1.5.1. Phản ứng đóng vòng tạo acid thiazolidin-4-carboxylic.
Phản ứng đóng vòng tạo TCA chủ yếu đƣợc tổng hợp từ nguyên liệu L- cystetin (hoặc L-cystein hydroclorid monohydrat) và các dẫn chất enzaldehyd
17
Khuấy hỗn hợp L-cystein và enzaldehyd trong ethanol (methanol) ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc, tủa sinh ra đƣợc lọc, rửa ằng ethanol (methanol), sấy đến khô thu đƣợc chất I [29, 30, 31].
Năm 2010, Song Z. C. và cộng sự đã tổng hợp acid 2-(4-clorophenyl)-1,3- thiazolidin-4-carboxylic. Quy trình tiến hành nhƣ sau: hỗn hợp gồm L-cystein và 4- cloro enzaldehyd trong methanol đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10h. Sau phản ứng, lọc lấy chất rắn, rửa ằng diethyl ether, làm khô thu đƣợc sản phẩm, hiệu suất khoảng 90% [29, 30, 31].
1.5.1.2. Tổng hợp TCA từ L-cystein hydroclorid monohydrat và dẫn chất benzaldehyd benzaldehyd
Hòa tan L-cystein hydroclorid monohydrat và CH3COOK (NaHCO3 hoặc CH3COONa) trong nƣớc ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm từ từ enzaldehyd trong ethanol (methanol) vào dung dịch trên. Sau khi phản ứng kết thúc, tủa sinh ra đƣợc lọc, rửa, sấy thu đƣợc sản phẩm II [9, 15, 19, 20, 28].
Theo phƣơng pháp của Riemschneider và Hoyle: cho 1,2g (0,01mol) L- cystein hydroclorid monohydrat đƣợc thêm vào một hỗn hợp 1,08g (0,0105mol) enzaldehyd trong 30ml nƣớc ở PH= 8,0. Hỗn hợp phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ phòng cho đến khi kết tủa xuất hiện 30 phút. Lọc, rửa tủa thu đƣợc 1,35g chất rắn (H= 65%)
Nghiên cứu gần đây nhất, F. Esra Onen-Bayram, Irem Durmaz và cộng sự đã tổng hợp TCA từ L-cystein hydroclorid monohydrat với hiệu suất 100%.
18
Cho các hạt pellets NaOH vào L-cystein hydrochlorid monohydrate trong nƣớc. Sau khi tan hoàn toàn, cho thêm ethanol, enzaldehyd và khuấy trong 3h ở nhiệt độ phòng. Kết tủa đƣợc lọc, rửa ằng nƣớc và sấy thu đƣợc chất III.Hiệu suất phản ứng 100% [12].
1.5.1.3. Tổng hợp TCA từ L-cystein hydroclorid monohydrat và butanon
Cho 1,5g (0,0125mol) L-cystein hydroclorid monohydrat vào 22ml butan-2- on. Đun hồi lƣu hỗn hợp phản ứng trong 5h. Sau đó tiến hành lọc nóng, hầu nhƣ các cystein không tan và không phản ứng. Dịch lọc thu đƣợc đem ốc hơi dung môi, thu đƣợc 0,6g chất rắn màu trắng. Kết tinh trong utan-2-on nóng.
1.5.2.Phản ứng ester hóa tạo dẫn chất thiazolidin-4-carboxylat
Năm 1999, N.Pellegrini và các cộng sự đã tiến hành ester hóa acid thiazolidin-4-car oxylic ằng ethanol theo sơ đồ sau:
Phản ứng đƣợc tiến hành nhƣ sau: khuấy và làm lạnh hỗn hợp gồm acid thiazolidin-4-carboxylic trong ethanol khan nƣớc thêm SOCl2 hoặc H2SO4 đặc. Hỗn hợp này đƣợc đun hồi lƣu ở nhiệt độ phòng trong 10h. Sau đó cất quay thu hồi dung môi dƣới áp suất thấp, cắn thu đƣợc đem hòa tan trong nƣớc. Điều chỉnh PH ằng NaHCO3, thu đƣợc tủa. Rửa tủa ằng nƣớc sạch ta thu đƣợc hoạt chất ester [24].
Năm 2012, F. E. Onen-Bayram và cộng sự tổng hợp dẫn chất ester của TCA là 2-phenylthiazolidin-4-carboxylat ethyl ester (IV).
19
Hòa tan thionyl clorid trong ethanol ở 00C. Khuấy và thêm từ từ TCA vào dung dịch trên. Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng và khuấy trong 24h. Cất quay chân không để loại dung môi. Cắn thô đƣợc hòa tan trong CH2Cl2, rửa với dung dịch NaHCO3 ão hòa và nƣớc, làm khan ằng NaSO4. Cất quay chân không thu đƣợc chất IV. Hiệu suất 73% [12].
1.5.3. Phản ứng tạo một số dẫn chất thế của hoạt chất acid thiazolidin-4-carboxylic
1.5.3.1. Phản ứng tạo dẫn chất N-acyl của dẫn chất acid thiazolidin-4-carboxylic
Năm 2011, Yu Liu đã tổng hợp một số dẫn chất của TC. Thiazolidin-4- car oxylat đƣợc alkyl hóa với cloroacetyl clorid hoặc phenylacetyl clorid trong dung dịch NaHCO3 thu đƣợc cloroacetyl thioazidin-4-carboxylat và phenylacetyl thiazolidin-4-car oxylat. Để tạo ra dẫn chất aminoacetyl thiazolidin-4-carboxylat, tiến hành amin hóa acid cloroacetylthioazidin-4-carboxylic [35].
Điều kiện: 1. ClCH2COCl, NaHCO3/H2O
2. NH2.H2O; Boc2O, THF; HCl/EtOAc 3. PhCH2COCl, NaHCO3/H2O
Năm 1983, Iwao Junichi và cộng sự đã tổng hợp acid 2-phenylthiazolidin-4- carboxylic và các dẫn chất. Sơ đồ nhƣ sau :
20
Acid thiazolidin-4-car oxylic trên và một loại ase (muối car onat, TEA, amoniac...) hòa tan trong dung môi thích hợp, làm lạnh hỗn hợp phản ứng ằng nƣớc đá. Cho dần acyl clorid vào ình phản ứng, sau đó khuấy tiếp phản ứng ở nhiệt độ thƣờng trong 1h, phản ứng tạo ra dẫn chất của acid 2-phenylthiazolidin-4- carboxylic đã thế ở vi trí N-3 [15].
Năm 1995, Bron Jan và cộng sự đã thành công trong việc tổng hợp acid 2- phenylthiazolidin-4-carboxylic và các dẫn chất ằng phản ứng acyl hóa với tác nhân là anhydrid acetic. Sơ đồ nhƣ sau:
Cho acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic và muối car onat vào trong nƣớc, khuấy cho tan hết. Làm lạnh ên ngoài ình phản ứng ằng nƣớc đá, rồi cho dần anhydrid acetic vào, sau đó khuấy tiếp phản ứng ở nhiệt độ thƣờng trong 1h, giữ pH của phản ứng khoảng 8-9. Kết thúc phản ứng, điều chỉnh pH =1 ằng acid sulfuric loãng. Tủa sinh ra đem lọc rửa, kết tinh lại trong hỗn hợp ethyl acetat/ether dầu hỏa = 6:8 [8].
Phản ứng thế ở vị trí N-3 còn đƣợc D. Miller và cộng sự [21, 22, 32] đi từ dẫn chất amid của acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic, sơ đồ nhƣ sau:
21 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Năm 2010, Song Z. C. và cộng sự đã tổng hợp acid 3-(tert-butoxycarbonyl)- 2-(4-clorophenyl)-1,3-thiazolidin-4-carboxylic. Sơ đồ nhƣ sau :
Acid 2-(4-clorophenyl)thiazolidin-4-carboxylic đƣợc hòa tan trong hỗn hợp NaOH 1N và 1,4-dioxan, nhiệt độ phản ứng là 0oC. Di-tert- utyl dicar onat đƣợc thêm vào chậm, sau đó phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ thƣờng trong khoảng 6h. Hỗn hợp phản ứng đƣợc cô ở áp suất giảm và chiết ằng ethyl acetat. Pha nƣớc đƣợc điều chỉnh đến pH=4 ằng HCl 1N, sau đó chiết ằng ethyl acetat, làm khan và cất quay [29, 31].
Năm 2011, Shi F và cộng sự đã tổng hợp acid 2-phenyl thiazolidin-4- car oxylic và các dẫn chất. Sơ đồ nhƣ sau :
FDFDFDFDFDFDFDFDFFR1= ClCH2 ; C6H5CH2
R = H ; 2-NO2
= 2-COOH; 4-CN
= 2-OH-3-OCH3; 2-OH
Cho acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic và NaHCO3 vào trong nƣớc, khuấy đều cho tan hết. Acyl clorid đƣợc thêm vào, khuấy ở nhiệt độ thƣờng. Điều chỉnh pH tới 8-9, sau đó chiết ằng DCM. Pha nƣớc đƣợc acid hóa về pH khoảng 2- 3, rồi chiết ằng DCM. Pha hữu cơ đƣợc làm khô, cất quay, đƣợc sản phẩm thô [27].
1.5.3.2. Phản ứng tạo dẫn chất thế amid của dẫn chất acid thiazolidin-4-carboxylic carboxylic
Năm 2009, Wang Zhao và cộng sự đã tổng hợp acid 2-phenylthiazolidin-4- carboxylic và các dẫn chất. Sơ đồ nhƣ sau :
22
Acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic đƣợc hòa tan trong hỗn hợp NaOH 1N và 1,4-dioxan,nhiệt độ phản ứng là 0o
C.Di-tert- utyl dicar onat đƣợc thêm vào từ từ, sau đó phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt độ thƣờng trong khoảng 1h. Hỗn hợp phản ứng đƣợc cô ở áp suất giảm và chiết ằng ethyl acetat. Pha nƣớc đƣợc điều chỉnh đến pH=4 ằng HCl 1N hoặc dung dịch KHSO4 5%, sau đó chiết ằng ethyl acetat, làm khan và cất quay. Chất rắn thu đƣợc lúc này có nhóm -NH đã đƣợc ảo vệ. Hỗn hợp chứa chất rắn này và EDC, HOBt trong CH2Cl2 đƣợc khuấy khoảng 10 phút ở nhiệt độ thƣờng. Sau đó cho vào ình phản ứng hỗn hợp TEA, 3,4,5- trimethoxyanilin, khuấy tiếp 6-8 h. Hỗn hợp phản ứng đƣợc pha loãng ằng CH2Cl2, sau đó rửa ằng nƣớc. Loại ỏ dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc chất dạng dầu. Nó đƣợc khuấy với TFA/CH2Cl2 ở nhiệt độ thƣờng để có tách nhóm ảo vệ Boc2O. Hỗn hợp phản ứng đƣợc cô lại, rửa, làm khô. Loại đi dung môi ta thu đƣợc tủa thô, chúng đƣợc tinh chế ằng sắc kí cột [21, 22, 34].
Năm 2007, Miller và cộng sự đã tổng hợp acid 2-phenylthiazolidin-4- carboxylic và các dẫn chất. Quy trình tạo amid này của acid 2-phenylthiazolidin-4- carboxylic và dẫn chất thực hiện giống các ƣớc mà Wang Zhao và cộng sự đã thực hiện. Tuy nhiên, Miller không dùng TEA và amin sử dụng là các alkyl amin có mạch C no [21, 22, 34]. Sơ dồ nhƣ sau:
a) Boc2O, NaOH 1N, 1,4- dioxan, H2O
(b) EDC, HOBt, TEA, 3,4,5-trimethoxyanilin (c) TFA, CH2Cl2 R = H, 3-OH, 4-CH3O, 4- NHCOCH3 = 3,4-diCH3O, 4-F, 4-Br, 4- NO2, 4-CH3 R1= C7H15, C17H35, C18H37
23
CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
Khóa luận đã sử dụng nguyên vật liệu và thiết ị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dƣợc - Bộ môn Công nghiệp Dƣợc, ao gồm:
Bảng 2.1: Danh mục các nguyên liệu
STT Tên hóa chất Xuất xứ
1 L-Cystein hydroclorid monohydrat Việt Nam
2 Anhydrid acetic Merck
3 Benzaldehyd Merck
4 Tosyl chlorid Merck
5 Acid cloroacetic Trung Quốc
6 Acid hydrocloric Trung Quốc
7 Acid sulfuric Trung Quốc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
8 Natri hydrocarbonat Trung Quốc
9 Kali carbonat khan Trung Quốc
10 Nƣớc cất Việt Nam
11 Ethyl acetat Trung Quốc
12 Methanol Trung Quốc
13 Ethanol Trung Quốc
14 Aceton Trung Quốc
15 Cloroform Trung Quốc
16 DMF Trung Quốc
17 Dicloromethan Trung Quốc
24
Bảng 2.2: Danh mục các thiết bị, dụng cụ
STT Thiết ị, dụng cụ Xuất xứ
1 Sinh hàn hồi lƣu Đức
2 Bình cầu 250 ml, 100 ml Đức
3 Bình phun, ình sắc kí Trung Quốc
4 Bản mỏng silicagel GF254 Đức
5 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc
6 Phễu lọc Buchner Trung Quốc
7 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Đức
8 Máy cất quay Buchi B480 Thụy Sĩ
9 Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S Thụy Sĩ
10 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ
11 Tủ sấy Memmert Đức
12 Máy sấy đèn hồng ngoại Đức
13 Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer Mỹ
14 Máy đo phổ hƣởng từ hạt nhân proton (
1
H-NMR)
Bruker AV-500 Mỹ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
15 Máy đo phổ khối lƣợng Agilent 6310 Ion Trap Mỹ
2.2. Nội dung nghiên cứu
– Tổng hợp các dẫn chất acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (2a-e), dẫn chất acid 3-tert-butoxycarbonyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (3a-d) và dẫn chất acid 3-benzoyl-2-phenylthiazolidin-4-carboxylic (4a-d) có cấu trúc hóa học nhƣ sau:
25
– Xác định cấu trúc của các chất 3a-d, 4a-d tổng hợp ằng cách đo phổ hồng ngoại, phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton.
– Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm in vitro của các chất 3a-d, thử tác dụng gây độc tế ào của các chất 4a-d
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết
– Sử dụng các phƣơng pháp tổng hợp hóa học, dựa trên phản ứng:
Phản ứng đóng vòng tạo acid 2-phenylthiazolidin-4-carboxylic.
Phản ứng tạo dẫn chất thế ở vị trí N3: N-acyl hóa
– Dùng sắc kí lớp mỏng để theo d i quá trình tiến triển của phản ứng. Soi đèn tử ngoại ở ƣớc sóng 245nm để nhận iết đƣợc vết sắc ký
– Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm ằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.2. Xác định cấu trúc
26
Phổ IR: tại phòng phân tích cấu trúc phân tử Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các chất đã đƣợc ghi phổ hồng ngoại trên máy với kỹ thuật viên nén KBr ghi trong vùng 4000-400cm-1.Các mẫu rắn đƣợc phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dƣới dạng film mỏng dƣới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm [2].
Phổ MS: Máy đo phổ khối lƣợng 1100 Series LC/MSD Trap Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyên tắc chung của phƣơng pháp phổ khối lƣợng là dùng các electron mang năng lƣợng cao bắn phá phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích dƣơng hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc. Các ion đƣợc phân tách rồi đƣợc ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối lƣợng/điện tích (m/ze) của chúng. Vì xác suất tạo thành ion có z>1 là rất nhỏ và vì điện tích của 1 electron không đổi nên thông thƣờng m/ze chính là khối lƣợng của ion [5].
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) đƣợc ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.3. Thử tác dụng sinh học
2.3.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn
a. Các chủng vi sinh vật kiểm định do bộ môn Vi sinh - Sinh học, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội cung cấp.
Vi khuẩn Gram(-)
Escherichia coli ATCC 25922 (EC)
Proteus mirabilis BV 108 (Pro)
Shigella flexneri DT 102 (Shi)
Salmonella typhi DT 220 (Sal)
Pseudomonas aeruginosa VM 201 (P.A)
Vi khuẩn Gram(+)
Staphylococus aureus ATCC 1128 (Sta)
Bacillus pumilus ATCC 10242 (Bp) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
27
Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc)
Sarcina lutea ATCC 9341 (SL)
Kháng sinh đối chứng: Streptomycin: 14µg/ml Penicillin: 27 UI/ml
. Môi trƣờng thử nghiệm
Môi trƣờng canh thang nuôi cấy VK kiểm định:
NaCl 0,5% ; pepton 0,5% ; cao thịt 0,3 % ; nƣớc vđ 100ml. _ Môi trƣờng thạch thƣờng :
NaCl 0,5% ; pepton 0,5% ; cao thịt 0,3 % ; thạch 1,6% ; nƣớc vđ 100ml.
c. Phƣơng pháp thử (Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán). Nguyên tắc: mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) đƣợc đặt lên lớp thạch dinh dƣỡng đã cấy VSV kiểm định, hoạt chất từ mẫu khuếch tán vào môi trƣờng thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Đánh giá dựa trên đƣờng kính vòng vô khuẩn và đƣợc đánh giá theo công thức. 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D: Đƣờng kính trung bình vòng vô khuẩn (mm)
i
D : Đƣờng kính vòng vô khuẩn thứ i (mm) s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n : số thí nghiệm làm song song (n = 3)
2.3.3.2. Hoạt tính kháng nấm
a. Các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội cung cấp
Vi Nấm: Candida albicans (Ca) Saccharomyces cerevisiae (Sa) Aspergillus niger (As)
Penicilium sp. (Pe)
28 . Môi trƣờng kiểm nghiệm
Môi trƣờng Sabouraud lỏng nuối cấy C. albicans: Pepton 1,0% ; glucose 2,0 %; nƣớc vđ 100ml Môi trƣờng thử nghiệm Sabouraud:
Pepton 1,0% ; glucose 2,0 %; thạch 1,6%; nƣớc vđ 100ml
c. Phƣơng pháp thử (Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán) Nguyên tắc: mẫu thử (khoanh giấy lọc đƣợc tẩm hoạt chất thử) đƣợc đặt lên lớp thạch dinh dƣỡng đã cấy VSV kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trƣờng thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô nấm.
Đánh giá kết quả: Dựa vào đƣờng kính vòng vô nấm và đƣợc đánh giá theo công thức: 2 1 1 ( ) 1 n n i i i i D D D D s n n
D: Đƣờng kính trung bình vòng vô khuẩn (mm)
i
D : Đƣờng kính vòng vô khuẩn thứ i (mm) s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n : số thí nghiệm làm song song (n = 4)
2.3.3.3. Thử tác dụng chống ung thư
Phép thử chống tế ào ung thƣ đƣợc thực hiện tại Phòng sinh học thực nghiệm- Viện hóa học các hoạt chất thiên nhiên- Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam
Phƣơng pháp phân tích: Theo phƣơng pháp của Skehan & CS (1990) và Likhiwitayawuid & CS(1993) hiện đang đƣợc áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thƣ Quốc gia của Mỹ (NCI) và trƣờng đại học Dƣợc, đại học Tổng hợp Illinois,
Chicago, Mỹ.
Dòng tế bào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
29
Dòng MCF7: Ung thƣ iểu mô vú
Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dul ecco’s Modified Eagle Medium)
hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt)
Có ổ xung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)
Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic.
Các dụng cụ dùng 1 lần: Bình nuôi cấy tế ào, phiến vi lƣợng 96 giếng, pipet
pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…
Chất chuẩn chứng dương tính:
Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế ào: Ellipticine, Vin lastine hoặc Taxol pha trong DMSO
- Đọc trên máy ELISA ở ƣớc sóng 495-515nm
Tính kết quả:
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế ào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo đƣợc của chúng OD (ngày 0),