Kích thước tiểu phân là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu lực phân phối thuốc đến khối u. Kích thước tiểu phân ảnh hưởng đến: thời gian thuốc lưu thông trong máu, sự giải phóng thuốc ra khỏi liposom, sự tích lũy liposom ở khối u. Kích thước tiểu phân còn ảnh hưởng đến tác dụng điểu trị cũng như độc tính của hệ liposomthuốc [22].
Các tế bào thành mạch máu ở các vùng mô khỏe mạnh liên kết với nhau rất chặt chẽ trong khi đó thành huyết quản của các khối ung thư xuất hiện các kẽ hở khoảng 400nm. Như vậy các liposom DOX có kích thước nhỏ hơn 400nm sẽ xuyên qua kẽ hở trên thành mạch khối u và đi vào các mô ung thư mà không phân bố đến các mô lành. Trong khi đó các phân tử DOX khi sử dụng chế phẩm dạng tự do sẽ xuyên qua thành huyết quản của cả mô lành và mô bệnh và gây độc tính cao [3]. Tuy nhiên kết quả nhiều nghiên cứu cho thấy kích thước phù hợp nhất để liposom phân bố tập trung ở khối u là từ 100- 200nm[4, 7]. Do vậy chế tạo liposom có kích thước 100-200nm là mục tiêu của nghiên cứu này.
Hiện nay đa số các phương pháp chế tạo liposom, chưa có phương pháp nào tạo được liposom có kích thước và độ đồng nhất mong muốn. Do đó hiện tại, quá trình giảm kích thước và đồng nhất liposom là bước bắt buộc trong quy trình chế tạo liposom.
Có nhiều phương pháp để giảm kích thước và đồng nhất hóa liposom. Trong nghiên cứu này sử dụng phương pháp đẩy qua màng, một trong những phương pháp có nhiều ưu điểm và đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới. Hỗn dịch liposom thu được sau hydrat hóa, được đẩy nhiểu lần qua các màng polycarbonat có kích thước lỗ giảm dần đến khi thu được kích thước và độ đồng nhất mong muốn.
Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với phương pháp sử dụng sóng siêu âm để giảm kích thước và đồng nhất hóa được sử dụng trong các nghiên cứu trước đó.
Phương pháp đẩy qua màng dễ thao tác, có thể tiến hành trên lượng mẫu lớn, tốn ít thời gian và dễ dàng kiểm soát các điểu kiện thí nghiệm đặc biệt là nhiệt độ. Toàn bộ hệ bao gồm mẫu liposom và thiết bị được ngâm trong bể điểu nhiệt, quá trình đẩy không sinh nhiệt do vậy nhiệt độ trong toàn bộ quá trình đẩy luôn hằng định và dễ dàng kiểm soát. Đặc biệt, việc sử dụng khí trở (N2) trong quá trình đẩy không gây nhiễm tạp cho sản phẩm cũng giúp loại bỏ oxy ra khỏi mẫu liposom làm cho liposom ổn định hơn.
Trong khi đó sử dụng phương pháp siêu âm để giảm kích thước chỉ có thể tiến hành với lượng mẫu nhỏ, tốn thời gian không kiểm soát được nhiệt độ trong quá trình siêu âm. Nhiệt lượng lớn sinh ra trong quá trính siêu âm là một yếu tố gây nguy cơ biến tính lipid và dược chất. Sử dụng thiết bị siêu âm đầu dò, sau quá trình siêu âm, mẫu còn bị nhiễm bẩn tạp kim loại từ
đầu siêu âm [23,30].
Trong nghiên cứu này, mẫu liposom thô có thể tích 25ml được đẩy 8 lần qua màng 400 nm và tiếp tục đẩy 11 lần qua màng 80 nm, quá trình đẩy diễn ra trong 15 phút thu được mẫu liposom có kích thước trung bình 108.8 nm, PDI là 0.072 chứng tỏ hệ liposom tương đối đồng nhất, kích thước nắm trong khoảng 100 -200nm.
Trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Lâm [4] liposom được làm giảm kích thước bằng phương pháp siêu âm đầu dò, tiến hành với mẫu 10ml trong 10 phút, mẫu liposom thu được có kích thước trung bình 79.7 nm và PDI tương đối cao 0.260. Tác giả Nguyễn thị Huê [3] trong nghiên cứu của mình đã làm giảm kích thước liposom bằng phương pháp siêu âm đầu dò, tiến hành với mẫu 5ml trong 20 phút, mẫu liposom thu được có PDI là 0.127.
Trong nghiên cứu này,kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, phương pháp đẩy qua màng cho tiểu phân liposom có kích thước phù hợp hơn (100-200 nm ) và đồng nhất hơn hẳn thể hiển qua chỉ số PDI bé hơn gần 1/2 so với phương pháp siêu âm đầu dò.
Kết quả nghiên cứu này thu được cũng tương đồng với các kết quả thu được khi sử dụng phương pháp đẩy qua màng trong giảm kích thước tiểu phân liposom của các nghiên cứu trên thếgiới. Năm 2010 Felicitas Lewrick and Regine Peschka Süss [16] đã tiến hành nghiên cứu và chế tạo liposom DOX bằng phương pháp Bangham, hỗn dịch liposom thu được sau hydrat hóa được đẩy qua màng polycarbonat dưới áp suất 12 bar. Sau khi đẩy qua màng có kích thước lỗ 200nm 7 lần và 11 lần qua màng 80nm, thu được hệ liposom có kích thước 105 ± 10nm, PDI bé hơn 0.08.
Antonella Accardi và cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế liposom doxorubicin có gắn thụ thể hướng đích. Liposom được bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo với màng lipid có thành phần là DSPC, làm giảm kích thước liposom bằng cách nén nhiều lần qua màng polycarbonat 100 nm. Kết quả thu được các liposom có kích thước 145 -165nm, PDI < 0.20 [8].
Những so sánh trên giúp thấy rõ ưu điểm của phương pháp đẩy qua màng so với các phương pháp giảm kích thước và đồng nhất hóa liposom khác và cần được áp dụng vào quy trình chế tạo liposom. Nhược điểm của phương pháp này chính là giá thành thiết bị cao.
3.2.3 Liposom hóa DOX và loại DOX tự do bên ngoài liposom
Liposom hóa DOX là quá trình nạp DOX vào trong khoang nước của liposom. Căn cứ vào kết quả đạt được của tác giả Nguyễn Thị Huê [3] , chúng tôi lựa chọn kỹ thuật gradient amonisulfat để nạp doxorubicin vào liposom, tỷ lệ nạp thuốc là 2mg DOX/ml liposom, hiệu suất nạp thuốc là 90.3%.
thuật gradient pH, tỷ lệ nạp nạp thuốc 2mg DOX/ml liposom hiệu suất thu được 85%. Có sự khác nhau giữa hiệu suất liposom hóa của 2 nghiên cứu là do ảnh hưởng của phương pháp giảm kích thước tiểu phân liposom mà mỗi nghiên cứu áp dụng. Nguyễn văn Lâm sử dụng phương pháp siêu âm đầu dò để giảm kích thước liposom, liposom thu được có kích thước nhỏ (79.7nm ) dẫn đến thể tích khoang nước nhỏ nên và mẫu liposom có độ đồng nhất kém dẫn đến hiệu suất liposom hóa chưa cao.
Tác giả Nguyễn Thị Huê [3] cũng tiến hành liposom hóa DOX theo kỹ thuật gradient amonisulfat, hiệu suất thu được khá cao 96.2%. Tuy nhiên tỷ lệ nạp thuốc chỉ là 0.85mg DOX/ml liposom. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tỷ lệ nạp thuốc cao 2ml DOX/ ml với mục đích chế tạo liposom DOX gần giống hơn với chế phẩm liposom-DOX đang sử dụng trên lâm sàng, các chế phẩm này đều có hàm lượng thuốc là 2mg/ml.
Felicitas Lewrick and Regine Peschka Süss [16] đã tiến hành nghiên cứu và chế tạo liposom DOX bằng phương pháp Bangham. Công thức liposom SPC và cholesterol theo tỷ lệ mol 7:3. Giảm kích thước tiểu phân liposom và đồng nhất hóa bằng phương pháp đẩy qua màng, liposom hóa DOX bằng kỹ thuật gradient pH. Hiệu suất liposom hóa đạt trên 95 %.
Hiệu suất liposom hóa trong nghiên cứu này chưa cao có thể do chưa tối ưu hóa tỷ lệ nạp thuốc và quá trình loại DOX tự do còn nhiều nhược điểm. Lượng lipid ban đầu sẽ bị hao hụt trong quá trình chế tạo vì vậy cần định lượng hàm lượng lipid và xác định tỷ lệ nạp thuốc dựa trên hàm lượng lipid có trong mẫu. Quá trình loại DOX tự do sử dụng kỹ thuật thẩm tách, thời gian còn kéo dài,tiến hành ở nhiệt độ phòng nên thuốc đã được liposom hóa có nguy cơ rò rỉ ra ngoài.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận
Trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp với đề tài:‘‘ Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng trong nghiên cứu tạo liposom-doxorubicin kích cỡ nano’’, chúng tôi đã thu được kết quả như sau :
- Đã nghiên cứu xây dựng và áp dụng thành công phương pháp đẩy qua màng trong giảm kích thước tiểu phân liposom. Kết quả cho thấy, khi đẩy hỗn dịch liposom thô 8 lần qua màng 400 nm và tiếp tục đẩy 11 lần qua màng 80nm thu được hệ liposom có kích thước trung bình 108 nm và PDI là 0. 072
- Nghiên cứu đã chứng minh được ưu điểm của phương pháp đẩy qua màng so với phương pháp siêu âm đầu dò trong giảm kích thước tiểu phân liposom. Phương pháp đẩy qua màng cho hệ phân tán liposom có kích thước phù hợp hơn (100 -200 nm) và đồng nhất hơn so với phương pháp siêu âm.
Đề xuất
Do thời gian và điều kiện tiến hành nghiên cứu còn hạn chế, để nâng cao hiệu suất liposom hóa doxorubicin và tiến tới có thể đưa việc chế tạo liposom-doxorubicin gần hơn đến quy mô sản xuất, chúng tôi có những đề xuất như sau:
- Nghiên cứu phương pháp định lượng phospholipid để xác định tỷ lệ nạp thuốc phù hợp, nâng cao hiệu suất liposom hóa DOX.
- Bổ sung vào công thức chế tạo liposom các thành phần mới nhằm kéo dài thời gian bán thải và tăng tính hướng đích của liposom như PEG-DSPE , folic acid…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ y tế (2002), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.Trương Duy Hiệu (2011), Nghiên cứu phương pháp tạo tiểu phân liposom-doxorubicin kích thước cỡ nano, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội.
3. Nguyễn Thị Huê (2012), Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật tạo liposome doxorubicin từ phospholipid lòng đỏ trứng, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội.
4. Nguyễn Văn Lâm (2012), Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội.
5. Võ Xuân Minh (2006), Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc, NXB Y học.
6. Nguyễn Thị Thu Trang (2012), Nghiên cứu chiết xuất, cải tiến công thức phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposome, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
7. A. Abraham Sheela, Dawn N. Waterhouse, Lawrence D. Mayer, Pieter R. Cullis, Thomas D. Madden, Marcel B. Bally (2005), “ The Liposomal Formulation of Doxorubicin ” , Methods in enzymology, 391, 71-97.
8. Antonella Accardo et al. ( 2012), “Peptide-modified liposomes for selective targeting of bombesin receptors overexpressed by cancer cells: a potential theranostic agent”, International Journal of Nanomedicine ,7, 2007–2017.
9. Abolfazl Akbarzadeh, Rogaie Rezaei-Sadabady, Soodabeh Davaran, Sang Woo Joo, Nosratollah Zarghami,Younes Hanifehpour, Mohammad Samiei, Mohammad Kouhi ,Kazem Nejati-Koshki (2013), “Liposome: classification, preparation, and Applications”, Nanoscale Research Letters, 8-102.
10. Barenholz Yechezkel (2007), “Amphipathic Weak Base Loading into Preformed Liposomes Having a Transmembrane Ammonium Ion Gradient: From the Bench to Approved Doxil”, Liposome Technology Third Edition Volume II Entrapment of Drugs and Other Materials into Liposomes, 1-22.
11. British Pharmacopoeia (2012) Volume III.
12. Daryl C. Drummond, Oliver Mayer, Keelung Hong, Dmitri B.Kirpotin, Demetrios Papahajopouslos (1999), “Optimizing Liposomes for Delivery of Chemotherapeutic Agents to Solid Tumors”, Pharmacological Review, 51( 4), 691-743.
13. Katrin K. Halling (2004), “Membrane properties of plant sterols in phospholipid bilayers as determined by differential scanning calorimetry, resonance energy transfer and detergent- induced solubilization”, Biochimica et Biophysica Acta, 1664, 161– 171.
14. Mohan Kale, Pravin Suruse, Ramandeep Singh, Geena Malhotra, Preeti Raut (2012), “Effect of size reduction techniques on doxorubicin hydrochloride loaded liposomes”, International Journal of Biological & Pharmaceutical Research, 3(3), 308-316.
15. Johanna Lang, Carmen Vigo-Pelfrey, Francis Martin (1990), “Liposomes composed of partially hydrogenated egg phosphatidylcholines: fatty acid composition, thermal phase behavior and oxidative stability”, Chemistry and Physics of Lipids,53, 91- 101.
16. Felicitas Lewrick ,Regine Peschka Süss , “Remote Loading of Anthracyclines into Liposomes”, Liposomes Methods and Protocols , 1, 139-145.
17. Li XueMing, LiYan Ding, Yuanlong Xu, YongluWang, QiNeng Ping (2009), “Targeted delivery of doxorubicin using stealth liposomes modified with transferrin” , International Journal of Pharmaceutics, 373, 116–123.
18. Martindale 35.
“Uptake of antineoplastic agents into large unilameilar vesicles in response to a membrane potential” , Biochimica et Biophysica Acta, (816) , 294-302.
20. Mayer L.D., M.J. Hope, P.R. Cullis (1986) , “Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure”, Biochimica et Biophysics Acta, 858, 161-168.
21. Mui Barbara, Michael J. Hope (2007) , “Formation of Large Unilamellar Vesicles by Extrusion”, Liposome Technology Third Edition Volume I : Liposome Preparation and Related Techniques , 55-64.
22. Nagayasu, K. Uchiyama, H. Kiwada (1999), “The size of liposomes: a factor which affects their targetingefficiency to tumors and therapeutic activity of liposomal antitumor drugs”,
Advanced Drug Delivery Reviews, 40, 75–87.
23. Nayar R, Hope MJ, Cullis PR ( 1989), “Generation of large unilamellar vesicles from long chain saturated phosphatidylcholine by extrusion techniques”, Biochim Biophys Acta, 986, 200– 206.
24. Ray A (2012),”Liposome in Drug delivery system” , Asian J Res Pharm Sci, 2, 41-44.
25. Rojanapanthu Pleumchitt, Narong Sarisuta, Korakot Chaturon, Krisana Kraisintu (2003) , “Physicochemical properties of amphotericin B liposomes prepared by reverse-phase evaporation method”, Drug Dev Ind Pharm, 29(1), 31-72.
26. Samad Abdus, Y. Sultana and M. Aqil (2007) “ Liposomal Drug Delivery Systems: An Update Review”, Current Drug Delivery,4, 297-305.
27. Sen Kacoli , Mahitosh Mandal (2013), “Second generation liposomal cancer therapeutics: Transition from laboratory to clinic”, International Journal of Pharmaceutics, 448, 28–43.
28. Shri Singh (2000), “Phase transitions in liquid”, Physics Reports, 324, 107-269 29. USP29-NF24.
30. Vladimir Torchilin, Volkmar Weissig (2003), “Liposome a practical approach Second edition ”, Oxford university press, New York. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});