Hoạt tính gây độc tế bào

52

Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào

STT Ký hiệu mẫu Chất

Nồng độ mẫu

(g/ml)

Dòng tế bào

Cell survival (%) Kết luận

Hep-G2 MCF7 DMSO 100,00,0 100,00,0 Chứng (+) 5 0,20,1 1,40,3 Dƣơng tính 1 LH-2-cloro 4d 5 90,80,7 92,51,1 Âm tính 2 LH-4-cloro 4b 5 _94,30,5 92,40,3 Âm tính 3 LH-methoxy 4c 5 _99,20,4 93,81,2 Âm tính 4 LH-phenyl 4a 5 _95,30,8 97,41,3 Âm tính

Kết luận: : theo kết quả ở bảng 3.8 dƣới đây thì các mẫu thử 4a-d không có hoạt tính gây độc tế bào

53

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về tổng hợp hóa học

4.1.1. Tổng hợp acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic và dẫn chất

Phản ứng tổng hợp 2a-e có hiệu suất tƣơng đối thấp là do trong phản ứng đóng vòng tạo thiazolidin từ L-cystein hydroclorid monohydrat thì phải thêm xúc tác base NaHCO₃ để chuyển dạng muối L-cystetin hydroclorid về dạng L-cystein base (dạng tự do). Khi đó L-cystein rất dễ bị oxy hóa tạo thành cystin vì vậy ảnh hƣởng rất nhiều tới hiệu suất phản ứng. Vì vậy trong quá trình phản ứng phải sục khí N₂ để loại hết khí O₂ trong môi trƣờng phản ứng để tăng hiệu suất phản ứng.

Việc kết tinh lại các chất 2a-e trong ethanol hoặc hỗn hợp aceton/nƣớc (1:1) cũng làm mất một phần sản phẩm.

Một số yếu tố có thể ảnh hƣởng đến hiệu suất của phản ứng đóng vòng:

 Tỷ lệ mol của L-cystein và enzaldehyd tƣơng ứng: phản ứng xảy ra tốt nhất khi sử dụng tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng là 1:1. Tỷ lệ mol này nhỏ hơn hay lớn hơn 1 thì hỗn hợp sau phản ứng hoặc là thừa nguyên liệu hay tạo ra nhiều sản phẩm phụ gây khó khăn trong việc tinh chế sản phẩm

 Thời gian phản ứng: Nếu thời gian phản ứng ngắn thì phản ứng diễn ra không hoàn toàn. Nếu thời gian phản ứng quá dài thì có thể tạo ra nhiều sản phẩm phụ

4.1.2. Tổng hợp acid 3-tert-butoxycarbonylthiazolidin-4-carboxylic và dẫn chất

54

Thứ nhất là các chất 2a-d rất không bền trong môi trƣờng kiềm, khi nhỏ NaOH 1N vào hỗn hợp chứa 2a-d và THF có thể làm cho phân hủy 2a-d.Để giảm sự phân hủy các chất 2a-d thì nên nhỏ từ từ NaOH đến khi tan hết 2a-d thì dừng lại.

Thứ 2 là trong quá trình tinh chế sản phẩm bằng cách kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi diethyl ether/n-hexan (1/1) cũng làm mất một phần sản phẩm.

Tỷ lệ mol của acid 2-phenylthiazolidon-4-carboxylic và Boc₂O: phản ứng xảy ra tốt nhất khi sử dụng tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng là 1:1. Tỷ lệ mol này nhỏ hơn hay lớn hơn 1 thì hỗn hợp sau phản ứng hoặc là thừa nguyên liệu hay tạo ra nhiều sản phẩm phụ gây khó khăn trong việc tinh chế sản phẩm

Thời gian phản ứng: Nếu thời gian phản ứng ngắn thì phản ứng diễn ra không hoàn toàn. Nếu thời gian phản ứng quá dài thì có thể tạo ra nhiều sản phẩm phụ.

4.1.3. Tổng hợp acid 3-benzoyl-2-phenyllthiazolidin-4-carboxylic và dẫn chất

Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất phản ứng:

 Tỷ lệ mol phản ứng: tỷ lệ mol giữa acid 2-phenyllthiazolidin-4-carboxylic tƣơng ứng và tác nhân phản ứng benzoyl clorid <1

 Nhiệt độ phản ứng: phản ứng đƣợc duy trì ở nhiệt độ <10⁰C do vòng thiazolidin không bề trong môi trƣờng kiềm, dễ bị thủy phân. Nhiệt độ phản ứng đƣợc duy trì thấp để hạn chế phản ứng thủy phân.

 Sản phẩm tạo thành 4a-4d không bền trong môi trƣờng không khí, dễ bị phân hủy hoặc polymer hóa. Vì vậy cần bảo quản sản phẩm trong điều kiện tốt

4.2. Về xác định cấu trúc

4.2.1. Về cấu trúc của các sản phẩm 3-tert-butoxycarbonyl hóa (3a, 3b, 3c, 3d) Trên phổ hồng ngoại của các sản phẩm xuất hiện các dải hấp thụ đặc trƣng cho từng nhóm chức, cụ thể nhƣ sau:

55

- Dải hấp thụ với số sóng từ 2929 – 2976 cm^-1 đặc trƣng cho liên kết C-H no của CH2 khung thiazolidin và các nhóm CH₃.

- Dải hấp thụ với số sóng từ 594 – 618 cm^-1 đặc trƣng cho liên kết C-S của nhân thiazolidin.

- Dải hấp thụ với số sóng từ 1500-1513 cm^-1 đặc trƣng cho liên kết C=C của nhân thơm.

Chất 3d cho thêm dải hấp thụ tại 3464 cm^-1 do có nhóm –OH phenol trong cấu trúc phân tử.

Đáng chú ý là trên phổ của tất cả các chất (3a-3d) quan sát thấy dải hấp thụ đặc trƣng tại vùng 2632-2643 cm-1. Điều này có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: do hiệu ứng đẩy điện tử mạnh của nhóm t-butoxy ((CH₃)₃C-O-), cặp điện tử tự do của nguyên tử nitơ vị trí số 3 của nhóm car amat sẽ ít ị giải tỏa sang nhóm car onyl, làm cho nitơ này vẫn giữ đƣợc tính ase đủ mạnh (gần nhƣ amin ậc 3) để tạo muối nội với nhóm car oxylic vị trí số 4, tạo ra liên kết N+-H với số sóng đặc trƣng tại 2632-2643 cm^-1. Điều này phù hợp với dải hấp thụ quan sát đƣợc ở sóng từ 1633 - 1638 cm^-1 - đặc trƣng cho nhóm C=O của anion car oxylat đã tạo thành. Sự tạo muối này không xảy ra khi nitơ gắn với nhóm enzoyl (nhƣ trong trƣờng hợp các chất 4a-d). Dải hấp thụ với số sóng từ 1714 – 1732 cm^-1 đặc trƣng cho nhóm C=O của car amat.

Trên phổ khối lƣợng (ESI-MS, MeOH) của 3a xuất hiện pic phân tử

[M+H]⁺ (m/z = 310,11) và [M+Na]⁺ (m/z = 332,09), phù hợp với khối lƣợng phân tử của chất này (M = 309,38), ứng với CTPT C₁₅H₁₉NO₄S. Phổ khối lƣợng ESI-MS negative của các chất còn lại (3b, 3c, 3d) cũng cho pic phân tử [M-H]- phù hợp với khối lƣợng phân tử và CTPT của chúng.

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (¹H-NMR) của sản phẩm tổng hợp có ộ tín hiệu proton phù hợp với cấu trúc của chất dự kiến 3a-3d. Kết quả phổ đã chỉ ra, sản phẩm thu đƣợc là hỗn hợp của các đồng phân RR, RS (hình 4.1). Điều này đƣợc thể hiện r ở sự xuất hiện các tín hiệu proton tại vị trí số 2 (H-2) và số 4 (H-4) của khung thiazolidin: tín hiệu của H-2 ở dạng 2 singlet đặc trƣng tại vùng 5,86- 6,11 ppm, tín hiệu của H-4 ở dạng 2 singlet tại trƣờng mạnh hơn (4,53-4,71 ppm).

56

Ngoài ra, các tín hiệu của 9 proton thuộc 3 nhóm t- utoxy cũng iểu hiện ở dạng 2 singlet (vùng 1,07-1,36 ppm) - chứng tỏ chúng không tƣơng đƣơng về từ tính, do tƣơng tác với hydro ất đối (H-2, H-4) của các dạng đồng phân.

Hình 4.1. Cấu trúc cặp đồng phân đối quang của các sản phẩm 3a-3d

Hai hydro tại vị trí số 5 (H_a-5, H_b-5) do tƣơng tác với H-4 của car on ất đối C-4 nên cho tín hiệu tách iệt tại 2 vùng: ~ 3,07 ppm và ~ 3,45 ppm, trong đó một tín hiệu của H-5 của hợp chất 3c ị che khuất ởi tín hiệu của nƣớc (3,36 ppm) lẫn trong dung môi đo phổ là DMSO-d₆. Tạp nƣớc cũng gây nhiễu tín hiệu về số lƣợng hydro (diện tích pic) tại vùng này của các hợp chất 3a-3d.

Các tín hiệu hydro của nhân thơm xuất hiện tại trƣờng đặc trƣng 7,25-7,65 ppm. Trong đó, quan sát thấy tƣơng tác ortho giữa các hydro thơm với hằng số tƣơng tác J đặc trƣng: 5,5 Hz (3c), 7,5 Hz (3b) và 8,5 Hz (3d). Đối với chất 3d, do có mặt của 2 nhóm thế trên nhân thơm tại vị trí 3’ và 4’ nên quan sát thấy sự tách iệt r rệt các tín hiệu của proton chƣa ị thế tại 6,66 ppm (H-5’), 6,90 ppm (H-2’) và 7,38-7,46 (H-6’). Ở các nhân thơm có một nhóm thế tại vị trí 4’ (3b, 3c) quan sát thấy cặp tín hiệu tƣơng đƣơng: H-3’ và 5’; H-2’ và H-6’, trong đó ảnh hƣởng của nhóm Cl (trong 3b) và nhóm OCH₃ (trong 3c) tới các tín hiệu này cũng thể hiện r trên phổ (xem bảng 3.5).

Trên phổ của 2 chất (3a, 3d) quan sát thấy tín hiệu của nhóm OH acid dƣới dạng một singlet rộng ( r. s) tại trƣờng rất yếu - 13,08 ppm.

Ngoài ra hợp chất 3d có nhóm OH phenol nên phổ đồ cho một tín hiệu singlet của tại 8,88 ppm.

Dung môi DMSO cho tín hiệu tại ~ 2,50 ppm trên các phổ.

57

Giống với các sản phẩm 3a-3d thu đƣợc ở trên, các sản phẩm 4a-4d là hỗn hợp của đồng phân RR và RS - đƣợc thể hiện ở sự xuất hiện các tín hiệu proton tại vị trí số 2 (H-2) và số 4 (H-4) của khung thiazolidin (hình 4.2). Tuy nhiên, khác iệt giữa chúng nằm tín hiệu của H-2 (và H-4) của 4a, 4b, 4c, 4d không ở dạng 2 singlet đặc trƣng, mà ở dạng một singlet rộng ( r. s), trong đó H-2 xuất hiện tại 6,02-6,23 ppm, H-4 xuất hiện tại ~ 5,17 ppm.

Hình 4.2. Cấu trúc cặp đồng phân đối quang của các sản phẩm 4a-4d

Các proton còn lại cho các tín hiệu tƣơng tự với các hợp chất 3a-3d.

Đáng chú ý là trên phổ của 4b quan sát thấy tín hiệu rất đặc trƣng của phân tử ethanol - là dung môi kết tinh sản phẩm, trong đó OCH₂ cho tín hiệu 1,24 (3H, t,

J = 7,0 Hz), còn CH₃ cho tín hiệu 3,72 (2H, q, J = 7,0 Hz), OH cho tín hiệu tại 2,79 (1H, r. s). Điều tƣơng tự xảy ra với chất 4c (kết tinh từ ethanol). Căn cứ trên tỷ lệ về số lƣợng các proton của ethanol và của 4b, 4c có thể dự đoán các chất này tồn tại ở dạng solvat với phân tử ethanol theo tỷ lệ 1:1 (mol). Ngoài ra, đối với chất 4a và

4d dung môi sử dụng kết tinh là methanol, trên phổ cho tín hiệu đặc trƣng tại ~ 3,4 ppm (OH) và 4,1-4,4 ppm (OCH₃) chứng tỏ 4a và 4d cũng có thể tồn tại ở dạng solvat với dung môi này theo tỷ lệ 1:1 (mol). Dung môi đo phổ CDCl₃ cho tín hiệu tại ~ 7,29 ppm trên các phổ, một phần gây nhiễu tín hiệu về số lƣợng proton của các nhân thơm. Proton của OH acid trong dung môi CDCl3 cho tín hiệu singlet tại 8,12 ppm (chất 4d). Dạng tồn tại solvat của các sản phẩm cũng phù hợp với kết quả quan sát đƣợc trên phổ hồng ngoại của chúng: dải hấp thụ tại vùng 3000 cm-1

(chất 4d) và 3241-3270 cm^-1 (chất 4a-c) đặc trƣng cho nhóm OH có liên kết hydro (liên phân tử acid dimer, hoặc acid-alcol).

Phổ khối lƣợng ESI-MS ở cả 2 chế độ đo (negative và possitive) của các chất

58

tử và CTPT của chúng. Trong đó, với các chất có chứa clor (4b và 4d) quan sát thấy r tỷ lệ cƣờng độ pic tƣơng ứng với tỷ lệ đồng vị 35

Cl và ³⁷Cl.

Nhƣ vậy, từ kết quả thu đƣợc trên các phổ đồ IR, MS, 1H-NMR và phân tích các dữ liệu này, chúng tôi khẳng định cấu trúc của các sản phẩm đã tổng hợp đƣợc là hoàn toàn đúng nhƣ dự kiến. Qua tra cứu tài liệu (của cơ sở dữ liệu hóa học Reaxys và SciFinder) chúng tôi nhận thấy, hợp chất 3d,4b, 4c, 4d là những dẫn chất mới.

4.3. Về hoạt tính sinh học

4.3.1. Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn

Kết quả cho thấy các chất 3c và 3d không có hoạt tính kháng khuẩn đối với các VSV kiểm định, tuy nhiên 3c và 3d lại cho có tác dụng kháng nấm rất tốt. Chất

3d kháng đƣợc cả Saccharomyces cerevisiaevàPenicilium sp.. Điều đặc biệt là chỉ

duy nhất 3d kháng đƣợc với vi nấm Penicilium sp.. Chất 3c có tác dụng chống nấm đối với 3 vi nấm là C. albicans, S. ceravisiae, A. niger.

Chất 3a và 3b có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, đều ức chế B. pumilus, P. mirabilis, S. aureus, và chất 3b còn ức chế vi khuẩn B. subtilis. Tuy nhiên khả năng kháng nấm của 3a và 3b tƣơng đối yếu . Chất 3a có tác dụng ức chế A. albicans, S.

ceravitiae. Chất 3b chỉ có tác dụng trên A. albicans.

Kết quả cho thấy khi gắn thêm nhóm thế -Cl vào nhân thơm thì hoạt tính kháng khuẩn tăng lên rất nhiều. Tuy nhiên khi gắn thêm –OCH₃ thì không còn hoạt tính kháng khuẩn nhƣng ảnh hƣớng rất nhiều tới hoạt tính kháng nấm. Đặc biệt hợp chất 3c kháng lại 3/4 vi nấm là C. albicans, S. ceravitiae, A. niger và chỉ có duy

nhất chất 3d kháng lại Penicillium sp..

4.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào

Với 4 chất (4a-d) thử hoạt tính gây độc tế ào trên tế ào ung thƣ gan và ƣng thƣ iểu mô vú đều cho kết quả âm tính

59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu đã trình ày ở trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1) Đã tổng hợp đƣợc các dẫn chất: Acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (3a) Acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-(4-clorophenyl)thiazolidin-4carboxylic (3b) Acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-(4-methoxyphenyl)thiazolidin-4-carboxylic (3c) Acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)thiazolidin-4- carboxylic (3d) Acid 3-benzoyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (4a) Acid 3-benzoyl-2-(4-cloropheny)lthiazolidin-4-carboxylic (4b) Acid 3-benzoyl-2-(4-methoxyphenyl)thiazolidin-4-carboxylic (4c) Acid 3-benzoyl-2-(2-clorophenyl)thiazolidin-4-carboxylic (4d)

2) Đã thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của các chất 3a-3d, hoạt tính gây độc tế bào in vitro chất 4a-d

 Hoạt tính kháng khuẩn: chỉ có 3a và 3b có tác dụng kháng khuẩn, trong đó chất 3b có hoạt tính tốt nhất, kháng lại 4/10 chủng VSV kiểm định đó là

Bacillus subtilis, Bacills pumilus, Proteus mirabili, Staphylococcus aureus.

 Hoạt tính kháng nấm: cả 4 chất đều có khả năng kháng nấm với VSV kiểm định, hợp chất 3d có tác dụng với 3/4 VSV kiểm định gồm Candida albicans, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae. Điều đặc biệt là chỉ có duy nhất chất 3b kháng lại Penicilium sp..

 Hoạt tính gây độc tế bào: cả 4 chất 4a-4d đều âm tính trên tế ào ung thƣ gan và ung thƣ iểu mô vú

2. KIẾN NGHỊ

Với kết quả đạt đƣợc, chúng tôi hy vọng nghiên cứu này có thể đóng góp một phần vào việc làm phong phú hơn về tổng hợp và thử tác dụng sinh học của dẫn chất acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic ở Việt Nam. Do thời gian và điều kiện

60

thử tác dụng sinh học có hạn chế, vì vậy để tiếp tục phát triển kết quả của đề tài này, chúng tôi đƣa ra một số đề xuất sau:

 Nghiên cứu thay đổi các điều kiện, cũng nhƣ các tác nhân trong các phản ứng để nâng cao hiệu suất của các dẫn chất acid 3-tert-butoxycarbonyl-2- phenylthiazolidin-4-carboxylic, acid 3-benzoyl-2-phenylthiazolidin-4- carboxylic.

 Tổng hợp các dẫn chất khác của acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic và thử hoạt tính sinh học, nhằm đánh giá sâu rộng hơn về ảnh hƣởng của cấu trúc tới hoạt tính của các dẫn chất TCA và có những định hƣớng cho việc xây dựng cấu trúc của các chất tổng hợp tiếp theo

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng i t:

1. Bộ Y tế (2007), Hóa học hữu cơ, NXB Y học, tập I, II.

2. Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ, Thƣ viện Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.

3. Phan Đình Châu (2005), Các quá trình cơ bản tổng hợp hữu cơ, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.

4. Nguyễn Khang, Nguyễn Quang Đạt (1979), Cấu trúc hóa học và tác dụng sinh v t, NXB Y học..

5. Nguyễn Đình Triệu (1995), Các phương pháp v t lý ứng dụng trong hóa học, NXB ĐHQG Hà Nội.

Tiếng Anh:

6. Alan R.Katritzky, Sandeep K.singh (2002) “Synthesis of N-subtituted Thiazolidine and Dihydro enzothiaizoles” Center for Heterocyclic compounds, 1646-16.

7. Bar er Mary, Jone J. H. (1977), “An alternative synthesis of [7-(thiazolidine-4- carboxylic acid)]-oxytocin”, International Journal of Peptide and Protein Research, 9(4), 269–271.

8. Bron Jan et al (1995), “Thiazolidine derivatives”, US 5385922.

9. Chavan S. P., Chittiboyina Amar G, Ramakrishna Guduru, et al. (2005), "An unusual stereochemical outcome of radical cyclization: synthesis of (+)-biotin",

Tetrahedron, 61(39), pp. 9273-9280.

10. Dalton J. T. et al (2009), “Discovery of 4-substituted methoxybenzoyl-aryl-thiazole as novel anticancer agents: synthesis, biological evaluation, and structure-activity relationships”, 52(6), J Med Chem.,1701-1711.

11. Dalton J. T. et al (2005), “SAR studies of 2-arylthiazolidine-4-carboxylic acid

amides: a novel class of cytotoxic agents for prostate cancer”, 15(18), Bioorg Med

Chem Lett., 4010-4043.

12. Esra Onen-Bayram F, Durmaz Irem, Scherman Daniel, et al. (2012), "A novel thiazolidine compound induces caspase-9 dependent apoptosis in cancer cells",

Bioorganic & medicinal chemistry, 20, pp. 5094-5012..