2.2.5.1. Phương pháp định lượng glucose huyết.
Xác định nồng độ glucose huyết trên máy đo đường huyết với que thử tự động One Touch Ultra.
Nguyên tắc: bộ KIT thử dựa trên phản ứng oxy hoá glucose bằng glucose oxidase (GOD) và hydrogen peroxide tạo thành tác dụng với
4- aminoantipyrin và phenol nhờ xúc tác của peroxidase (POD) tạo phức hợp quinoimin theo các phản ứng. Glucose+O2 Glucose oxidase Gluconic acid + H2O2 Peroxidase Gluconicacid+Phenol+4- aminoantipyrin Quinoimin(đỏ) + 4H2O2
Hình 2. 4. Định lượng glucose huyết của chuột nhắt.
2.2.5.2. Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh.
Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động (Phòng hóa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô). Nguyên tắc xác định của mỗi chỉ số như sau:
2.2.5.2.1. Định lượng cholesterol toàn phần.
Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quynonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase. Các phản ứng:
cholesterol esterase
Este hóa cholesterol + H2O colesterol + acid béo tự do cholesterol oxidase
Cholesterol + O2 3-one-cholestenon + H2O2
peroxidase (POD)
2H2O2+phenol+4-amino-Antipirin (AAP) Quinonimin Đo mật độ quang học quynonimin ở bước sóng 546nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả.
2.2.5.2.2. Định lượng triglycerid.
Thuỷ phân triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quynonimin tạo thành từ 4- aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Lipase
Triglycerid Glycerol + acid béo Glycerol kinase
Glycerol + ATP Glycerol-3-P
Glycerol-phosphate oxidase
Glycerol-3-P+ADP dihydroxiaceton phosphat+ H2O2
peroxidaza
H2O2+ 4-amino-Antipirin + 4-chloro-Phenol Quinonimin Đo mật độ quang học quynonimin ở bước sóng 546nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả.
2.2.5.2.3. Định lượng HDL-c.
Nguyên tắc: xét nghiệm gồm hai bước đặc hiệu. Bước thứ nhất cholesterol trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu. Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định
lượng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chất surfactant đặc hiệu cho HDL. Bước 1: Chylomicron, LDL, VLDL Cholestenon + H2O 2H2O2 2 H2O + O2 Bước 2: HDL Cholestenon + H2O2 H2O2 + Chromogen Sắc tố quynon 2.2.6. Xử lý số liệu.
Chỉ số glucose huyết được so sánh giữa thời điểm trước và sau nghiên cứu; so sánh giữa các lô dùng thuốc và lô đối chứng ở cùng thời điểm.
* Tỷ lệ tăng glucose huyết được tính theo công thức Tỷ lệ % tăng glucose huyết:
X1% =
X1 – Tỷ lệ % tăng glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t- test student với p < 0,05 có ý nghĩa thống kê.
* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (CHL, HDL-C, LDL-C, TG) được tính theo công thức dưới đây
CHE + CHO Điều kiện đặc biệt
Catalase CHE + CHO Surfactant đặc hiệu B – A A x 100 Peroxidase
Tỷ lệ % hạ glucose huyết:
X2% =
X2 – Tỷ lệ % hạ glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t- test student với p< 0,05 có ý nghĩa thống kê.
A - B A
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì.
Để tìm hiểu thành phần hóa học của thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành chiết như đã mô tả ở phần phương pháp thu được cao ethanol. Sau đó tiếp tục chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần : n- hexan và ethylacetat. Kết quả được trình bày trên sơ đồ hình 3.1 và bảng 3.1.
Hình 3.1. Quy trình chiết suất các chất tự nhiên từ thân cây Ngũ gia bì
Với quy trình chiết rút như trên, chúng tôi thu được hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ 3 kg thân cây Ngũ gia bì như bảng 3.1.
Bã sau khi chiết bằng n –hexan 50.2g Cao n –hexan
Chiết bằng n –hexan
Bã sau khi chiết bằng ethylacetate 42.5g Cao ethylacetate
150g Cao ethanol Bã sau khi chiết bằng ethanol Chiết ethanol 3 lần
3000g thân cây Ngũ gia bì
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì.
Phân đoạn Mẫu ban đầu (g)
Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô)*
Cao ethanol 150 5
Cao n – hexan 50.2 1.67
Cao ethylacetate 42.5 1.42
Hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (5%) so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu là 150g, tiếp đến là ở cao phân đoạn n- hexan (1.67%), thấp nhất là cao phân đoạn ethyacetate (1.42%). Kết quả này cho thấy trong thân cây Ngũ gia bì có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên. Trong đó hàm lượng các hợp chất phenolic chiếm tỷ lệ khá cao. Điều này được chứng minh ở kết quả xét nghiệm định tính và định lượng.
3.2. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì.
Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản có trong cao các phân đoạn từ dịch chiết thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính, định lượng.
Sử dụng các thuốc thử đặc trưng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên, chúng tôi thu được kết quả trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì.
Nhóm chất Thuốc thử
Mẫu Cao ethanol Cao
n-hexan EtOAc Flavonoid Shinoda + + + Diazo + + + H2SO4 đặc + + ++ Catechin Vanilin/HCl (đ) - - - Tannin Vanilin - - - Gelatin/NaCl + + + Acetat chì + ++ + Polyphenol khác NaOH 10% + + ++ FeCl3 5% +++ +++ ++ Glycoside Keller-killian + ++ + Alkaloid Mayen + + + Dragendroff + ++ ++ Bouchardat +++ ++ ++ Chú thích: (-) : Không phản ứng (++) : Phản ứng mạnh (+) : Phản ứng (+++) : Phản ứng rất mạnh
Kết quả định tính cho thấy thành phần các hợp chất tự nhiên trong thân cây Ngũ gia bì khá phong phú bao gồm: Flavonoid, tannin, glycoside và alkaloid. Cao của cả 3 phân đoạn EtOH, n-hexan, EtOAc đều chứa các thành phần này nhưng với hàm lượng khác nhau. Các phân đoạn EtOH, n-hexan, EtOAc có
chứa thành phần hợp chất tự nhiên khá giống nhau: chứa nhiều alkaloid, polyphenol; không chứa catechin.
3.3. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết.
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin - Ciocalteau.
3.3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đường chuẩn acid gallic được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành trên máy ERMA ở bước sóng 765nm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
TT acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
Hình 3.2 : Đồ thị đường chuẩn acid gallic
3.3.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số được thể hiện trong bảng 3.4 bảng 3.4
Bảng 3.4. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì
Mẫu OD765nm Hàm lượng Polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) polyphenol Cao EtOH 0.04 27.2 0.272 Cao n-hexan 0.67 657.2 6.572 Cao EtOAc 0.22 207.2 2.072
Bảng định lượng 3.4 cho thấy rằng, hàm lượng polyphenol tổng số trong cao phân đoạn n-hexan là cao nhất (6.572%), sau đó đến phân đoạn cao EtOAc (2.072%). Đối với phân đoạn EtOH hàm lượng polyphenol thấp nhất (0.272%).
Đồ thị chuẩn acid gallic
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 mg Acid gallic O D 7 6 5 n m y = 0.001x + 0.0128
Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong thân cây Ngũ gia bì có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong cao n-hexan và cao ethylacetate. Điều này phù hợp với tính chất vật lý và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi phân cực và ít tan trong dung môi không phân cực.
3.4. Kết quả xác định liều độc cấp.
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ thân cây Ngũ gia bì trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [38].Chuột cho nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 5 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đường uống.
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao theo đường uống.
3.5. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm.
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 14 - 17g) được chia làm 5 lô.
Lô 1: cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương).
Lô 2 - 5: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao như bảng 2.2. Sau 8 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng chuột. Kết quả sự thay đổi trọng lượng của chuột thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.3.
Bảng 3.6. Trọng lượng trung bình (tính theo gam) của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng khác nhau
Nhóm Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Nhóm ăn thường 14.65 17.59 20.21 24.78 28.42 33.58 38.77 41.2 44.45 ±0.5 ±0.67 ±1.02 ±0.91 ±1.01 ±1.8 ±1.08 ±1.4 ±1.24 Nhóm ăn béo 14.65 21.57 30.78 36.43 40.27 45.82 50.23 55.1 59.92 ±0.5 ±1.02 ±1.91 ±2.3 ±2.73 ±3.05 ±3.12 ±4.68 ±5.74
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của các lô chuột; (*): p < 0.05 so sánh với nhóm ăn thường)
14.65 17.59 20.21 24.78 28.42 33.58 38.77 41.2 44.45 14.65 21.57 30.78 36.43 40.27 45.82 50.23 55.1 59.92 0 10 20 30 40 50 60 70
Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8
Nhóm ăn thường Nhóm ăn béo
Trọng lượng chuột (g)
Thời gian
Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần
Bảng 3.6 và hình 3.3 đã cho thấy, chuột được nuôi theo chế độ ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao (ăn béo - HFD) có khả năng tăng về trọng lượng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thường (ND) và sự sai khác này là có ý nghĩa p < 0.05. Cụ thể là sau 8 tuần nuôi, chuột nuôi với thức ăn thường trọng lượng cơ thể chỉ tăng thêm 29.8g ứng với 203.41% so với ban đầu, trong khi chuột nuôi với thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao trọng lượng cơ thể tăng thêm 45.27g ứng với 309.01% so với ban đầu. Như vậy, chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao đã tăng trọng hơn so với chuột ăn thức ăn thường là 15.47g hay gấp 1.52 lần
Để đánh giá ảnh hưởng của chế độ nuôi béo đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cùng của thời gian nuôi béo sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá sinh. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.4 sau đây.
Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số lipid máu giữa chuột nuôi thường và nuôi béo phì thực nghiệm.
Các chỉ số lipid (mmol/l) TC TG HDL-c LDL-c Glucose Nhóm ăn thường 3.7 1.15 2.7 0.5 6.52 ±0.22 ±0.15 ±0.17 ±0.1 ±0.2 Nhóm ăn béo 4.0* 1.19* 2.6* 0.9* 9.51* ±0.1 ±0.43 ±0.2 ±0.26 ±0.42 So sánh lô béo/thường ↑1.08l ↑1.03l ↓1.04 l ↑1.8 l ↑1.46 l
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của 10 con chuột; (*): p<0.05 khi so sánh với nhóm ăn thường;trong đó (↓) sự giảm, ( ↑) sự tăng)
3.7 1.15 2.7 0.5 6.52 4 1.19 2.6 0.9 9.51 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TC TG HDL-c LDL-c Glucose Nhóm ăn thường Nhóm ăn béo
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm
Từ bảng số liệu bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy các chỉ số hóa sinh đã có sự khác biệt rất lớn giữa lô nuôi thường và lô nuôi béo. Cụ thể, ở nhóm chuột cho ăn thức ăn béo trong 8 tuần, hàm lượng cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c trong huyết thanh đều cao hơn một cách có ý nghĩa (p<0.05) so với nhóm ăn bằng thức ăn thường. Hàm lượng cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c, Glucose trong huyết thanh của nhóm chuột nuôi béo tương ứng tăng gấp 1.08, 1.03, 1.8, 1.46 lần so với nhóm chuột nuôi bằng thức ăn thường. Tuy nhiên, HDL –c lại giảm, chuột nuôi thức ăn béo (2,6 mmol/l) còn chuột nuôi thường (2,7 mmol/l), với p < 0.05. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với qui luật thực tế và với nghiên cứu của Srinivasan và cộng sự [48]. Điều đó chứng tỏ chuột ăn các thức ăn có hàm lượng lipid cao thời gian dài rất dễ rối loạn trao đổi lipid và glucid.
Hàm lượng (mmol)
Chỉ số
Ta có thể giải thích kết quả trên là do chuột được ăn thức ăn có thành phần giàu lipid (32%) và cholesterol (1%) nên các chỉ số triglycerid và cholesterol toàn phần trong máu tăng chủ yếu là do thu nhận từ quá trình tiêu hoá. Cholesterol tuy cần thiết cho cơ thể vì nó là hợp phần cấu tạo của màng tế bào, của các mô thần kinh, các hormon steroid và quá trình tổng hợp vitamin D, nhưng khi cholesterol máu tăng cao quá mức lại trở nên có hại cho cơ thể vì khi đó nó trở thành nguyên nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như xơ vữa động mạch, bệnh lý tim mạch…[1] là những bệnh lý thường gặp ở bệnh nhân béo phì.
Triglycerid hay mỡ trung tính là thành phần chủ yếu của dầu, mỡ động thực vật, không tan trong máu nên được vận chuyển dưới dạng các hạt lipoprotein như chylomicron, VLDL đến trao đổi với các mô. Tế bào của mô hấp thụ triglycerid và tiêu dùng theo nhu cầu, khi dư thừa nó tích tụ trong tế bào và trở thành dạng năng lượng dự trữ trong các mô mỡ. Trong thời gian dài chuột luôn có chế độ ăn dư thừa triglycerid nên không những trọng lượng tăng mà hàm lượng triglycerid trong máu cũng ứ đọng rất cao.
Đáng chú ý là sự biến thiên hai chỉ số HDL-c và LDL-c. HDL-c và LDL-c là hai dạng lipoprotein có thành phần giàu cholesterol (lần lượt chứa 18% và ~ 70%) tham gia vào quá trình trao đổi cholesterol của cơ thể theo hai chiều ngược nhau. HDL được mệnh danh là “lipoprotein tốt” vì hoạt động chính của nó là vận chuyển cholesterol dư thừa từ tế bào ngoại vi về gan để đào thải qua đường mật. Trái lại LDL là “lipoprotein xấu” vì nó vận chuyển cholesterol đến mô để tổng hợp steroid, nó rất dễ bị oxy hoá tạo các hạt LDL với kích thước lớn và tỷ trọng thấp - tác nhân gây xơ vữa và làm tắc nghẽn động mạch ở người béo phì, dễ gây nhồi máu cơ tim và đột tử khi gây tắc mạch máu não.
Như vậy với các dẫn liệu trọng lượng cơ thể, các chỉ số mỡ máu tăng cao bất thường ở chuột cũng những hiểu biết về quá trình chuyển hoá trên, chúng tôi có thể kết luận rằng mô hình gây chuột béo phì bằng các chế độ ăn giàu chất béo đã thành công. Chuột béo phì được tiếp tục sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.6. Tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì trên mô hình chuột đái tháo đường type 2 mô hình chuột đái tháo đường type 2
3.6.1. Kết quả tạo mô hình chuột đái tháo đường type 2 thực nghiệm
Với nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn béo trong thời gian dài và tiêm