3.1.1 Thiết bị
- Cân điện tử4 sốSartorius - Nồi hấp vô trùng Hyrayama - Tủ ấm Memmert
- Máy lắc HM 76RT
- Tủcấy an toàn ESCO Class II
Nguyên lý làm việc: tạo dòng không khí luân chuyển trong buồng làm việc, phần không khí tái luân chuyển đi qua bộlọc, được lọc sạch và được thổi vào buồng thao tác, đồng thời tạo áp lực hút trên cửa của mặt bàn, trước mặt người thao tác với một vận tốc nhất định, do đó bảo vệ người thao tác và sản phẩm nuôi cấy. Sau đó không khí vào buồng lọc và tái luân chuyển. Ngoài ra tủ còn có đàn cực tím UV đểtiệt trùng cho phép vô trùng khỏi các vi sinh vật.[10]
Hình 3.1 Tủan toàn ESCO Class II
3.1.2 Dụng cụ
- Becher 250 mL (4 cái), 100 mL (4 cái); - Pipet 10 mL (1 cái), 5 mL ( 1 cái);
- Pipet 1000 µL (1 cái), pipet 100 µL (1 cái);
-Đĩa thủy tinh (2 cái), 1 đũa thủy tinh, phễu lớn, phễu nhỏ; - Máy tính, nhãn hóa chất.
3.1.3 Nguyên liệu và hóa chất3.1.3.1 Nguyên liệu 3.1.3.1 Nguyên liệu
Môi trường cấy khuẩn LB (Luria-Bertani).
- Thành phần của môi trường LB là như sau (g/L) : Cao nấm men – 5; Peptone – 10; NaCl – 10; pH – 7,0; khửtrùng ở121℃ trong 20 phút.
Cao nấm men là dịch tự phân tế bào nấm men được cô đặc lại, chứa phong phú các vitamine nhóm B, còn có đạm hữu cơ và đường.
Pepton là dạng thủy phân bằng protease hay bằng acid đối với thịt, casein, gelatin, sau đó làm khô lại thành dạng bột. Pepton chứa phong phú các chất đạm hữu cơ, cũng có một sốvitamin và đường.
3.1.3.2 Hóa chất
- Na2HPO4.12H2O, rắn – Trung Quốc. - NaH2PO4.2H2O, rắn – Trung Quốc. - NaOH, rắn – Trung Quốc.
- NaCl, rắn – Trung Quốc. - H3PO485% – Trung Quốc. - Benzethonium chloride – Merck. - Phenol – Trung Quốc.
- Hydrogen peroxide 30% – Trung Quốc. - Isopropyl alcohol – Trung quốc.
- Ethanol – Trung Quốc.
- H2SO4 95-98% – Trung Quốc. - Glycerol – Trung Quốc.
- Nước Javen – hàng công nghiệp.
3.2 QUY TRÌNH THỬHOẠT TÍNH
Thửhoạt tính trên dung dịch vi khuẩn (suspension test).[11, 12]
Hình 3.2 Quy trình thửhoạt tính
Thuyết minh quy trình
- Dùng pipet hút 1000 µL dung dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm.
- Tiếp tục, dùng pipet hút tiếp 100 µL dung dịch khửkhuẩn cho vào ống nghiệm chứa vi khuẩn, lắc đều.
- Kiểm tra số vi khuẩn còn lại trong dung dịch trên bằng phương pháp đếm sống nhỏgiọt.
Phương pháp đếm sống nhỏgiọt: cho phép xác định sốvi khuẩn sống - Chuẩn bịdịch pha loãng mẫu[13, 14, 23]
Dung dịch pha loãng
NaCl 9 gam Dung dịch khửkhuẩn 1000 µL Lấy chính xác 100 µL dung dịch khửkhuẩn Dung dịch vi khuẩn (thểvẩn)
Dung dịch nuôi lỏng vi khuẩn
NaCl 5 gam
Peptone 10 gam
Nước cất vừa đủ 1 lít
- Chuẩn bịcác chuỗi pha loãng mẫu
Hình 3.3 Cách pha loãng mẫu[10]
- Cấy mẫu ủvào môi trường, ủmẫu
Phương pháp cấy bề mặt : môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước để khô mặt, cấy 0,1-0,3 mL vào môi trường, để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô mặt.
- Đếm sốkhuẩn lạc hình thành
Đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường và dựa vào độ pha loãng đểtính ra sốvi sinh vật trong dung dịch ban đầu.
3.3.1 Công thức pha chế Công thức pha chế Công thức pha chế Hydrogen peroxide 30% 20 mL NaCl 0,09 g Na2HPO4.12H2O 0,1568 g NaH2PO4.2H2O 0,0085 g H3PO4 0,02 g Glycerol 0,03 g
Nước cất khửkhuẩn Thêm vào đến 100 mL
Thuyết minh công thức
- Cân 0,06 g NaCl, 0,1568 g Na2HPO4.12H2O, 0,0085 g NaH2PO4.2H2O, 0,02 g H3PO4, 0,03 g glycerol, hòa tan với 80 mL nước cất vô khuẩn.
- Thêm vào 20 mL hydrogen peroxide 30%. - Cho tiếp 0,03 g NaCl vào dung dịch.
- Sau đó, thêm nước cất vô khuẩn đến 100 mL
- Điều chỉnh pH đến khoảng 6,5 bằng HCl hay NaOH (nếu cần).
Dung dịch được đem đi thử hoạt tính với vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏgiọt.
3.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính khửkhuẩn3.3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độdung dịch hydrogen peroxide 3.3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độdung dịch hydrogen peroxide
Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung dịch hydrogen peroxide được thực hiện như trình bày ởMục 3.3.1.
Thực hiện pha chế dung dịch, lần lượt thay nồng độ dung dịch hydrogen peroxide mỗi lần thực hiện thí lần lượt là 5% (16,7 mL), 6% (20 mL) , 7% (23,3 mL), 8% (26,7 mL).
Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH được thực hiện như trình bày ởMục 3.3.1.
Nồng độdung dịch hydrogen peroxide và các hóa chất khác trong công thức không thay đổi trong các lần pha chế.
Lần lượt thay đổi pH của dung dịch pha chế (dùng HCl hay NaOH) là 2, 6,5, 8.
Thửhoạt tính các dung dịch và ghi nhận kết quả.
3.3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc dụng cụ
Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc dụng cụ cũng được thực hiện như trình bày ởMục 3.3.1.
Nồng độ dung dịch hydrogen peroxide không thay đổi là 8% và pH là 2 trong các lần pha chế.
Thời gian cho dung dịch pha chế tiếp xúc với vi khuẩn trong quá trình
thửhoạt tính được thay đổi: 5 phút, 10 phút, 15 phút, 25 phút.
Ghi nhận kết quả.
3.4 PHA CHẾDUNG DỊCH KHỬKHUẨN ETHANOL3.4.1 Công thức pha chế 3.4.1 Công thức pha chế
Công thức pha chế
Benzethonium chloride 0,2% (wt/v)
Glycerol 0,2% (v/v)
Ethanol 80% (v/v)
Nước cất khửkhuẩn Thêm đến 100%
Thuyết minh công thức pha chế
- Cho 0,2 g benzethonium chloride, 0,2 mL glycerol hòa tan với 80 mL ethanol.
- Thêm nước cất khửkhuẩn đến 100 mL.
- Dung dịch thu được thửhoạt tính với vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏgiọt.
3.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính khửkhuẩn3.4.2.1 Ảnh hưởng của loại chất diệt khuẩn 3.4.2.1 Ảnh hưởng của loại chất diệt khuẩn
Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của loại chất diệt khuẩn được thực hiện như trình bày ởMục 3.4.1.
Cố định % các hóa chất trong công thức, thay đổi chất diệt khuẩn lần lượt là benzethonium chloride, phenol trong các lần pha chế.
Thửhoạt tính các dung dịch và ghi nhận kết quả.
3.4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độethanol
Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol được thực hiện như trình bày ởMục 3.4.1.
Thực hiện pha chếdung dịch, lần lượt thay nồng độ ethanol mỗi lần thực hiện thí lần lượt là 50%, 70%, 80%, 95%.
Thửhoạt tính các dung dịch thu được và ghi nhận kết quả.
3.4.2.3 Ảnh hưởng của loại chất làm mềm
Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của loại chất làm mềm được thực hiện như trình bày ởMục 3.4.1.
Cố định các thành phần khác, thay đổi chất chất làm mềm lần lượt là glycerol, phosphoric acid trong các lần pha chế.
Thửhoạt tính các dung dịch thu được và ghi nhận kết quả.
3.4.2.4 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc dụng cụ
Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc dụng cụ cũng được thực hiện như trình bày ởMục 3.4.1.
Nồng độethanol không thay đổi là 80% và trong các lần pha chế.
Thời gian cho dung dịch pha chế tiếp xúc với vi khuẩn trong quá trình thửhoạt tính được thay đổi: 5 phút, 10 phút, 15 phút, 25 phút.
Ghi nhận kết quả.
3.5 SO SÁNH MẪU PHA CHẾ ĐƯỢC VỚI CHẤT KHỬ KHUẨN CHLORINE TRÊN THỊTRƯỜNG. CHLORINE TRÊN THỊTRƯỜNG.
- Chuẩn bịcác dung dịch cần thửhoạt tính
Dung dịch nước javen công nghiệp.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN
4.1 KẾT QUẢ CÁC THÍ NGHIỆM PHA CHẾ DUNG DỊCH KHỬ
KHUẨN
4.1.1 Dung dịch khửkhuẩn hydrogen peroxide
Dung dịch sau khi pha chế sẽ được đem đi thửhoạt tính diệt khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏgiọt. Kết quảthu được như sau:
Thửnghiệm đối với Vibrio sp
Đối chứng Mẫu vi khuẩn tiếp xúc dung dịch hydrogen peroxide
Thửnghiệm đối với E. coli
Đối chứng Mẫu vi khuẩn tiếp xúc dung dịch
hydrogen peroxide Hình 4.2 Khảnăng khửkhuẩn của dung dịch hydrogen peroxide đối với E. coli
Nhận xét
Dung dịch pha chế được có hoạt tính khử khuẩn tốt trên cả vi khuẩn
Vibrio sp(một loại vi khuẩn được phân lập từ tôm) và E. coli với cùng hệ số pha loãng vi khuẩn 10-6, không còn khuẩn lạc mọc trên cả2 đĩa thạch.
Thửnghiệm độbền của dung dịch không màu tím nhạt bền 1ml dung dịch khửkhuẩn + 10ml nước cất + 5ml dd H2SO4 1:3 + KMnO4
Thuyết minh quy trình:
- Dùng pipet hút chính xác 1 mL dung dịch khử khuẩn cần định lượng H2O2cho vào bình tam giác.
- Tiếp tục thêm vào 10 mL nước cất, 5 mL H2SO41:3.
- Chuẩn độdung dịch bằng dung dịch KMnO40,5 M đến khi dung dịch có màu tím nhạt bền.
Cách tiến hành
- Dùng 8 ống nghiệm, mỗi ống cho vào 5 mL dung dịch khửkhuẩn vừa pha chế, để ởnhiệt độphòng, không che chắn.
- Ống thứnhất định lượng ngay, ngày kếtiếp định lượng ống thứhai, cứ như thế đến hết 8 ống nghiệm.
- So sánh lượng H2O2trong mỗi ống nghiệm.
Kết quả
Bảng 4.1 Kết quả định lượng H2O2 Thời gian đểmẫu
(ngày) 0 1 2 3 4 5 6 7
Lượng H2O2trong 5
mL dung dịch (mg) 393 393 393 393 393 383 383 372
Phần trăm lượng H2O2còn lại sau 7 ngày
372
393× 100 = 95%
4.1.2 Dung dịch khửkhuẩn ethanol
Dung dịch sau khi pha chế sẽ được đem đi thửhoạt tính diệt khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏgiọt. Kết quảthu được như sau:
Thửnghiệm đối với Vibrio sp
Đối chứng Mẫu vi khuẩn tiếp xúc dung dịch alcohol Hình 4.4 Khảnăng khửkhuẩn của dung dịch ethanol đối với Vibrio sp
Thửnghiệm đối với E. coli
Đối chứng Mẫu vi khuẩn tiếp xúc dung dịch ethanol Hình 4.5 Khảnăng khửkhuẩn của dung dịch alcohol đối với E. coli
khuẩn của dung dịch pha chế tốt hơn vì không còn khuẩn lạc trên đĩa thạch còn đối với E. colivẫn còn khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch.
Kết luận
Trong cùng hệ số pha loãng vi khuẩn, vi khuẩn E. coli khó diệt hơn
Vibrio sp, vẫn có khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch sau khi cho vi khuẩn tiếp xúc với dung dịch pha chế(đối với dung dịch khửkhuẩn ethanol).
Như vậy, chọn E. coliđể thử hoạt tính trong các thí nghiệm tiếp theo vì có ý nghĩa đối với luận văn hơn. Tiếp tục thực hiện thêm một sốthí nghiệm để tìm ra hệsốpha loãng vi khuẩn thích hợp cho các khảo sát tiếp theo.
4.2 KẾT QUẢ CÁC THÍ NGHIỆM KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH KHỬ KHUẨN CỦA DUNG DỊCH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH KHỬ KHUẨN CỦA DUNG DỊCH HYDROGEN PEROXIDE
Hình 4.6 Đĩa thạch E. coli với hệsốpha loãng, A: 10-2, B: 10-1
Hệ sốpha loãng 10-1 dùng trong các thử nghiệm khảo sát thời gian, 10-2 dung trong các thửnghiệm còn lại.
4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độhydrogen peroxide
Tiến hành thửhoạt tính các dung dịch pha chế trên vi khuẩn E. coli. Cố định các thành phần khác, nồng độ dung dịch hydrogen peroxide trong các dung dịch pha chế lần lượt là 5%, 6%, 7%, 8%. Thí nghiệm được tiến hành trong tủ cấy an toàn sinh học. Để đĩa thạch trong tủ ấm, 24 giờsau quan sát kết quảvà chụp hình, thu được kết quảnhư sau:
Thửnghiệm với nồng độdung dịch hydrogen peroxide 5%
Hình 4.7 Đĩa thạch E. colitiếp xúc với dung dịch hydrogen peroxide 5%
Thửnghiệm với nồng độdung dịch hydrogen peroxide 6%
Thửnghiệm với nồng độdung dịch hydrogen peroxide 7%
Hình 4.9 Đĩa thạch E. colitiếp xúc với dung dịch hydrogen peroxide 7%
Thửnghiệm với nồng độdung dịch hydrogen peroxide 8%
Nhận xét
Dung dịch được pha chế ở các nồng độ hydrogen peroxide khác nhau nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ hydrogen peroxide đến hoạt tính khử khuẩn của dung dịch.
Kết quả cho thấy khả năng diệt E. coli của dung dịch tăng theo nồng độ dung dịch hydrogen hydroxide từ 5-8%. Ở nồng độ 8%, hydrogen peroxide tuy là tác nhân oxy hóa mạnh nhưng gây ăn mòn dụng cụ.[15] Nồng độ dung dịch hydrogen hydroxide từkhoảng 3-7% không gây ăn mòn dụng cụ. Do đó, trong công thức có thêm các muối phosphate của kim loại kiềm vừa làm bền dung dịch vừa ức chế sự ăn mòn dụng cụ. Trong một nghiên cứu, nồng độ hydrogen peroxide 6% (không kểdung dịch hydrogen peroxide nồng độ7,5%) hiểu quảhơn chất khửkhuẩn mức độcao glutaraldehyde.[5]
Như vậy, theo thí nghiệm khảo sát trên chọn nồng độ hydrogen peroxide
tối ưu cho hoạt tính khửkhuẩn của dung dịch là 8%.
4.2.2 Ảnh hưởng của pH
Tiến hành thử hoạt tính các dung dịch pha chế trên vi khuẩn E. coli. Cố định nồng độ dung dịch hydrogen peroxide và các thành phần khác cũng không đổi. Thí nghiệm được tiến hành trong tủ cấy an toàn sinh học. Để đĩa thạch trong tủ ấm, 24 giờsau quan sát kết quả và chụp hình, thu được kết quả như sau:
Thửnghiệm với pH = 6,5
Hình 4.12 Đĩa thạch E. colitiếp xúc với dung dịch hydrogen peroxide có pH = 6,5
Thửnghiệm với pH = 8
Hình 4.13 Đĩa thạch E. colitiếp xúc với dung dịch hydrogen peroxide có pH = 8
Nhận xét
Dung dịch được pha chế ởcác pH khác nhau nhằm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính khửkhuẩn của dung dịch.
khửkhuẩn của dung dịch giảm dần theo pH từ2-8, pH thấp giúp làm bền dung dịch hydrogen peroxyde hơn. Trong dung dịch hydrogen peroxide 7,5% thường được thêm 0,85% phosphoric acid để duy trì pH thấp.[5] Tuy nhiên, nếu dung dịch dùng để khử khuẩn kính sát tròng thì pH chỉ nên từ5,5-8,0 để tránh gây kích ứng mắt, nếu không may chất khửkhuẩn còn sót lại.[16]
Như vậy, trong thí nghiệm khảo sát này pH tối ưu cho hoạt tính khử khuẩn của dung dịch là 2.
4.2.3 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc vi khuẩn
Tiến hành thử hoạt tính các dung dịch pha chế trên vi khuẩn E. coli. Cố định nồng độ dung dịch hydrogen peroxide là 8%, pH là 2 và các thành phần khác cũng không đổi. Thí nghiệm được tiến hành trong tủ cấy an toàn sinh học. Để đĩa thạch trong tủ ấm, 24 giờsau quan sát kết quả và chụp hình, thu được kết quảnhư sau :
Thửnghiệm với thời gian tiếp xúc vi khuẩn là 5 phút
Thửnghiệm với thời gian tiếp xúc vi khuẩn là 10 phút
Hình 4.15 Đĩa thạch E. colicó thời gian tiếp xúc với dung dịch hydrogen peroxide là 10 phút
Thửnghiệm với thời gian tiếp xúc vi khuẩn là 15 phút
Thửnghiệm với thời gian tiếp xúc vi khuẩn là 25 phút
Hình 4.17 Đĩa thạch E. colicó thời gian tiếp xúc với dung dịch hydrogen peroxide là 25 phút
Nhận xét
Dung dịch được thử hoạt tính ở các thời gian tiếp xúc vi khuẩn khác nhau nhằm tìm ra thời gian tối thiểu có hiệu quả diệt vi khuẩn nhất của dung dịch khửkhuẩn.
Kết quả cho thấy (với vi khuẩn E. coli cùng hệ số pha loãng vi khuẩn 10-1), thời gian tối thiểu để dung dịch diệt hết vi khuẩn là 10 phút. Như Hình
