Các thành phần nguyên liệu dùng cho chế tạo liposom DOX được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1Nguyên liệu chế tạo liposom DOX
1 Phospholipid trứng 272 mg
2 Cholesterol 58 mg
3 Cloroform 10ml
4 Dung dịch amoni sulfat 250 mM 25ml
2.3.1.1 Chế tạo liposom chưa mang dược chất
Tạo lớp film lipid : Hòa tan hỗn hợp phospholipid và cholesterol tỷ lệ mol 7: 3 vào trong 10ml chloroform. Toàn bộ dung dịch được cho vào bình cầu dung tích 1000 ml, tiến hành cất quay chân không ở 55oC, tốc độ quay đặt ở mức 5. Sau khi lớp màng mỏng lipid được tạo thành, tiếp tục cất quay thêm 3 giờ để làm bay hơi hết dung môi hữu cơ.
Hydrat hóa màng mỏng lipid bằng 25ml dung dịch amonisulfat nồng độ 250 mM, ở 55oC, tốc độ quay ở mức 5. Quá trình hydrat hóa được thực hiện 2 giờ để đảm bảo lớp màng lipid phân tán hoàn toàn vào dung môi phân cực và tạo thành các liposom đa lớp.
Hệ phân tán liposom thu được sau hydrat hóa được cho vào thiết bị EmulsiFlex-C5. Ngâm toàn bộ hệ (thiết bị và mẫu liposom) vào bể điều nhiệt, ủ lên nhiệt độ 55oC. Mở van khí nitơ và điều chỉnh áp suất đẩy khoảng 180 psi. Tiến hành đẩy mẫu 8 lần qua màng có kích thước lỗ 400nm và 11 lần qua màng có kích thước lỗ 80nm. Mẫu sau khi hoàn thành quá trình đẩy, để ổn định 1giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó bảo quản ở 2-8oC để tiếp tục các giai đoạn tiếp theo.
2.3.1.3Giảm kích thước tiểu phân và đồng nhất hóa bằng kỹ thuật siêu âm đầu dò
Phương pháp làm nhỏ kích thước tiểu phân và đồng nhất hóa bằng kỹ thuật siêu âm đầu dò đã được xây dựng ở nghiên cứu trước đó [3].
Hệ phân tán liposom thu được sau khi hydrat hóa cho vào lọ thủy tinh, thể tích mẫu liposom khoảng 5ml. Nhúng đầu thiết bị siêu âm ngập 2/3 chiều cao mẫu. Tiến hành siêu âm với các thông số (1cycle, 100% amplitude), siêu âm trong 20 phút. Trong quá trình siêu âm lọ thủy tinh luôn được bọc nhôm tránh ánh sáng và làm lạnh bên ngoài.
2.3.1.4 Liposom hóa DOX bằng kỹ thuật gradient amonisulfat.
Quá trình này bao gồm hai bước: tạo gradient amoni sulfat; liposom hóa DOX (nạp DOX vào khoang nước của liposom).
Bước 1: Tạo gradient amoni sulfat
Để tạo chênh lệch nồng độ amoni, cần loại ion amoni ở môi trường bên ngoài liposom. Sử dụng kỹ thuật thẩm tách liên tục, trong môi trường đệm PBS pH=7.4 (công thức đệm PBS pH=7.4 trong 1L: Na2HPO4·12H2O 2.9g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8.0g, KCl 0.2g, hòa tan trong 1000ml nước cất vừa đủ [31]). Quá trình thẩm tách 24 giờ thay nước 3 lần vào các thời điểm 0 giờ, 3 giờ, 9 giờ. Thể tích đệm PBS tối thiểu gấp 100 lần thể tích mẫu liposom đem đi thẩm tách. Trong quá trình thẩm tách cần bọc giấy nhôm để tránh ánh sáng.
Bước 2 :Liposom hóa DOX
Cho hệ phân tán liposom đã loại ion amoni vào lọ thủy tinh, ủ ấm trên máy khuấy từ lên 55oC. Hòa tan trực tiếp DOX trên máy khuấy từ, tỷ lệ nạp 2mg DOX/ml liposom. Ủ ở 55oC trong thời gian thích hợp. Trong quá trình ủ, mẫu được bọc giấy nhôm tránh sáng. Sau quá trình ủ, để mẫu ổn định về nhiệt độ phòng, một phần dịch liposom được giữ lại để xác định nồng độ DOX ban đầu. Bảo quản ở 2-8oC để tiếp tục các giai đoạn tiếp theo.
2.3.1.5 Loại DOX tự do bên ngoài liposom
Loại DOX tự do bằng phương pháp thẩm tách tương tự bước tạo gradient amoni ở trên. Dịch trong túi thẩm tách là dịch liposom sau liposom hóa DOX, dịch bên ngoài là đệm PBS pH= 7.4. Tiến hành thẩm tách 24h, thay nước 3 lần vào các thời điểm 0 giờ,3 giờ và 9 giờ. Thể tích
đệm PBS tối thiểu gấp 100 lần thể tích mẫu liposom đem đi thẩm tách. Sau thẩm tách, bảo quản ở 2-8 oC.
Egg phosphatidyl cholin và cholesterol (tỷ lệ mol 7:3) Hòa tan trong chloroform
Cất quay tạo film lipid
Hydrat hóa bằng dung dịch amonisulfat 250nM
Thẩm tách trong môi trường đệm PBS pH 7.4 tạo gradient aminosulfat
Hòa tan trực tiếp DOX vào hệ phân tán liposom và tiến hành ủ thuốc
Loại DOX tự do
Bảo quản mẫu ở 2-8oC.
Hình 2.1 Sơ đồ chế tạo liposom DOX