2.4.5.1. Thử nghiệm chậu vại
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Phương pháp lấy mẫu Lấy mẫu đất chứa tàn dư thực vật và phụ phẩm hoai mục theo TCVN 7538- 2:2010. Mẫu đất hữu cỡ: 150 mẫu. Mẫu phụ phẩm quả vải hoai mục 150 mẫu. 2.5.2. Phân lập vi sinh vật từ các mẫu phế thải
Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-3 theo TCVN 6168:2002
Tại mỗi nồng độ dùng pipet hút dung dịch được pha loãng cấy trên các môi trường thạch bằng đã chuẩn bị sẵn, đem nuôi trong tủ nuôi ở 27 – 28oC từ 2 – 3 ngày. Khi các chủng VSV mọc rõ ràng đem cấy truyền và làm thuần khiết. Sau khi
được làm thuần khiết, đem các chủng giống đó cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng để giữ giống.
2.5.3. Đánh giá đặc tính sinh học của vi sinh vật
a) Xác định thời gian nuôi cấy của các chủng giống vi sinh vật
Các chủng VSV được nuôi trên môi trường thạch bằng chuyên tính bán rắn trong tủ nuôi 28 – 300C. Theo dõi khả năng mọc của các chủng VSV tại các mốc thời gian khác nhau: 16h, 24h, 48, 60h, 72h và > 72h. Xác định xem chủng đó mọc nhanh (trước 72h) hay chậm (sau 72h).
b) Xác định hình thái, kích thước khuẩn lạc và hình thái vi sinh vật
Hình thái và kích thước khuẩn lạc
Các chủng VSV được nuôi trên môi trường thạch bằng chuyên tính bán rắn trong tủ nuôi 28 – 300C trong 3 ngày. Xác định hình thái và kích thước khuẩn lạc bằng phương pháp quan sát và đo trực tiếp bằng thước đo.
Quan sát hình thái vi sinh vật
- Đối với vi khuẩn: Tiến hành phương pháp nhuộm Gram để xác định vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hay Gram dương, quan sát bằng kính hiển vi
để biết hình thái của vi khuẩn.
- Đối với xạ khuẩn và nấm: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gauze 1, nấm được nuôi cấy trên môi trường thạch, khoai tây (PDA) có găm lamen nghiêng 450 trên bề mặt môi trường. Sau 7 – 9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy ra
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học.
Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay lượn sóng ký hiệu là RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Ratinaculiapert) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira).
So sánh với khóa phẩn loại Klich (2004) để sơ bộ định tên chủng nấm và khóa phân loại Bergey (1989) để sơ bộđịnh tên các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn.
2.5.4. Phương pháp xác định sinh khối
Cân giấy lọc đã được sấy khô đến khối lượng không đổi (ở 1050C/2h). Lọc dịch nuôi cấy qua giấy lọc, đem sấy khô giấy lọc đến trọng lượng không đổi. Cân lại giấy lọc. Trọng lượng khô của tế bào được xác định bằng công thức:
P(g) = P2 – P1
Trong đó: P: Khối lượng khô của sinh khối, P1: Khối lượng khô của giấy lọc, P2: Tổng khối lượng khô của giấy lọc và sinh khối.
2.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào, định lượng hoạt độenzyme enzyme
Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào
Xác định cường độ phân giải CMC, xenluloza, tinh bột, protein của các chủng VSV theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch, (Wiliam, 1983).
Xác định hoạt độ xenluloza bằng phương pháp DNS
Phương pháp DNS – phương pháp định lượng, (Miller, 1959).
Ctn: Sốđọc từđường chuẩn glucose của ống thí nghiệm, µmol/l Cdc: Sốđọc từđường chuẩn glucose của ống đối chứng, µmol/l D: Độ pha loãng mẫu, V: Thể tích mẫu của phản ứng (0,15ml) T: Thời gian phản ứng (30 phút)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30 đường khử, phản ứng màu đỏ đậm với thuốc thử DNS (2 – hydroxy – 3,5 – dinitrobenzoic acid). Cường độ màu hỗn hợp tỷ lệ thuận với nồng độ đường trong dung dịch. Sản phẩm đo ở bước sóng 540nm. Hàm lượng đường sau phản ứng được xác định thông qua đồ thịđường chuẩn glucose.
2.5.6. Đánh giá ảnh hưởng của pH ban đầu
Các chủng VSV được nuôi trực tiếp trên môi trường dịch thể có pH khác nhau (pH= 4,5,6,7,8), sau 5 ngày, lọc thu sinh khối, kiểm tra enzym
2.5.7. Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong điều kiện môi trường và pH thích hợp ở các nhiệt độ khác nhau: 20, 30, 40, 50, 600C
Sau 5 ngày xác định các thông số: pH sau nuôi cấy; Sinh khối; Hoạt tính enzyme. So sánh kết quảđể lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp.
2.5.8. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến vi sinh vật
- Vi sinh vật được nuôi cấy lắc trên môi trường cơ bản có sự thay thế các nguồn cacbon khác nhau: Tinh bột 1%, Tinh bột 2%, Glucoza 1%, Lactoza 1%, Saccaroza 1% . Sau 5 ngày xác định pH sau nuôi cấy, sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào.
- Các chủng VSV được nuôi cấy lắc trên môi trường cơ bản có sự thay thế
các nguồn nitơ khác nhau: Cao nấm men 1%, NH4Cl 0,1%, (NH4)2SO4 0,2%, Pepton 1% KNO3 0,1%. Sau 5 ngày xác định pH sau nuôi cấy, sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào
2.5.9. Phương pháp xác định tính đối kháng giữa các chủng VSV
- Sử dụng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch đĩa.
2.5.10. Phương pháp định tên vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm
Định tên vi khuẩn, xạ khuẩn được thực hiện theo phương pháp sinh học phân tử. ADN xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm được tách chiết theo phương pháp Marmur (1961) và Saito (1963) cải tiến. Phản ứng PCR nhân trình tự gen 16S rRNA đặc thù với mồi đặc thù cho xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm. Tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR. Xây dựng cây phả hệ bằng phương pháp Maximum Parsimony, tính toán bằng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
2.5.11. Phương pháp sản xuất chế phẩm vi sinh vật
Chế phẩm vi sinh được sản xuất theo phương pháp nhân sinh khối riêng rẽ
trên nền chất mang thanh trùng.
Các chủng vi khuẩn được cấy truyền từ ống giống vào 100ml môi trường dịch thể, trên máy lắc với tốc độ 125 vòng/phút trong một ngày. Sau đó đem giống cấp 1 nhân tiếp vào 1000ml dịch thể trên máy lắc 125 vòng/phút trong 2 ngày. Sau
đó kiểm tra chất lượng chế phẩm theo TCVN 6168: 2002.
Các chủng nấm và chủng xạ khuẩn được nhân riêng rẽ trên môi trường thạch
đĩa ở 280C trong 3 ngày, sau đó đem nhân tiếp trên môi trường chất mang (thành phần chất mang gồm cám gạo, cám ngô và bột đậu tương theo tỷ lệ khối lượng 6:3:1 được trộn với một số chất phụ gia) trong 3 – 5 ngày. Sau đó kiểm tra chất lượng chế phẩm TCVN 6168: 2002.
2.5.12. Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm
Theo Jan Beyea (1995), Eliot Epstein (1997), Nguyễn Xuân Thành (2004), sử
dụng hỗn hợp các chủng vi sinh vật theo tỷ lệ 1 nấm: 1 vi khuẩn: 1 xạ khuẩn để xử
lý phụ phẩm quả vải sau thu hoạch sẽ giúp xử lý phụ phẩm nhanh hơn, đồng thời nâng cao hàm lượng dinh dưỡng trong quá trình ủ. Vì vậy, tiến hành thí nghiệm chậu vại với các bộ thí nghiệm kết hợp giữa 1 nấm, 1 vi khuẩn, 1 xạ khuẩn khác nhau đểđánh giá xem bộ kết hợp nào tốt nhất để sản xuất chế phẩm.
Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải của chế phẩm vi sinh ở quy mô chậu vại. Thí nghiệm gồm 5 công thức, mỗi công thức 2kg phế phẩm/1 chậu vại. CT1: ĐC – 2kg phụ phẩm CT2: Bổ sung 1% CP từ nấm N18 + XK X10 + VK V19 tỷ lệ 1:1:1 CT3: Bổ sung 1% CP từ nấm N18 + XK X10 + VK V98 tỷ lệ 1:1:1 CT4: Bổ sung 1% CP từ nấm N34 + XK X10 + VK V19 tỷ lệ 1:1:1 CT5: Bổ sung 1% CP từ nấm N34 + XK X10 + VK V98 tỷ lệ 1:1:1
Thí nghiệm 2:Đánh giá hiệu quả xử lý phụ phẩm với tổ hợp VSV quy mô
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
CT1: đối chứng – không bổ sung chế phẩm VSV
CT2: bổ sung 1% chế phẩm Emina (Viện sinh học nông ngiệp)
CT3: bổ sung 1% chế phẩm VSV tổ hợp 3 chủng N34, V19 và X10 theo tỷ
lệ 1:1:1
Tỷ lệ các chất phụ gia sử dụng đểủ 1 tấn phụ phẩm quả vải: 35kg NPK; 10kg vôi; 15 – 20kg phân trâu bò; 1% chế phẩm, độ ẩm duy trì ở 50 – 60% (Nguyễn Xuân Thành, B2004 – 32 – 66).
Đánh giá hiệu quả xử lý chế phẩm thông qua xác định phân tích các chỉ tiêu: pH: Đo trực tiếp bằng máy pH - meter; OC (%): Phương pháp Walkley - Black; K2O (%): Phương pháp quang kế ngọn lửa, công phá bằng hỗn hợp H2SO4 + HClO4; P2O5 (%): Phương pháp so màu, công phá bằng hỗn hợp H2SO4 + HClO4, N (%): Phương pháp Kjelhal, công phá bằng H2SO4, hỗn hợp xúc tác.
2.5.13. Phương pháp xử lý số liệu
- Các số liệu thu được từđiều tra sơ cấp và thứ cấp được xử lý trên máy tính bằng phần mềm Execl.
- Áp dụng các công thức tính toán, các hệ số kinh nghiệm để tính toán. - Kết quảđược trình bày bằng bảng số liệu, biểu đồ, bản đồ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Phân lập, tuyển chọn VSV từ các mẫu nghiên cứu
3.1.1. Kết quả phân tích VSV
Tiến hành phân tích các chỉ tiêu VKTS, XKTS, NTS từ 150 mẫu đất hữu cơ và 150 mẫu phụ phẩm đã hoai mục
Bảng 3.1. Số lượng vi sinh vật trong 1g mẫu phế phẩm (CFU/g)
Địa điểm Nguồn mẫu Mẫu Số lượng VSV (CFU/g) VKTS XKTS NTS Xã Nghĩa Hồ Phụ phẩm quả vải hoai mục M1 1,99.106 7,25. 105 6,48. 105 M2 1,86.106 6,69. 105 5,47. 105 Thị Trấn Chũ M3 1,81.106 4,52. 105 5,61. 105 M4 1,83.106 4,77. 105 5,58. 105 Xã Nghĩa Hồ Đất trồng vải M5 1,72.106 3,82. 105 9,8. 104 M6 1,35.106 4,22. 105 3,46. 105 Thị Trấn Chũ M7 1,19.106 3,96. 105 1,78. 105 M8 1,77.106 2,06. 105 3,77. 105 Kết quả bảng 3.1 cho thấy tại các mẫu nghiên cứu mật độ VSV tương đối lớn, VKTS chiếm tỉ lệ lớn nhất 59%, NTS và XKTS chiếm tỷ lệ tương đương 20,5%. Trong các mẫu đất, hàm lượng NTS và XKTS dao động trong khoảng 9,8x104 - 4,2x105 CFU/g, VKTS dao động 1,1x106– 1,7x106 CFU/g. Tại 4 mẫu phụ phẩm vải đã hoai mục thành phần và số lượng VSV cũng đa dạng, hàm lượng NTS và XKTS trung bình 4,5x105 – 7,2x105 CFU/g, VKTS trung bình
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
1,9x106 CFU/g.
3.1.2. Kết quả phân lập VSV
Tiến hành phân lập các chủng VSV có khả năng phân hủy Xenluloza từ 300 mẫu đất hữu cơ và phụ phẩm sau thu hoạch quả vải hoai mục trên các môi trường khác nhau (PDA, Gause 1, vi khuẩn tổng số, Ixenhetxki và Contrep, Lauria Betani (LB), XKTS…). Kết quả đã phân lập và thuần khiết được 42 chủng nấm (kí hiệu từ N1-N42), 20 chủng xạ khuẩn (kí hiệu từ X1-X20), 98 chủng vi khuẩn (kí hiệu từ V1-V98).
3.2. Tuyển chọn và đánh giá đặc tính sinh học
3.2.1. Đánh giá hoạt tính enzym ngoại bào VSV phân lập
Để có những giống vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza cao nhằm mục đích xử lí phụ phẩm quả vải thì phải đánh giá hoạt tính xenlulaza của chúng.
Đồng thời thử hoạt tính enzym amylaza và proteaza bởi vì trong phụ phẩm quả vải thì ngoài xenluloza còn có chứa tinh bột, protein.... Vì vậy cần ưu tiên những chủng có cả 4 hoạt tính Xenlulaza, CMCaza, Amylaza, Proteaza mạnh nhất và tương đối
đồng đều nhau trong việc chọn lựa để tiếp tục tiến hành đánh giá đặc tính sinh học. Dùng phương pháp khuếch tán phóng xạ trên môi trường thạch đĩa (Wiliam, 1983) xác định cường độ phân giải CMC, xenluloza, tinh bột, protein để kiểm tra hoạt tính của các chủng VSV đã phân lập được ở trên. Theo phương pháp này thì chủng nào có kích thước vòng phân giải lớn sẽ có hoạt tính enzym mạnh và ngược lại chủng nào tạo vòng phân giải nhỏ thì hoạt tính enzym yếu. Kết quả ta đã chọn ra
được 14 chủng VSV gồm 4 chủng nấm (N8, N17, N18, N34), 6 chủng xạ khuẩn (X5, X6,X7, X10, X12, X20), 4 chủng vi khuẩn (V19, V57, V96, V98) có đủ 3 nhóm hoạt tính enzym ngoại bào và khá mạnh để tiếp tục nghiên cứu ở các bước tiếp theo. Tỷ lệ
số chủng chọn được so với số chủng ban đầu của nấm là 0,1%, của xạ khuẩn là 0,3%, của vi khuẩn là 0,04%. Kết quảđược thể hiện trong bảng sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
Bảng 3.2: Hoạt tính enzym của các chủng VSV được chọn Các chủng
VSV
Hoạt tính enzyme (D-d, mm)
Xenlulaza CMC Amylaza Proteaza
N8 17,3 16,4 9,2 18,5 N17 19,7 18,4 9,6 17,4 N18 20,7 19,4 15,8 18,6 N34 21,1 18,6 15,3 19,4 X5 17,5 17,5 18 16,0 X6 17 17,7 17,5 15,0 X7 22,5 20 19,6 20,6 X10 22 18,6 17 21,0 X12 19,6 17,5 13 19 X20 20 18 14,5 20 V19 27 24 17 18 V57 25 19 17 19 V96 23 20 18 18 V98 27 23 17 18
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 Bảng 3.3: Hoạt độ enzym xenlulaza của các chủng VSV Chủng VSV OD540 Hoạt độ (U/ml) ĐC TN N18 0,127 4,33 312,1 N3.4 6,60 480,6 X5 0,234 7,94 X6 0,180 3,93 X7 0,618 36,42 X10 0,437 23,02 X12 0,320 14,33 X20 0,284 16,24 V19 0,143 1,204 V57 0,127 0,016 V96 0,128 0,017 V98 0,138 0,833
Kết quảđánh giá hoạt độ enzym của xenluloza ở bảng 3.3 cho thấy nấm có hoạt độ cao hơn xạ khuẩn và cao hơn vi khuẩn. Nhìn chung các chủng có 4 hoạt tính enzym ngoại bào cao thì cũng có hoạt độ xenluloza tốt hơn.
3.2.2. Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau
Việc xác định ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đối với các chủng VSV nhằm chọn ra được môi trường tối ưu nhất cho chủng VSV đó. Đây cũng là một trong các bước cơ bản trong việc lựa chọn giống để sản xuất chế phẩm sinh học. Ngoài ra trong điều kiện ủ phân hữu cơ, thực tế sẽ có nhiều chất có nguồn gốc từ tự nhiên và có thể có những chất gây ức chếđến sinh trưởng và khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng VSV. Vì vậy các chủng lựa chọn sản xuất chế phẩm phải có khả năng thích ứng với thành phần môi trường cao và vẫn thể hiện được vai trò của chúng.
Nuôi cấy các chủng VSV trên các môi trường khác nhau để lựa chọn môi trường thích hợp nhất cho các chủng VSV. Môi trường để nuôi cấy các chủng nấm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39
là Martin, Sabourand, Czapek-Dox, PDA; các chủng xạ khuẩn là A – 4H, A – 4 , ISP – 4, Gause 1, XKTS; các vi khuẩn là vi khuẩn tổng số, Ixenhetxki và Contrep, thạch thường – glucoza, Lauria Betani (LB). Sau 5 ngày xác định pH sau nuôi cấy, sinh khối và hoạt tính enzym.
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào của nấm
Chủng nấm Môi trường pH sau nuôi Sinh khối (g/l) Hoạt tính enzyme (D-d, mm) Xenlulaza Amylaza Proteaza
N8 Martin 4,50 1.813 13,4 8,7 11,8 Sabourand 3,46 5,098 18,6 10,1 14,6 Czapek-Dox 6,18 2,584 11,3 0 15,9 PDA 2,57 6,093 16,7 0 21,5 N17 Martin 4,36 2,440 17,3 9 11,5 Sabourand 2,53 6,707 0 0 14,7 Czapek-Dox 6,05 3,813 0 0 0 PDA 2,43 7,336 20,4 11,6 19,4 N18 Martin 3,23 2,086 20,7 13,4 19,2 Sabourand 4,46 4,042 20,5 13,6 14,4 Czapek-Dox 5,88 6,119 18,2 15,1 18,4