- Môi trờng lên men chìm: + Môi trờng Sabouraud
3.2.2.2. Phơng pháp xác định đặc điểm hình thái, hình dạng bào tử, sợi khí sinh và cuống phát sinh bào tử của các chủng nấm Metarhizium (M4, M5)
sinh và cuống phát sinh bào tử của các chủng nấm Metarhizium (M4, M5)
- Nuôi và quan sát khuẩn lạc của hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) trên môi tr- ờng Czapek-Dox có hai giai đoạn.
+ Thứ nhất: Cấy chấm bào tử của hai chủng Metarhizium (M4; M5) lên đĩa petri theo dõi và quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc (màu sắc, kích thớc, tốc độ phát triển...) của khuẩn lạc hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5).
+ Thứ hai: Quan sát bào tử, sợi khí sinh của khuẩn lạc dới kính hiển vi đợc thực hiện bằng cách cấy gạt bào tử lên đĩa petri. Sau đó 4 ngày cắm lamen lên đĩa petri vừa gạt nghiêng một góc 45o so với mặt thạch, sau 2 ngày lấy lamen đem soi dới
kính hiển vi và quan sát đặc điểm hình thái của bào tử, sợi khí sinh của hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5).
- Theo dõi sự sinh trởng, phát triển, phát sinh bào tử và đếm bào tử của nấm của hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) trên các môi trờng với các điều kiện ta cần xác định từ đó xác định môi trờng, thòi gian, lợng mẫu thích hợp.
Có hai phơng pháp đếm bào tử là đếm trực tiếp trên kính hiển vi và đếm gián tiếp bằng phơng pháp pha loảng bào tử sau đó cấy lên trên môi trờng thạch đặc sau 2 ngày đếm khuẩn lạc trên đĩa petri.
+ Đếm trực tiếp dới kính hiển vi: sử dụng phòng đếm hồng cầu (Thoma, Goriaev).
Nguyên tắc: Đếm số lợng bào tử có trong một đơn vị thể tích của phòng đếm từ đó suy ra số lợng tế bào có trong 1ml nhân với độ pha loãng đã biết số tế bào trong dịch ban đầu. Phòng đếm hồng cầu có 25 ô lớn, khoảng trống giữa phiến kính và lá kính có chiều cao 0,02 mm, tổng diện tích là 1mm2. Nh vậy 1cm3 (1ml) sẽ ứng với 5 x 104 lần thể tích phòng đếm.
Cách tiến hành: Pha loãng và cho mẫu vào phòng đếm, không để tràn ra ngoài. Đếm số lợng bào tử có trong vài ô lớn, tính giá trị trung bình (a). Gọi K là hệ số pha loãng.
Số bào tử/ml =a x 25 x 5.104 x 1/K
+ Phơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch:
Để xác định tổng số tế bào có trong một đơn vị thể tích ngời ta thờng dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc trong một đơn vị thể tích” (CFU/v – Conoly Forming Unit/v).
Ưu điểm của phơng pháp này là chỉ tế bào sống mới đợc phát hiện. Muốn tách rời tế bào cần pha loãng mẫu kèm lắc mạnh dịch đã pha loãng. Sau khi thu đợc các dịch đã pha loãng ở các nồng độ khác nhau ta tiến hành bắt dầu từ ống nghiệm loãng nhất cấy lên các đĩa petri vô trùng nhỏ lên và dàn đều trên mặt thạch, trên đĩa có ghi ký hiệu tơng ứng với độ pha loãng sau đó ủ ở 25oC trong 5 ngày. Sau đó tiến hành
đếm số khuẩn lạc trên mỗi đĩa thạch và tính kết quả. Trừ những đĩa thạch khuẩn lạc dầy đặc không đếm đợc chỉ lấy các đĩa khuẩn lạc có đơn vị đo khoảng 30 CFU -300 CFU. Từ số khuẩn lạc trên đĩa có thể suy ra số tế bào (CFU) có trong mẫu vật một cách tơng đối.
CFU/ml(g) = a x 1/K x1/V
a- Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng nồng độ pha loãng.
V - Thể tích pha loãng dợc cấy gạt trên mặt đĩa thạch. K - Độ pha loãng của dịch cấy