Địa điể m Thời gian nghiên cứu - Cám gạo

a. Cám gạo

3.1.1. Địa điể m Thời gian nghiên cứu

Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử

Thực vật, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ; DNTN Nấm Việt (Tổ 16, khuc vực Bình Trung, đường Võ Văn Kiệt, Quận Bình Thủy, Thành phố (Tp) Cần Thơ).

Thời gian: Đề tài thực hiện từ tháng 8/2013 - tháng 11/2013. 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu

a.Vật liệu

Giống nấm thuần Bào Ngư Xám Nhật (Pleurotus sajor-caju) và mạt cưa cao su (thu mua tại Bình Phước) được cung cấp từ DNTN Nấm Việt.

Cám gạo và bột bắp được thu từ cơ sở thức ăn gia súc Hồng Phúc, đường 30/4 quận Ninh Kiều. Bã đậu nành thu mua từ hộ gia đình sản xuất đậu hủ, đường 3/2, quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ. Bã bia được phòng thí nghiệm cung cấp (thu mua tại Nhà máy bia Phong Dinh, đường 3/2, Quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ).

Vôi (CaCO3), DAP thu mua tại đại lý bảo vệ thực vật Hoàng Nguyễn, phường Long Hòa, quận Bình Thủy, Tp Cần Thơ.

Hình 4. Các chất dinh dƣỡng bổ sung

DAP Bột bắp

Cám gạo

b.Thiết bị - dụng cụ

Thiết bị vô cơ mẫu Foss, thiết bị chưng cất đạm Kjeltac 2300, lò nung cao độ Nabertherm (Đức), tủ sấy, tủ cấy, nồi khử trùng, lò khử trùng, ống nghiệm, đĩa petri, chai thủy tinh, kẹp, que cấy, dao cấy, bình hút ẩm, cân điện thử, cân đồng hồ, nút nhựa, bông, giấy, thun,…

c. Hóa chất

HCl, H2O2 30%, HNO3,H2SO4 đậm đặc, H3BO3,H2SO4 0.1N, NaOH 30%, HCl 1M, NaOH 1M, HCl đậm đặc, Bromocresolgreen, Metyl đỏ,...

3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

3.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của chất dinh dƣỡng hữu cơ bổ sung đến sự phát triển và chất lƣợng của nấm

Mục đích: Xác định tỷ lệ dinh dưỡng (cám gạo, bột bắp, bã đậu nành, bã bia,

DAP) bổ sung tối ưu nhất cho năng suất nấm cao và chất lượng tốt.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo bảng 12. Thí nghiệm 1 nhân tố: cơ

chất và 6 mức bổ sung chất dinh dưỡng. Với 3 lần lặp lại và mỗi lần là 6 bịch phôi. Tổng cộng có 108 đơn vị thí nghiệm

Bảng 12. Bảng bố trí thành phần dinh dƣỡng bổ sung vào cơ chất mạt cƣa cao su

Cơ chất Nghiệm thức Dinh dƣỡng bổ sung

Mạt cƣa cao su

Đối chứng (-) Không bổ sung dinh dưỡng

Đối chứng (+) 4% cám gạo + 2% bột bắp + 0,2% DAP 1 2% cám gạo + 1% bã đậu nành + 0,2 % DAP 2 2% cám gạo + 2% bã bia

3 1% bã đậu nành + 1% bã bia

4 3% bã bia

Quy trình trồng nấm Bào Ngư Xám Nhật (P.sajor-caju) do DNTN Nấm Việt cung cấp theo quy trình của Lê Duy Thắng (2006) có chỉnh sửa.

Quy trình thực hiện:

Hình 5. Quy trình trồng nấm Bào Ngƣ Xám Nhật

(* Nguồn: Quy trình của Lê Duy Thắng (2006) có điều chỉnh)

Để nuôi trồng nấm Bào Ngư Xám (Pleurotus sajor-caju) cần phải có giống nấm, giống nấm bao gồm tất cả các dạng mang sinh khối của loài nấm Bào Ngư Xám

(Pleurotus sajor-caju).

Các bƣớc tiến hành: Theo quy trình của Lê Duy Thắng (2006) có điều chỉnh. a. Chuẩn bị giống cấp 1

Cấy giống đã phân lập (giống thuần) lên môi trường lúa ủ ở 28 – 30oC để sợi tơ phát triển trên môi trường tạo thành giống cấp 1.

Tùy theo các loài nấm khác nhau mà thành phần dùng để nhân giống cấp 1 cũng khác nhau, ở đây ta chọn môi trường lúa là môi trường dùng để nhân giống nấm Bào Ngư Xám Nhật (Pleurotus sajor-caju).

Mạt cưa xử lý với nước vôi 1%, tỉ lệ nước vôi với cơ chất

là 3:2 Giống thuần Giống cấp 1 Ủ đống mạt cưa 1 ngày Giống cấp 2 Đóng bịch , khử trùng 950C trong 10h Tưới đón quả thể Cấy giống vào bịch

phôi

Thu Nấm

- 1kg lúa đem phơi khô rồi nấu đến khi hạt lúa vừa nở. Sau đó phơi hoặc sấy khô đến độ ẩm thích hợp rồi bổ sung bột bắp với tỷ lệ 2% so với lúa, cho hỗn hợp vào chai thủy tinh, khử trùng ở 121oC trong 90 phút, lấy ra để nguội.

- Bước tạo giống cấp 1 được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Que cấy inox được khử trùng trên lửa đèn cồn nhiều lần rồi cho vào ống nghiệm cắt từng mẫu agar có chứa giống gốc (giống thuần đã phân lập). Sau đó chuyển vào chai đã chuẩn bị ở trên. Đem ủ ở nhiệt độ 26 – 28oC cho đến khi sợi tơ nấm phát triển tốt và lan sâu vào môi trường hạt thóc tạo thành giống cấp 1.

b. Chuẩn bị giống cấp 2

Môi trường được sử dụng để nhân giống nấm Bào Ngư Xám Nhật (Pleurotus sajor-caju) là môi trường que khoai mì. Vì ở môi trường này tơ nấm phát triển nhanh

và tuổi meo đồng đều hơn so với môi trường hạt. Thao tác cấy đơn giản.

Thân cây khoai mì được gọt sạch vỏ, cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 10cm, chẻ đôi (đối với những cây lớn thì chẻ làm bốn), phơi khô. Sau đó đem nấu với vôi cho sôi (tỉ lệ 1% vôi so với khối lượng que khoai mì ban đầu, thời gian đun khoảng 4 giờ), để qua đêm, vớt ra, rửa sạch và để ráo nước. Sau đó bổ sung thêm 1% đường pha chung với nước và tưới cho đều đủ độ ẩm, bổ sung thêm 2% cám gạo. Cho hỗn hợp vào chai nước biển, đậy bằng nút gòn và đậy phủ đầu chai lại bằng giấy báo, sau đó đem khử trùng ở 121oC trong 90 phút. Sau khi khử trùng xong lấy ra để nguội và quan sát sự nhiễm vi sinh vật ở các chai sau 2 - 3 ngày, loại bỏ các chai đã bị nhiễm.

Bước tạo giống cấp 2 được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Dùng muỗng inox nhỏ khử trùng thật kỹ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội và múc khoảng 3 muỗng giống cấp 1 (từ môi trường lúa đã thực hiện từ bước trên và đã lên tơ hoàn chỉnh) cho vào chai chứa que khoai mì đã được chuẩn bị, đậy bằng nút gòn và đậy phủ đầu chai lại bằng giấy báo. Ủ ở nhiệt độ từ 26 – 28oC cho đến khi sợi nấm phát triển tốt và trắng cả chai khoai mì tạo thành giống cấp 2, quan sát và loại bỏ các chai bị nhiễm.

c. Sản xuất bịch phôi Xử lý nguyên liệu Xử lý nguyên liệu

Mạt cưa cao su được ủ đống với 1% nước vôi trong 1 ngày. Sau đó phối trộn dinh dưỡng theo bảng 12 và cho vào đầy bịch nylon, bịch phôi phải được đóng sao cho có độ rắn vừa phải (khoảng 1,2kg cơ chất ướt, ẩm 40 - 60%), đậy nút bông và giấy

báo, sau đó đem khử trùng ở 92- 980C trong 10 giờ.

Cấy vào bịch phôi

Bịch phôi sau khi khử trùng để nguội 1 ngày, sau đó tiến hành cấy giống cấp 2, giống cho vào mỗi bịch phôi 1 que khoai mì, dùng bông gòn không thấm (đã được khử trùng) đốt trên đèn cồn đậy lại.

d. Kỹ thuật trồng và chăm sóc nấm Điều kiện nhà trồng: Điều kiện nhà trồng:

Nhà trồng nấm phải sạch sẽ, cao ráo, thoáng khí, thoát nước và giữ được độ ẩm. Tùy mỗi loại nấm mà có khoảng nhiệt độ và độ ẩm thích hợp khác nhau. Ngoài ra, khoảng nhiệt độ và độ ẩm của từng loài nấm cũng khác nhau trong từng giai đoạn sinh trưởng của nấm. Tuy nhiên, nhìn chung thì nhiệt độ thích hợp của nhà trồng nấm Bào Ngư Xám khoảng 25 – 30oC, độ ẩm 75 - 90% (Kalberer, 1976), phải bảo đảm thoáng khí cho nhà trồng và ánh sáng nhẹ để hệ sợi nấm phát triển tốt. Điều kiện nhà trồng ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm cũng như năng suất nấm. Xử lý nhà trồng nấm bằng vôi bột (100g/m2) trước khi đưa bịch phôi vào nhà trồng. Các bịch phôi nấm được đặt trên kệ.

Trồng và chăm sóc nấm:

Khi chuyển bịch phôi vào nhà trồng không được tháo nút bông và không được tưới nước trực tiếp vào bịch phôi. Chỉ tưới nước dưới nền để giữ độ ẩm không khí (khoảng 3 lần/ngày tùy vào điều kiện thời tiết bên ngoài). Quan sát vài ngày đến khi hệ sợi nấm phát triển tốt và lan khắp khối cơ chất (kéo tơ có màu trắng đồng nhất), đồng thời không bị nhiễm nấm mốc hay tạp khuẩn thì tiến hành tưới rửa bịch phôi và tháo nút bông ở cổ chai, rạch bịch ở những chổ phát hiện có nụ nấm (thường ở đáy bịch). Sau 2 ngày tưới phun sương nhẹ và tưới 2 lần trên 1 ngày, khoảng 4 - 5 ngày sau tưới 3 lần trên ngày. Khi quả thể nấm bắt đầu xuất hiện, tưới nước phun sương nhẹ bên ngoài mặt túi và nền để tạo độ ẩm không khí. Thông thường có thể tưới nước 2 - 3 lần/ngày.

e. Nhận biết bịch phôi nhiễm nấm lúc trồng

Các bịch phôi bị nhiễm nấm mốc (mốc vàng hoa cau, mốc xanh, mốc đen, mốc trắng, nấm nhày,…) hoặc tạp khuẩn có thể quan sát được bằng mắt thường, không được tháo nút bông ra mà phải loại các bịch này ra khỏi nơi trồng để tránh lây nhiễm

cho các bịch khác.

f. Thu hoạch nấm

Đối với nấm bào ngư xám khi nấm chuyển tử dạng phễu sang dạng lá thì tiến hành thu hoạch, dùng tay nắm lấy phần cuống nấm kéo nhẹ và lấy hết cả chân nấm. Sau khi thu hoạch xong phải loại bỏ hết phần chân nấm còn sót lại trên bịch phôi để nấm có thể ra quả thể tốt hơn ở các lần tiếp theo.

Năng suất của lần sau sẽ không bằng lần trước trên cùng một bịch phôi (quả thể ra nhỏ hơn, sản lượng và khối lượng ít hơn).

g. Các chỉ tiêu theo dõi và phƣơng pháp đánh giá

 Ghi nhận và so sánh số ngày tơ lan khắp khối cơ chất và thời gian thu hoạch (quả thể ở dạng lá) giữa các nghiệm thức (NT).

 Theo dõi, ghi nhận ngày cấy giống vào bịch phôi và ủ. Theo dõi sự phát triển của tơ nấm hằng ngày, ghi nhận độ lan tơ bằng cách đo chiều dài sự lan tơ quanh khối cơ chất (đo từ cổ bịch phôi trở xuống đáy) ở 2 giai đoạn 14 và 21 ngày sau khi cấy.

 Ghi nhận thời gian tơ nấm lan trắng hoàn toàn bịch phôi và thời gian bắt đầu thu hoạch nấm ở mỗi nghiệm thức (tính từ ngày cấy giống vào bịch phôi) từng ngày.

 Ghi nhận năng suất đợt 1, 2,... so sánh năng suất và tính hiệu suất sinh học giữa các nghiệm thức.

 Thu hái nấm và ghi nhận kết quả cân trọng lượng quả thể ở mỗi bịch phôi của từng nghiệm thức hàng ngày.

 Tính hiệu suất sinh học (Biological Efficiency _B.E) (Chang et al., 1981):

Hiệu suất sinh học (B.E) = 100 x

Trọng lượng tươi của nấm (g) Trọng lượng tươi của nấm (g)

 Hiệu quả kinh tế.

 Hiệu quả kinh tế (lợi nhuận) = Năng suất nấm x Giá thành – Tổng chi phí

 Chất lượng nấm: Nấm được thu hoạch vào lúc sáng sớm, trước khi tưới nấm sau đó khảo sát một số chỉ tiêu như:

 Độ ẩm (Phụ lục 2)

 Hàm lượng protein tổng (Phụ lục 2)

 Hàm lượng tro (Phụ lục 2)

3.2.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm excel để xử lý số liệu và phần mềm Minitab 16 để xử lý thống kê.

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Ảnh hƣởng của chất dinh dƣỡng bổ sung đến sự phát triển của tơ nấm bào ngƣ xám Nhật. ngƣ xám Nhật.

4.1.1. Độ lan tơ của nấm sau khi cấy

Bảng 13. Chiều dài tơ lan của nấm bào ngƣ xám ở các giai đoạn khảo sát (kể từ ngày cấy phôi)

Giai đoạn khảo sát Nghiệm thức

Chiều dài tơ lan (cm)

14 21 ĐC (-) 2,36c 5,10b ĐC (+) 2,62b 5,15b 1 2,79b 5,74ab 2 2,62b 5,11b 3 2,85b 5,70ab 4 3,14a 6,30a

Ghi chú: ĐC (-)= Nghiệm thức đối chứng không bổ sung dinh dưỡng; ĐC (+)= Nghiệm thức đối chứng có bổ sung dinh dưỡng 4% cám gạo + 2% bột bắp + 0,2% DAP; 1= Nghiệm thức bổ sung 2% cám gạo + 1% bã đậu nành + 0,2% DAP; 2= Nghiệm thức bổ sung 2% cám gạo + 2% bã bia; 3= Nghiệm thức bổ sung 1% bã đậu nành + 1% bã bia; 4= Nghiệm thức bổ sung 3% bã bia. Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau thể hiện khác biệt không có ý nghĩa, các ký tự theo sau khác nhau thể hiện khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95%.

Kết quả Bảng 13 và Bảng 24 (Phụ lục 4) cho thấy chiều dài tơ lan của nấm Bào Ngư Xám Nhật ở giai đoạn 14 ngày khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% giữa các nghiệm thức (NT) có bổ sung dinh dưỡng với nghiệm thức đối chứng (ĐC) (-) không bổ sung dinh dưỡng. Nguyên nhân là do các chất dinh dưỡng bổ sung vào cung cấp đạm, điều chỉnh C/N về mức thích hợp nhất cho nấm phát triển (khoảng 20) và kết quả nghiên cứu của Gibriel et al. (1996) và Rehana et al. (2007) cũng nhận định: môi trường dinh dưỡng có đường và vi lượng sẽ giúp khuẩn ty nấm phát triển tốt và cho tiềm năng năng suất cao. Nghiệm thức 4 khác biệt có ý nghĩa các nghiệm thức có bổ sung dinh dưỡng khác. Điều này có thể do ngoài việc cung cấp đạm để điều chỉnh C/N về mức thích hợp, các thành phần dinh dưỡng khác (vitamin, đường, khoáng, protein,...) có trong bã bia nhiều hơn bã đậu nành, cám gạo, bột bắp, DAP góp phần cho sự phát triển tốt hơn của tơ nấm. NT 3, NT 2, NT 1, ĐC (+) khác biệt không có ý nghĩa thống kê là do nấm sử dụng các chất dinh dưỡng bổ sung ở các nghiệm thức gần như nhau.

Ở giai đoạn 21 ngày, nghiệm thức 4 khác biệt có ý nghĩa thông kê (độ tin cậy 95%) với nghiệm thức ĐC (-), ĐC (+), NT 2. Nguyên nhân có thể là do bã bia chứa

nhiều chất vi lượng cần thiết cho sự phát triển của tơ nấm và lượng bổ sung khá cao. NT 3, NT 1, NT 2, ĐC (+) khác biệt không ý nghĩa với ĐC (-) có thể là do ở khoảng giai đoạn khảo sát này đã đủ thời gian cho nấm phân giải cellulose của cơ chất tạo nguồn dinh dưỡng cho nấm phát triển, bên cạnh cám gạo chứa nhiều lipid ngăn cản sự phát triển của tơ nấm (Dhandha et al., 1995). Tuy nhiên ĐC (-) tơ chạy khá nhanh nhưng tơ rất mỏng, ít bào tử hơn các nghiệm thức khác.

4.1.2. Tơ lan kín khối cơ chất theo thời gian

Bảng 14. Tỷ lệ số bịch phôi có tơ nấm phát triển lan khắp khối cơ chất theo thời gian (đơn vị tính: %)

Ngày Nghiệm thức Bịch phôi (%) 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 ĐC (-) - - 20 33 40 77 77 90 90 93 100 ĐC (+) - 13 20 30 37 60 73 73 80 87 100 1 3 13 23 33 47 60 67 67 80 87 100 2 3 13 20 27 33 53 67 73 80 90 100 3 7 23 33 50 63 67 73 73 80 90 100 4 10 30 67 83 90 100

Qua Bảng 14 cho thấy tơ nấm phát triển tốt ở các nghiệm thức có bổ sung nguồn dinh dưỡng cám gạo, bột bắp, bã đậu nành và bã bia. Tơ phát triển tốt và thời gian tăng trưởng nhanh nhất là ở NT 4, kế đến là NT 3, kế tiếp là NT 2, NT 1, ĐC (+) và thấp nhất là nghiệm thức ĐC (-) không bổ sung dinh dưỡng. Nguyên nhân là do bã bia chứa chất khoáng, vitamin nhiều hơn các chất dinh dưỡng khác, nguyên liệu cám gạo ban đầu có chứa lipid nhiều hơn bã bia, bã đậu nành, bột bắp nên đã ngăn cản sự phát triển của tơ nấm (Dhandha et al., 1995), nên nguồn dinh dưỡng bã bia, bã đậu nành tốt cho sự phát triển của tơ nấm. Theo Lê Minh Châu (2010) đường glucose, vitamin và các chất khoáng,... là những yếu tố thúc đẩy tơ nấm phát triển. Ở nghiệm thức ĐC (+) có lượng đường khá lớn tốt cho tơ nấm phát triển sản sinh nhiều enzyme để thủy phân các hợp chất cao phân tử của cơ chất tạo nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là đường), tuy nhiên khi lượng đường tạo ra nhiều hơn nhu cầu của nấm sẽ ức chế lại sự phát triển của tơ nấm nên thời gian sau tơ tăng trưởng chậm lại chỉ nhanh hơn nghiệm thức đối chứng không bổ sung dinh dưỡng. Tơ nấm lúc đầu chủ yếu là lan nhanh ở phần xung quanh

bên ngoài vì vùng này nhiều oxy hơn, những ngày sau tơ nấm dần lan sâu bên trong để có thêm dinh dưỡng cho sự phát triển, lượng oxy ít dần nên tốc độ tơ lan chậm lại. Như vậy, để rút ngắn thời gian tơ lan khắp khối cơ chất thì NT 4 (bổ sung 3% bã bia)