Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính [31], [33]. Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng các phản ứng định tính đặc trưng.
Nhóm
hợp chất Phản ứng
Thuốc
thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCl
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.
Diazo hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính. Dung dịch
kiềm
NaOH 10%
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid sulfuric
H2SO4
10%
Phản ứng cho mầu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, mầu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin.
Tannin
Vanilin/H2SO4
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5%
Gelatin/1% NaCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa. Acetate chì 10% Phản ứng dương tính nếu kết tủa xuất hiện.
Alkaloid
Bouchardat
Hỗn hợp KI + I2
/HCl
Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm.
VansMayer
Hỗn hợp HgCl2+ KI
Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphenol khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng.
FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.3. Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau.
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [47].
Các bước tiến hành như sau:
* Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất
Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5mg/ml.
Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
Dung dịch mẫu cần định lượng.
* Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic
Chuẩn bị cóng định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml sau đó dẫn nước cất tới 100 ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58ml H2O + 100 µl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300µl Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 20oC rồi xác định ở bước sóng 765nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
* Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20µl (0,02ml) để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic.
2.2.4. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và khả năng chống rối loạn trao đổi lipid của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì (Schefflera octophylla trao đổi lipid của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì (Schefflera octophylla
Lour) trên chuột nhắt gây ĐTĐ bằng STZ
2.2.4.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì (Schefflera octophylla Lour) bằng đường uống theo phương pháp Lorke [51]. Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg (thể tích và khối lượng tối đa cho phép). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì (Schefflera octophylla Lour).
2.2.4.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm sóc bình thường trong 3 - 4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau đó chúng tôi tiến hành phân chuột thành 2 nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau:
Nhóm 1 – Nhóm đối chứng: các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng
thức ăn bình thường (do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp).
Nhóm 2 - Nhóm nuôi béo: các con chuột được chăm sóc bằng chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol do chúng tôi phối trộn các thực phẩm dinh dưỡng được tính toán với thành phần như bảng 2.2.
Các nhóm chuột được theo dõi trong vòng 8 tuần, trọng lượng của các con chuột được kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác định trọng lượng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu. Các số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kê.
Bảng 2.2. Thành phần thức ăn giàu lipid [27], [30], [49],
Thành phần Tỉ lệ % Hydratcacbon 41 Lipid 32 Protein 20 Cholesterol 1 Chất khoáng 4
Vitamin & acid amin 2
2.2.4.3. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
Để có mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo và cholesterol sau 8 tuần, được tiêm màng bụng liều đơn STZ (100mg/kg pha trong đệm citrate 0,01M, pH = 4,5).
Đo đường huyết tại các thời điểm 0 giờ (trước khi tiêm STZ), 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (sau khi tiêm STZ) (3 lần, mỗi lần cách nhau 1 tiếng và lấy trung bình). Chuột nào có đường huyết cao (≥18 mmol/l) và ổn định được lựa chọn để cho uống cao các phân đoạn dịch chiết trong vòng 21 ngày. Đường huyết trong các trường hợp trên đều được đo sau khi cho chuột nhịn qua đêm (12 giờ), chỉ cho uống nước.
2.2.4.4. Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết.
Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn dịch chiết như bảng 2.3. Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 7, thứ 14, thứ 21 khi điều trị.
Bảng 2.3. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì (Schefflera octophylla Lour)
Lô Chế độ ăn
trước điều trị Tiêm Uống dịch chiết
1 Thức ăn
chuẩn Uống nước cất, không điều trị. 2 Thức ăn béo STZ Uống nước cất, không điều trị.
3 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethanol (2000mg/kg). 4 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn n- hexan (2000mg/kg). 5 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethylacetate (2000mg/kg).
2.2.5. Một số kĩ thuật phân tích hóa sinh.
2.2.5.1. Phương pháp định lượng glucose huyết.
Xác định nồng độ glucose huyết trên máy đo đường huyết với que thử tự động One Touch Ultra.
Nguyên tắc: bộ KIT thử dựa trên phản ứng oxy hoá glucose bằng glucose oxidase (GOD) và hydrogen peroxide tạo thành tác dụng với
4- aminoantipyrin và phenol nhờ xúc tác của peroxidase (POD) tạo phức hợp quinoimin theo các phản ứng. Glucose+O2 Glucose oxidase Gluconic acid + H2O2 Peroxidase Gluconicacid+Phenol+4- aminoantipyrin Quinoimin(đỏ) + 4H2O2
Hình 2. 4. Định lượng glucose huyết của chuột nhắt.
2.2.5.2. Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh.
Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động (Phòng hóa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô). Nguyên tắc xác định của mỗi chỉ số như sau:
2.2.5.2.1. Định lượng cholesterol toàn phần.
Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quynonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase. Các phản ứng:
cholesterol esterase
Este hóa cholesterol + H2O colesterol + acid béo tự do cholesterol oxidase
Cholesterol + O2 3-one-cholestenon + H2O2
peroxidase (POD)
2H2O2+phenol+4-amino-Antipirin (AAP) Quinonimin Đo mật độ quang học quynonimin ở bước sóng 546nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả.
2.2.5.2.2. Định lượng triglycerid.
Thuỷ phân triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quynonimin tạo thành từ 4- aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Lipase
Triglycerid Glycerol + acid béo Glycerol kinase
Glycerol + ATP Glycerol-3-P
Glycerol-phosphate oxidase
Glycerol-3-P+ADP dihydroxiaceton phosphat+ H2O2
peroxidaza
H2O2+ 4-amino-Antipirin + 4-chloro-Phenol Quinonimin Đo mật độ quang học quynonimin ở bước sóng 546nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả.
2.2.5.2.3. Định lượng HDL-c.
Nguyên tắc: xét nghiệm gồm hai bước đặc hiệu. Bước thứ nhất cholesterol trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu. Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định
lượng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chất surfactant đặc hiệu cho HDL. Bước 1: Chylomicron, LDL, VLDL Cholestenon + H2O 2H2O2 2 H2O + O2 Bước 2: HDL Cholestenon + H2O2 H2O2 + Chromogen Sắc tố quynon 2.2.6. Xử lý số liệu.
Chỉ số glucose huyết được so sánh giữa thời điểm trước và sau nghiên cứu; so sánh giữa các lô dùng thuốc và lô đối chứng ở cùng thời điểm.
* Tỷ lệ tăng glucose huyết được tính theo công thức Tỷ lệ % tăng glucose huyết:
X1% =
X1 – Tỷ lệ % tăng glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t- test student với p < 0,05 có ý nghĩa thống kê.
* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (CHL, HDL-C, LDL-C, TG) được tính theo công thức dưới đây
CHE + CHO Điều kiện đặc biệt
Catalase CHE + CHO Surfactant đặc hiệu B – A A x 100 Peroxidase
Tỷ lệ % hạ glucose huyết:
X2% =
X2 – Tỷ lệ % hạ glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá
Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t- test student với p< 0,05 có ý nghĩa thống kê.
A - B A
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì.
Để tìm hiểu thành phần hóa học của thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành chiết như đã mô tả ở phần phương pháp thu được cao ethanol. Sau đó tiếp tục chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần : n- hexan và ethylacetat. Kết quả được trình bày trên sơ đồ hình 3.1 và bảng 3.1.
Hình 3.1. Quy trình chiết suất các chất tự nhiên từ thân cây Ngũ gia bì
Với quy trình chiết rút như trên, chúng tôi thu được hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ 3 kg thân cây Ngũ gia bì như bảng 3.1.
Bã sau khi chiết bằng n –hexan 50.2g Cao n –hexan
Chiết bằng n –hexan
Bã sau khi chiết bằng ethylacetate 42.5g Cao ethylacetate
150g Cao ethanol Bã sau khi chiết bằng ethanol Chiết ethanol 3 lần
3000g thân cây Ngũ gia bì
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ thân cây Ngũ gia bì.
Phân đoạn Mẫu ban đầu (g)
Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô)*
Cao ethanol 150 5
Cao n – hexan 50.2 1.67
Cao ethylacetate 42.5 1.42
Hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (5%) so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu là 150g, tiếp đến là ở cao phân đoạn n- hexan (1.67%), thấp nhất là cao phân đoạn ethyacetate (1.42%). Kết quả này cho thấy trong thân cây Ngũ gia bì có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên. Trong đó hàm lượng các hợp chất phenolic chiếm tỷ lệ khá cao. Điều này được chứng minh ở kết quả xét nghiệm định tính và định lượng.
3.2. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì.
Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản có trong cao các phân đoạn từ dịch chiết thân cây Ngũ gia bì, chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính, định lượng.
Sử dụng các thuốc thử đặc trưng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên, chúng tôi thu được kết quả trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết thân cây Ngũ gia bì.
Nhóm chất Thuốc thử
Mẫu Cao ethanol Cao
n-hexan EtOAc Flavonoid Shinoda + + + Diazo + + + H2SO4 đặc + + ++ Catechin Vanilin/HCl (đ) - - - Tannin Vanilin - - - Gelatin/NaCl + + + Acetat chì + ++ + Polyphenol khác NaOH 10% + + ++ FeCl3 5% +++ +++ ++ Glycoside Keller-killian + ++ + Alkaloid Mayen + + + Dragendroff + ++ ++ Bouchardat +++ ++ ++ Chú thích: (-) : Không phản ứng (++) : Phản ứng mạnh (+) : Phản ứng (+++) : Phản ứng rất mạnh
Kết quả định tính cho thấy thành phần các hợp chất tự nhiên trong thân cây Ngũ gia bì khá phong phú bao gồm: Flavonoid, tannin, glycoside và alkaloid. Cao của cả 3 phân đoạn EtOH, n-hexan, EtOAc đều chứa các thành phần này nhưng với hàm lượng khác nhau. Các phân đoạn EtOH, n-hexan, EtOAc có
chứa thành phần hợp chất tự nhiên khá giống nhau: chứa nhiều alkaloid, polyphenol; không chứa catechin.
3.3. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết.
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin - Ciocalteau.
3.3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đường chuẩn acid gallic được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành trên máy ERMA ở bước sóng 765nm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
TT acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
Hình 3.2 : Đồ thị đường chuẩn acid gallic
3.3.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số được thể hiện trong bảng 3.4 bảng 3.4
Bảng 3.4. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì
Mẫu OD765nm Hàm lượng Polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) polyphenol Cao EtOH 0.04 27.2 0.272 Cao n-hexan 0.67 657.2 6.572 Cao EtOAc 0.22 207.2 2.072
Bảng định lượng 3.4 cho thấy rằng, hàm lượng polyphenol tổng số trong cao phân đoạn n-hexan là cao nhất (6.572%), sau đó đến phân đoạn cao EtOAc (2.072%). Đối với phân đoạn EtOH hàm lượng polyphenol thấp nhất (0.272%).
Đồ thị chuẩn acid gallic
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 mg Acid gallic O D 7 6 5 n m y = 0.001x + 0.0128
Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong thân cây Ngũ gia bì có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong cao n-hexan và cao ethylacetate. Điều này phù hợp với tính chất vật lý và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi phân cực và ít tan trong dung môi không phân cực.
3.4. Kết quả xác định liều độc cấp.
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ thân cây Ngũ gia bì trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [38].Chuột cho nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 5 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết thân cây Ngũ gia bì.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đường uống.
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ thân cây Ngũ gia bì hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao theo đường uống.
3.5. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm.
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 14 - 17g) được chia làm 5 lô.
Lô 1: cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương).
Lô 2 - 5: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao như bảng 2.2. Sau 8 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng chuột.