lần đẩy qua màng. Sau lần đẩy thứ 11 kích thước liposom là 103 nm, tuy nhiên sau lần đẩy thứ 12, kích thước liposom là 99.87nm, kích thước này nằm ngoài khoảng kích thước tối ưu cho tác dụng của hệ liposom-DOX.
Vì mục tiêu của quá trình này là thu được hệ hệ lipsom đồng nhất tối đa và có kích thước tiểu phân phù hợp, vì vậy lựa chọn số lần đẩy qua màng 80nm là 11 lần cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.1.2 So sánh 2 phương pháp giảm kích thước tiểu phân : đẩy qua màng và siêu âm đầu dò
Liposom không mang dược chất được chế tạo theo phương pháp Bangham.Hỗn dịch liposom đa lớp thu được sau khi hydrat hóa được làm nhỏ kích thước và đồng nhất hóa theo 2 phương pháp : đẩy qua màng và siêu âm đầu dò, các bước tiến hành cụ thể được trình bày ở mục 2.3.1.2, 2.3.1.3.Liposom thu được sau đồng nhất hóa theo 2 phương pháp trên, được đánh giá thông quacác chỉ số : kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán, phân bố kích thước theo % thể tích.Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3 Kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán của hệ liposom đồng nhất hóa theo hai phương pháp: đẩy qua màng và siêu âm đầu dò
Phương pháp Kích thước tiểu phân
trung bình theo đường kính (nm)
Chỉ số đa phân tán (PDI)
Đẩy qua màng 108.8 0.072
Siêu âm đầu dò 73.45 0.133
Bảng 3.3 cho thấy phương pháp đẩy qua màng cho tiểu phân liposom có kích thước lớn hơn và PDI nhỏ hơn gần 1/2 so với phương pháp siêu âm đầu dò.PDI nhỏ hơn chứng tỏ hệ
liposom thu được theo phương pháp đẩy qua màng có độ đồng nhất cao hơn hẳn so với hệ liposom thu được theo phương pháp siêu âm.
Bảng 3.4 Phân bố kích thước tiểu phân theo thể tích
Phương pháp đẩy qua màng Phương pháp siêu âm
Kích thước % Phân bố Kích thước % Phân bố
50.75 1.4 37.84 10 58.77 6.6 43.82 16.4 68.06 14.2 50.75 18.6 78.82 19.1 58.77 16.8 91.28 19.2 78.82 8.8 105.7 15.8 91.23 5.3 122.4 11.1 105.7 2.3 141.8 6.8 122.4 1.7 164.2 3.6 141 1.5 190.1 1.6 164 0.1 220.2 0.5 255 0.1
Phân bố kích thước liposom theo thể tích ở 2 mẫu liposom thể hiện cụ thể ở bàng 3.4. Kết quả cho thấy phân bố kích thước tiểu phân liposom thu được sau khi đẩy qua màng có phân bố kích thước lớn hơn, tập trung từ 70-120 nm chiếm 79.4% thể tích mẫu, trong khi hệ liposom thu được sau siêu âm có phân bố kích thước nhỏ hơn, tập trung từ 40-70nm chiếm 70% thể tích mẫu.
Như vậy, sử dụng phương pháp đẩy qua màng trong giảm kích thước và đồng nhất hóa giúp tạo ra hệ liposom có nhiều ưu điểm: kích thước lớn hơn, độ đồng nhất cao hơn hẳn so với liposom được thu được theo phương pháp siêu âm đầu dò.
3.1.1.3 Sơ bộ hình thái, kích thước liposom
Liposom sau khi chế tạo theo phương pháp Bangham, được làm nhỏ kích thước theo phương pháp đẩy qua màng. Liposom hóa DOX bằng phương pháp gradient amonisulfat, loại DOX tự do và xác định hình thái, kích thước sơ bộ bằng kỹ thuật chụp hiển vi điển tử truyền qua (TEM). Kết quả thu được được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3.6 Ảnh
chụp TEM liposom (độ phóng đại 20000 lần)
Ảnh chụp thu được ở độ phóng đại 20000 lần cho thấy :
Hệ liposom phân tán tương đối đều, hầu như không có hiện tượng kế
t tụ. Liposom tạo ra có dạng hình cầu, tương đối đồng nhất, kích thước đều nhau nằm trong khoảng 108- 120 nm.