sp.), AG-B4 (Bacillus pumilus), AG-B17 (Bacillus sp.), AG-B27 (Bacillus megaterium) đối với nấm Sclerotium sp.
- Chuẩn bị nguồn nấm bệnh: nấm Sclerotium sp. đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA trong 4 ngày.
- Chuẩn bị nguồn vi khuẩn đối kháng: các chủng vi khuẩn AG-B1, AG-B4, AG- B17, AG-B27 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng King’s B trong 2 ngày để vi khuẩn nhân mật số. - Tiến hành thí nghiệm: Khoanh nấm Choanephora sp. Môi trƣờng PDAP 2 3 1
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố bao gồm 5 nghiệm thức với 5 lần lặp lại; trong đó, mỗi chủng vi khuẩn đối kháng đƣợc xem là một nghiệm thức và một nghiệm thức đối chứng nƣớc cất, mỗi đĩa Petri tƣơng ứng với một lần lặp lại.
Mỗi đĩa Petri đƣợc đánh dấu 4 điểm bao gồm một điểm ngay tâm và ba điểm là ba đỉnh tạo thành tam giác đều, đối xứng nhau qua tâm và cách tâm 2,5 cm. Một đỉnh của tam giác đánh dấu là nghiệm thức đối chứng, hai đỉnh còn lại là hai nghiệm thức vi khuẩn đối kháng (Hình 2.2).
Cách tiến hành thí nghiệm cũng tƣơng tự nhƣ thí nghiệm đối kháng với nấm Choanephora sp. Tuy nhiên, khoanh nấm Sclerotium sp. đƣợc đặt cùng thời điểm với thời điểm đặt khoanh giấy thấm chứa vi khuẩn đối kháng.
Sau đó, đặt các đĩa Petri bố trí thí nghiệm ở nhiệt độ phòng và theo dõi lấy chỉ tiêu.
- Ghi nhận chỉ tiêu: đo bán kính vành khăn vô khuẩn, bán kính nấm về phía vi khuẩn, bán kính nấm về phía đối chứng vào các thời điểm 2NSKC, 3NSKC, 4NSKC, 5NSKC, 6 NSKC và tính ra hiệu suất đối kháng (HSĐK) theo công thức:
HSĐK (%) =
Trong đó: BKđc: Bán kính nấm về phía đối chứng BKvk: Bán kính nấm về phía vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn đƣợc đánh giá khả năng đối kháng dựa trên thang đánh giá của Soytong (1988) tƣơng tự nhƣ thí nghiệm đối kháng với nấm Sclerotium sp.
* Xử lý số liệu và phân tích thống kê:
Số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm Microsotf Office Excel và phân tích trên phần mềm phân tích thống kê MSTATC theo phép thử Duncan.
2 3 1 Khoanh nấm Sclerotium sp. Môi trƣờng PDAP
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. XÁC ĐỊNH NẤM CHOANEPHORA SP.
3.1.1. Triệu chứng bệnh ngoài đồng
Bệnh xuất hiện cả trên thân và lá, chủ yếu là trên lá. Ban đầu vết bệnh phát triển trên lá non là những đốm bất dạng xuất hiện dọc theo rìa lá, làm lá cong lại (Hình 3.1 A), về sau vết bệnh phát triển lớn hơn lan dần vào trong, làm mô lá khô lại và có màu nâu. Trên phần mô lá bị bệnh có xuất hiện tơ nấm màu trắng và túi bào tử màu đen đính phía trên (Hình 3.1 B).
3.1.2. Đặc điểm nấm
Khi nuôi cấy nấm trên môi trƣờng PDA, quan sát thấy sợi nấm có màu trắng và phát triển rất nhanh. Sợi nấm mọc bông lên cao so với môi trƣờng và có thể mọc chạm vào mép đĩa tại thời điểm 48 – 50 GSKC (Hình 3.2 A và B). Nấm bắt đầu tạo các túi bào tử màu đen (Hình 3.2 C và D), chủ yếu là xung quanh mép đĩa ở thời điểm 70 – 72 GSKC.
Hình 3.1: Triệu chứng bệnh do nấm Choanephora sp. trong điều kiện ngoài đồng (A): Triệu chứng bệnh trên lá
(B): Sợi nấm và túi bào tử chụp từ kính nhìn nổi, độ phóng đại 4X
B A
A B
Hình 3.2. Tản nấm Choanephora sp. trên môi trƣờng PDA A x B: Mặt trên và mặt dƣới tản nấm ở 2 NSKC
C: Tản nấm hình thành túi bào tử ở 3 NSKC
D: Tản nấm hình thành túi bào tử đƣợc phóng to ở 3 NSKC
A B
Quan sát dƣới kính hiển vi, bào tử nấm có màu nâu hoặc nâu đen, đƣợc chứa trong các túi bào tử và các túi bào tử này đƣợc đính trên các cuống bào tử (Hình 3.3 A), theo quan sát nhận thấy bào tử có hình trứng hay elip (Hình 3.3 B), kích thƣớc của bào tử đƣợc ghi nhận là 7,5 – 10 x 15 – 20 µm, trung bình 8 x 17,3 µm.
So sánh các đặc điểm mô tả trên với tài liệu của Hesseltine (1961), Barnett và Hunter (1998), Kwon và ctv. (2001) thì đây là nấm Choanephora sp.
3.1.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo
Kết quả lây bệnh nhân tạo cho thấy nấm tấn công cây ký chủ nhanh, bắt đầu xuất hiện triệu chứng bệnh vào 1 ngày sau khi lây bệnh (NSKLB) và gây ra triệu chứng bệnh rõ rệt qua các thời điểm khảo sát. Cụ thể nhƣ sau:
Thời điểm 1 NSKLB, vết bệnh xuất hiện các đốm bất dạng màu nâu nhạt ngoài rìa lá và làm lá cong lại (Hình 3.4 A).
Thời điểm 2 NSKLB, mô bệnh nhũn nƣớc, màu nâu đen và có các tơ nấm màu trắng xuất hiện (Hình 3.4 B).
Thời điểm 3 NSKLB, nấm tấn công lên cả thân cây, làm thân bị nhũn và rũ xuống (Hình 3.4 C).
Thời điểm 4 NSKLB, thân cây bị nhũn hoàn toàn, mô cây chuyển sang màu đen (Hình 3.4 D).
Hình 3.3: Hình thái nấm Choanephora sp.
(A): Cành bào đài mang bào tử ở vật kính 40X (B): Bào tử ở vật kính 40X
B A
Hình 3.4: Triệu chứng bệnh do nấm Choanephora sp. sau khi lây bệnh nhân tạo
(A): Vết bệnh xuất hiện trên lá ờ 1 NSKLB (B): Vết bệnh xuất hiện nhiều tơ nấm ở 2 NSKLB (C): Bệnh tấn công cà thân và lá ở 3 NSKLB (D): Cây bệnh thối nhũn hoàn toàn ở 4 NSKLB
A
D C
3.2. XÁC ĐỊNH NẤM SCLEROTIUM SP. 3.2.1. Triệu chứng bệnh ngoài đồng 3.2.1. Triệu chứng bệnh ngoài đồng
Nấm gây bệnh cả trên thân và lá, tạo nhiều tơ nấm màu trắng bao quanh rất dễ qua sát trong buổi sáng sớm (Hình 3.5 A). Nấm tấn công từ thân lên lá, ban đầu mô bệnh nhũn nƣớc làm thân bị thối và lá rất dễ rách, sau đó vết bệnh khô lại chuyển sang màu nâu, có sự xuất hiện của nhiều hạch nấm (Hình 3.5 B).
3.2.2. Đặc điểm nấm
Nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA bằng hạch nấm hoặc sợi nấm ở nhiệt độ phòng, quan sát dƣới kính hiển vi cho thấy sợi nấm không màu, phân nhánh, có vách ngăn, có các mấu liên kết tại vị trí vách ngăn (Hình 3.6), đƣờng kính sợi nấm từ 7,5 – 12,5 µm, trung bình 10,3 µm.
A
Hình 3.5: Triệu chứng bệnh do nấm Sclerotium sp. trong điều kiện ngoài đồng (A): Triệu chứng trên thân, có nhiều tơ nấm
(B): Cây chết hoàn toàn và có sự xuất hiện của nhiều hạch nấm
Quan sát 3 NSKC nấm phát triển rất nhanh, mạnh và dày. Tản nấm hình tròn, chia ra làm hai phần, phần phía ngoài sợi nấm mọc nhô lên và dày, phần phía trong gần hạch nấm hoặc tại vị trí cấy thì mọc thƣa và sát môi trƣờng (Hình 3.7 A và B). Đến thời điểm 4 NSKC nấm phát triển chạm đến mép đĩa và có khả năng mọc lên thành đĩa. Nấm tạo hạch vào thời điểm 18 NSKC (Hình 3.7 C). Hạch nấm có dạng hình cầu, bề mặt trơn láng, rắn chắc, ban đầu hạch nấm có màu trắng sau chuyển sang màu vàng và cuối cùng là màu nâu đỏ (Hình 3.7 D). Kích thƣớc đƣờng kính hạch nấm 1,18 – 1,40 x 1,23 – 1,55 mm, trung bình 1,31 x 1,41 mm.
So sánh các đặc điểm mô tả trên với tài liệu của Barnett và Hunter (1998), Watanabe (2002), Agrios (2005) và Lê Thị Thùy (2013) thì đây là nấm Sclerotium
sp.
A B
3.2.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo
Thời điểm 2 NSKLB, hạch nấm bắt đầu nảy mầm, vết bệnh xuất hiện trên thân và có nhiều tơ nấm màu trắng (Hình 3.8 A).
Thời điểm 4 NSKLB, vết bệnh xuất hiện cả trên thân và lá của cây (Hình 3.8 B). Giữa mô bệnh và mô khỏe trên lá có đƣờng viền rõ ràng, ban đầu lá bị bệnh có màu vàng chuyển sang màu nâu khi bệnh phát triển nặng.
Thời điểm 8 NSKLB, có nhiều tơ nấm xuất hiện cả trên thân và lá, làm lá và thân bị thối (Hình 3.8 C).
Thời điểm 12 NSKLB, thân và lá cây bệnh bị thối hoàn toàn với sự xuất hiện của nhiều hạch nấm (Hình 3.8 D).
Hình 3.8: Triệu chứng bệnh do nấm Sclerotium sp. sau khi lây bệnh nhân tạo
A B
3.3. KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA 4 CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS ĐỐI VỚI NẤM CHOANEPHORA SP. VỚI NẤM CHOANEPHORA SP.
Kết quả đánh giá bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) của các chủng vi khuẩn AG-B1 (Bacillus sp.), AG-B4 (Bacillus pumilus), AG-B17 (Bacillus sp.), AG-B27 (Bacillus megaterium) đối với nấm Choanephora sp. đƣợc trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy các nghiệm thức vi khuẩn cho bán kính vành khăn vô khuẩn có sự khác nhau và khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng ở mức 5%. Qua đó cho thấy:
Thời điểm 12 GSKC, chủng vi khuẩn AG-B27 cho BKVKVK cao nhất, khác biệt ý so với các chủng vi khuẩn còn lại và đạt 5,0 mm. Tiếp đến là hai chủng vi khuẩn AG-B4 và AG-B17 cho BKVKVK không khác biệt nhau và đạt lần lƣợt là 3,0 mm và 3,8 mm. Chủng vi khuẩn AG-B1 cho BKVKVK thấp nhất là 2,0 mm.
Bốn chủng vi khuẩn cho BKVKVK có sự khác biệt rõ rệt vào thời điểm 18 GSKC. Theo đó, chủng vi khuẩn AG-B27 cho BKVKVK cao nhất và đạt 4,6 mm, tiếp đến là chủng vi khuẩn AG-B17 (3,4 mm) và AG-B4 (2,4 mm), chủng vi khuẩn AG-B1 cho BKVKVK thấp nhất (1,6 mm).
Đến thời điểm 24 GSKC, chủng vi khuẩn AG-B27 vẫn cho BKVKVK cao nhất (4,2 mm), tiếp đến là chủng vi khuẩn AG-B17 (3,4 mm), hai chủng vi khuẩn AG-B1 và AG-B4 cho BKVKVK thấp nhất, không khác biệt nhau và khác biệt ý nghĩa so với hai chủng vi khuẩn còn lại, đạt lần lƣợt là 1,4 mm và 1,6 mm.
Bảng 3.1: Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) của 4 chủng vi khuẩn AG-B1, AG- B4, AG-B17 và AG-B27 đối với nấm Choanephora sp.
Nghiệm thức Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) 12 GSKC 18 GSKC 24 GSKC AG-B1 2,0 c 1,6 d 1,4 c AG-B4 3,0 b 2,4 c 1,6 c AG-B17 3,8 b 3,4 b 3,4 b AG-B27 5,0 a 4,6 a 4,2 a Đối chứng 0,0 d 0,0 e 0,0 d
Mức ý nghĩa * * * CV (%) 24,0 20,4 22,1
Ghi chú: Các số trong cùng một cột có các ký tự giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan.
Kết quả đánh giá hiệu suất đối kháng (%) của các chủng vi khuẩn AG-B1 (Bacillus sp.), AB-G4 (Bacillus pumilus), AG-B17 (Bacillus sp.), AG-B27 (Bacillus megaterium) đối với nấm Choanephora sp. đƣợc trình bày ở Bảng 3.2 cho thấy hiệu suất đối kháng của bốn nghiệm thức vi khuẩn đối kháng khác biệt nhau và khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng ở mức 5%. Cụ thể:
Vào thời điểm 12 GSKC, chủng vi khuẩn AG-B17 cho hiệu suất đối kháng đạt 36,5% cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với chủng vi khuẩn AG-B1 nhƣng không khác biệt so với chủng vi khuẩn AG-B4, chủng vi khuẩn AG-B27 cho hiệu suất đối kháng thấp nhất (21,3%) và khác biệt ý nghĩa so với ba chủng vi khuẩn còn lại. Theo thang đánh giá của Soytong (1988), hiệu suất đối kháng của cả bốn chủng vi khuẩn chỉ đạt ở mức đối kháng yếu (thấp hơn 50%) vào thời điểm này.
Thời điểm 18 GSKC, hai chủng vi khuẩn AG-B17 và AGB27 cho HSĐK tăng mạnh so với thời điểm 12 GSKC, không khác biệt nhau và đạt lần lƣợt là 60,0%; 56,8%; nhƣng cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với hai chủng vi khuẩn AG- B1 (41,8%) và AG-B4 (45,1%). Hai chủng vi khuẩn AG-B17 và AG-B27 cho HSĐK tăng mạnh và đạt mức đối kháng trung bình (50 – 60%), trong khi hai chủng vi khuẩn AG-B1 và AG-B4 vẫn đạt mức đối kháng yếu.
Tƣơng tự, đến thời điểm 24 GSKC (Hình 3.9), hai chủng vi khuẩn AG-B17 và AG-B27 vẫn cho HSĐK cao nhất, không khác biệt nhau và đạt lần lƣợt là 77,6%; 73,6%; cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với hai chủng vi khuẩn AG-B1 (56,0%) và AG-B4 (56,8%). Hai chủng vi khuẩn AG-B1 và AG-B4 đạt mức đối kháng trung bình với HSĐK trên 50%, chủng vi khuẩn AG-B27 đạt mức đối kháng cao (60 - 75%), còn chủng vi khuẩn AG-B17 cho HSĐK đạt ở mức rất cao (>75%).
Bảng 3.2: Hiệu suất đối kháng (%) của 4 chủng vi khuẩn AG-B1, AG-B4, AG-B17 và AG-B27 đối với nấm Choanephora sp.
Nghiệm thức Hiệu suất đối kháng (%)
12 GSKC 18 GSKC 24 GSKC
AG-B1 31,8 b 41,8 b 56,0 b
AG-B4 33,4 ab 45,1 b 56,8 b
AG-B27 21,3 c 56,8 a 73,6 a
Đối chứng 0,0 d 0,0 c 0,0 c
Mức ý nghĩa * * *
CV (%) 13,2 17,3 11,4
Ghi chú: Các số trong cùng một cột có các ký tự giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan.
Qua kết quả khảo sát BKVKVK và HSĐK cho thấy 4 chủng vi khuẩn đều thể hiện khả năng đối kháng đối với nấm Choanephora sp. Chủng vi khuẩn AG- B27 vừa cho BKVKVK cao nhất vào tất cả các thời điểm khảo sát và HSĐK cao vào 24 GSKC, chủng vi khuẩn AG-B17 cho BKVKVK thấp hơn so với AG-B27 qua các thời điểm và HSĐK đạt mức rất cao vào 24 GSKC. Hai chủng vi khuẩn AG-B1 và AG-B4 cho BKVKVK thấp nhất và HSĐK chỉ đạt ở mức trung bình vào 24 GSKC.
3.4. KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA 4 CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS ĐỐI VỚI NẤM SCLEROTIUM SP. VỚI NẤM SCLEROTIUM SP.
Từ Bảng 3.3 trình bày về bán kính vành khăn vô khuẩn của bốn chủng vi khuẩn AG-B1, AG-B4, AG-B17 và AG-B27 đối với nấm Sclerotium sp. cho thấy cả bốn chủng vi khuẩn đều cho bán kính vành khăn vô khuẩn khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng ở mức ý nghĩa 5% qua các thời điểm khảo sát. Theo đó:
Hình 3.9: Khả năng đối kháng của 4 chủng vi khuẩn đối với nấm Choanephora sp. vào 24 GSKC
(A): Khả năng đối kháng của AG-B1 và AG-B4 (C): Khả năng đối kháng của AG-B17 và AG-B27
A B
AG-B4 AG-B1 AG-B27 AG-B17
Nghiệm thức AG-B1 cho BKVKVK đạt 4,2 mm thấp hơn và khác biệt ý nghĩa so với ba nghiệm thức vi khuẩn còn lại vào thời điểm 2 NSKC. Trong đó, ba nghiệm thức AG-B4, AG-B17 và AG-B27 cho BKVKVK không khác biệt nhau, đạt lần lƣợt là 5,2 mm; 5,0 mm và 5,0 mm.
Thời điểm 3 NSKC, chủng vi khuẩn AG-B4 cho BKVKVK đạt 4,6 mm, cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với chủng vi khuẩn AG-B1 (3,8 mm) nhƣng không khác biệt ý nghĩa so với hai chủng vi khuẩn AG-B17 (4,4 mm) và AG-B27 (4,4 mm).
Thời điểm 4 NSKC, chủng vi khuẩn AG-B4 cho BKVKVK cao nhất, đạt 4,2 mm, cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với ba chủng vi khuẩn còn lại là AG-B1 (3,0 mm), AG-B17 (3,4 mm) và AG-B27 (3,6 mm); trong đó, nghiệm thức AG-B27 cho BKVKVK cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức AG-B1 nhƣng không khác biệt so với nghiệm thức AG-B17.
Đến thời điểm 5 NSKC, hai chủng vi khuẩn AG-B4 và AG-B27 cho BKVKVK lần lƣợt là 3,4 mm và 3,6 mm, cao hơn và khác biệt ý nghĩa so với hai chủng vi khuẩn AG-B1 (2,6 mm) và AG-B17 (2,6 mm).
Bốn chủng vi khuẩn cho BKVKVK không khác biệt ý nghĩa vào thời điểm 6 NSKC và đạt lần lƣợt là 2,4 mm; 2,8mm; 2,2 mm và 2,8 mm.
Bảng 3.3: Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) của 4 chủng vi khuẩn AG-B1, AG- B4, AG-B17 và AG-B27 đối với nấm Sclerotium sp.
Nghiệm
thức Bán kính vành khăn vô khuẩn (mm)
2 NSKC 3 NSKC 4 NSKC 5 NSKC 6 NSKC AG-B1 4,2 b 3,8 b 3,0 c 2,6 b 2,4 a AG-B4 5,2 a 4,6 a 4,2 a 3,4 a 2,8 a AG-B17 5,0 a 4,4 ab 3,4 bc 2,6 b 2,2 a AG-B27 5,0 a 4,4 ab 3,6 b 3,6 a 2,8 a Đối chứng 0,0 c 0,0 c 0,0 d 0,0 c 0,0 b Mức ý nghĩa * * * * * CV (%) 13,6 13,6 14,1 20,1 20,8
Ghi chú: Các số trong cùng một cột có các ký tự giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% theo phép thử Duncan.
Kết quả đánh giá hiệu suất đối kháng của bốn chủng vi khuẩn AG-B1, AG- B4, AG-B17 và AG-B27 đối với nấm Sclerotium sp. đƣợc trình bày ở Bảng 3.4, cho thấy các nghiệm thức vi khuẩn đối kháng đều cho hiệu suất đối kháng khác biệt ý