Phƣơng pháp giám định bệnh

* Qui trình giám định

Áp dụng theo quy tắc Koch (Burgess và ctv., 2009) bao gồm các bƣớc: 1. Mô tả các triệu chứng biểu hiện ở cây trồng bị bệnh.

2. Phân lập vi sinh vật có thể là tác nhân gây bệnh, các mẫu cấy giống nhau đƣợc phân lập từ các cây có triệu chứng giống nhau.

3. Dùng một mẫu cấy sạch đã đƣợc làm thuần để lây bệnh lên cây khỏe mạnh.

4. Quan sát các triệu chứng biểu hiện ở các cây đã đƣợc lây bệnh, các triệu chứng phải giống nhƣ đã quan sát ban đầu trên cây trồng bị bệnh và tái phân lập mầm bệnh.

* Phƣơng pháp phân lập mầm bệnh

- Bệnh do nấm Choanephora sp.:

Mẫu bệnh thu đƣợc thu ngoài đồng về chƣa xuất hiện những tơ nấm màu trắng và mang túi bào tử màu đen thì tiến hành ủ mẫu, mẫu đƣợc ủ trong đĩa petri có lót giấy thấm tạo ẩm độ để sợi nấm phát triển, sau 24 giờ bằng mắt thƣờng có thể

thấy những sợi nấm và túi bào tử màu đen. Nếu thu mẫu có sẵn những tơ nấm màu trắng và túi bào tử màu đen thì đem về quan sát dƣới kính nhìn nổi và kính hiển vi. Lấy sợi nấm trực tiếp trên mô bệnh phân lập trên môi trƣờng thạch agar có streptomycin. Sau 24 giờ, tiến hành tách ròng, nuôi cấy nấm trên môi trƣờng PDA.

- Bệnh do nấm Sclerotium sp.:

Mẫu bệnh thu về có xuất hiện tơ nấm và cả hạch nấm, quan sát dƣới kính nhìn nổi đặc điểm của hạch nấm, đối với sợi nấm cạo và quan sát dƣới kính hiểu vi. Cắt mẫu bệnh thành từng đoạn nhỏ (0,5 cm), thanh trùng mặt ngoài với cồn 700 (30 giây), rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng (2 lần), tiến hành đặt mô bệnh lên môi trƣờng thạch agar, đối với hạch nấm thì đặt trực tiếp vào môi trƣờng. Sau 24 giờ tiến hành tách ròng, nuôi cấy nấm trên môi trƣờng PDA.

* Phƣơng pháp xác định tác nhân gây bệnh

Để xác định tên chi của mầm bệnh dựa vào khoá phân loại nấm của Barnett và Hunter (1998) cùng một số tài liệu chuyên ngành khác để so sánh hình dạng, kích thƣớc, màu sắc của đính bào đài, đính bào tử, ổ nấm, sợi nấm và hạch nấm. Các chi tiết này đƣợc so sánh với các tài liệu để đi đến xác định tên chi hoặc loài của nấm bệnh. Đối với nấm có bào tử thì quan sát dƣới kính hiển vi, đo kích thƣớc của 30 bào tử, lấy kích thƣớc dao động trong 30 bào tử đó.

* Phƣơng pháp lây bệnh nhân tạo

- Lây bệnh nhân tạo nấm Choanephora sp.

- Chuẩn bị cây lây bệnh: Rau diếp cá đƣợc trồng và chăm sóc sau một tuần. - Chuẩn bị nguồn bệnh: Nấm Choanephora sp. đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA, sau 3 – 4 ngày thì nấm tạo bào tử và thu lấy huyền phù bào tử nấm.

- Tiến hành lây bệnh:

 Lây bệnh trên lá bằng cách dùng kim châm tạo vết thƣơng mặt trên lá (9 chấm kim), huyền phù bào tử nấm đƣợc cho vào bình phun với mật số là 106 bào tử/ml và thể tích 100 ml cho một chậu rau diếp cá.

 Để chậu cây trong phòng ủ bệnh ở nhiệt độ 250C, trùm kín bằng túi nilon đen, phun nƣớc dƣới gốc tạo ẩm độ. Sau 24 giờ trong phòng ủ bệnh, cây đƣợc đem ra bên ngoài, tiến hành quan sát và ghi nhận triệu chứng bệnh. - Lây bệnh nhân tạo bằng hạch nấm Sclerotium sp.

- Chuẩn bị cây lây bệnh: Rau diếp cá đƣợc trồng và chăm sóc sau một tuần. - Nguồn bệnh: Nấm Sclerotium sp.đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA, sau

18 - 20 ngày thì nấm tạo hạch. - Tiến hành lây bệnh:

 Lây bệnh trên thân cây bằng cách lấy hạch nấm đặt vào nách lá với số lƣợng 10 hạch trên một chậu rau diếp cá.

nilon đen, phun nƣớc dƣới góc tạo ẩm độ. Sau 24 giờ trong phòng ủ bệnh, cây đƣợc đem ra bên ngoài, tiến hành quan sát và ghi nhận triệu chứng.

2.2.3 Nghiên cứu khả năng đối kháng của 4 chủng vi khuẩn AG-B1 (Bacillus

sp.), AG-B4 (Bacillus pumilus), AG-B17 (Bacillus sp.), AG-B27 (Bacillus megaterium) đối với nấm Choanephora sp.

- Chuẩn bị nguồn nấm bệnh: nấm Choanephora sp. đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA trong 3 ngày nấm tạo bào tử.

- Chuẩn bị nguồn vi khuẩn đối kháng: các chủng vi khuẩn AG-B1, AG-B4, AG- B17, AG-B27 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng King’s B trong 2 ngày để vi khuẩn nhân mật số.

- Tiến hành thí nghiệm:

Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố bao gồm 5 nghiệm thức với 5 lần lặp lại; trong đó, mỗi chủng vi khuẩn đối kháng đƣợc xem là một nghiệm thức và một nghiệm thức đối chứng nƣớc cất, mỗi đĩa Petri tƣơng ứng với một lần lặp lại.

Mỗi đĩa Petri đƣợc đánh dấu 4 điểm bao gồm một điểm ngay tâm và ba điểm là ba đỉnh tạo thành tam giác đều, đối xứng nhau qua tâm và cách tâm 2,5 cm. Một đỉnh của tam giác đánh dấu là nghiệm thức đối chứng, hai đỉnh còn lại là hai nghiệm thức vi khuẩn đối kháng (Hình 2.1)

Dùng khoanh giấy thấm thanh trùng đƣờng kính 5 mm cho vào nƣớc cất thanh trùng, lấy ra và để lên tờ giấy thấm thanh trùng trong 1 phút. Sau đó, đặt khoanh giấy thấm chứa nƣớc cất vào điểm đánh dấu.

Dùng khoanh giấy thấm thanh trùng đƣờng kính 5 mm nhúng vào huyền phù vi khuẩn đƣợc pha ở mật số 107 cfu/ml dựa trên đƣờng chuẩn, giữ trong 10- 15 giây, lấy ra và để lên tờ giấy thấm thanh trùng khoảng 1 phút. Sau đó, đặt khoanh giấy thấm chứa huyền phù vi khuẩn đối kháng vào đĩa Petri chứa 10 ml môi trƣờng PDAP vào các điểm đã đánh dấu.

Sau 24 giờ để đĩa Petri ở nhiệt độ phòng để vi khuẩn phát triển, dùng cây đục nấm đục khoanh nấm Choanephora sp. có đƣờng kính 5mm và đặt vào điểm trung tâm đĩa Petri.

Đặt các đĩa Petri bố trí thí nghiệm ở nhiệt độ phòng và theo dõi lấy chỉ tiêu.

- Ghi nhận chỉ tiêu: đo bán kính vành khăn vô khuẩn (BKVKVK), bán kính nấm về phía vi khuẩn, bán kính nấm về phía đối chứng vào các thời điểm 12 GSKC, 18 GSKC, 24 GSKC và tính ra hiệu suất đối kháng (HSĐK) theo công thức:

Trong đó: BKđc: Bán kính nấm về phía đối chứng BKvk: Bán kính nấm về phía vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn đƣợc đánh giá khả năng đối kháng dựa trên thang đánh giá của Soytong (1988; trích dẫn từ Trần Thị Thúy Ái, 2011) nhƣ sau:

HSĐK lớn hơn 75%: đối kháng rất cao

HSĐK từ lớn hơn 60% đến 75%: đối kháng cao HSĐK từ 50% đến 60%: đối kháng trung bình HSĐK thấp hơn 50%: đối kháng yếu

HSĐK bằng 0%: không có đối kháng.

2.2.4 Nghiên cứu khả năng đối kháng của 4 chủng vi khuẩn AG-B1 (Bacillus

sp.), AG-B4 (Bacillus pumilus), AG-B17 (Bacillus sp.), AG-B27 (Bacillus megaterium) đối với nấm Sclerotium sp.

- Chuẩn bị nguồn nấm bệnh: nấm Sclerotium sp. đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA trong 4 ngày.

- Chuẩn bị nguồn vi khuẩn đối kháng: các chủng vi khuẩn AG-B1, AG-B4, AG- B17, AG-B27 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng King’s B trong 2 ngày để vi khuẩn nhân mật số. - Tiến hành thí nghiệm: Khoanh nấm Choanephora sp. Môi trƣờng PDAP 2 3 1

Cách tiến hành thí nghiệm cũng tƣơng tự nhƣ thí nghiệm đối kháng với nấm Choanephora sp. Tuy nhiên, khoanh nấm Sclerotium sp. đƣợc đặt cùng thời điểm với thời điểm đặt khoanh giấy thấm chứa vi khuẩn đối kháng.

Sau đó, đặt các đĩa Petri bố trí thí nghiệm ở nhiệt độ phòng và theo dõi lấy chỉ tiêu.

- Ghi nhận chỉ tiêu: đo bán kính vành khăn vô khuẩn, bán kính nấm về phía vi khuẩn, bán kính nấm về phía đối chứng vào các thời điểm 2NSKC, 3NSKC, 4NSKC, 5NSKC, 6 NSKC và tính ra hiệu suất đối kháng (HSĐK) theo công thức:

HSĐK (%) =

Trong đó: BKđc: Bán kính nấm về phía đối chứng BKvk: Bán kính nấm về phía vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn đƣợc đánh giá khả năng đối kháng dựa trên thang đánh giá của Soytong (1988) tƣơng tự nhƣ thí nghiệm đối kháng với nấm Sclerotium sp.

* Xử lý số liệu và phân tích thống kê:

Số liệu đƣợc xử lý trên phần mềm Microsotf Office Excel và phân tích trên phần mềm phân tích thống kê MSTATC theo phép thử Duncan.

2 3 1 Khoanh nấm Sclerotium sp. Môi trƣờng PDAP

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. XÁC ĐỊNH NẤM CHOANEPHORA SP.

3.1.1. Triệu chứng bệnh ngoài đồng

Bệnh xuất hiện cả trên thân và lá, chủ yếu là trên lá. Ban đầu vết bệnh phát triển trên lá non là những đốm bất dạng xuất hiện dọc theo rìa lá, làm lá cong lại (Hình 3.1 A), về sau vết bệnh phát triển lớn hơn lan dần vào trong, làm mô lá khô lại và có màu nâu. Trên phần mô lá bị bệnh có xuất hiện tơ nấm màu trắng và túi bào tử màu đen đính phía trên (Hình 3.1 B).

3.1.2. Đặc điểm nấm

Khi nuôi cấy nấm trên môi trƣờng PDA, quan sát thấy sợi nấm có màu trắng và phát triển rất nhanh. Sợi nấm mọc bông lên cao so với môi trƣờng và có thể mọc chạm vào mép đĩa tại thời điểm 48 – 50 GSKC (Hình 3.2 A và B). Nấm bắt đầu tạo các túi bào tử màu đen (Hình 3.2 C và D), chủ yếu là xung quanh mép đĩa ở thời điểm 70 – 72 GSKC.

Hình 3.1: Triệu chứng bệnh do nấm Choanephora sp. trong điều kiện ngoài đồng (A): Triệu chứng bệnh trên lá

(B): Sợi nấm và túi bào tử chụp từ kính nhìn nổi, độ phóng đại 4X

B A

A B

Hình 3.2. Tản nấm Choanephora sp. trên môi trƣờng PDA A x B: Mặt trên và mặt dƣới tản nấm ở 2 NSKC

C: Tản nấm hình thành túi bào tử ở 3 NSKC

D: Tản nấm hình thành túi bào tử đƣợc phóng to ở 3 NSKC

A B

Quan sát dƣới kính hiển vi, bào tử nấm có màu nâu hoặc nâu đen, đƣợc chứa trong các túi bào tử và các túi bào tử này đƣợc đính trên các cuống bào tử (Hình 3.3 A), theo quan sát nhận thấy bào tử có hình trứng hay elip (Hình 3.3 B), kích thƣớc của bào tử đƣợc ghi nhận là 7,5 – 10 x 15 – 20 µm, trung bình 8 x 17,3 µm.

So sánh các đặc điểm mô tả trên với tài liệu của Hesseltine (1961), Barnett và Hunter (1998), Kwon và ctv. (2001) thì đây là nấm Choanephora sp.

3.1.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo

Kết quả lây bệnh nhân tạo cho thấy nấm tấn công cây ký chủ nhanh, bắt đầu xuất hiện triệu chứng bệnh vào 1 ngày sau khi lây bệnh (NSKLB) và gây ra triệu chứng bệnh rõ rệt qua các thời điểm khảo sát. Cụ thể nhƣ sau:

Thời điểm 1 NSKLB, vết bệnh xuất hiện các đốm bất dạng màu nâu nhạt ngoài rìa lá và làm lá cong lại (Hình 3.4 A).

Thời điểm 2 NSKLB, mô bệnh nhũn nƣớc, màu nâu đen và có các tơ nấm màu trắng xuất hiện (Hình 3.4 B).

Thời điểm 3 NSKLB, nấm tấn công lên cả thân cây, làm thân bị nhũn và rũ xuống (Hình 3.4 C).

Thời điểm 4 NSKLB, thân cây bị nhũn hoàn toàn, mô cây chuyển sang màu đen (Hình 3.4 D).

Hình 3.3: Hình thái nấm Choanephora sp.

(A): Cành bào đài mang bào tử ở vật kính 40X (B): Bào tử ở vật kính 40X

B A

Hình 3.4: Triệu chứng bệnh do nấm Choanephora sp. sau khi lây bệnh nhân tạo

(A): Vết bệnh xuất hiện trên lá ờ 1 NSKLB (B): Vết bệnh xuất hiện nhiều tơ nấm ở 2 NSKLB (C): Bệnh tấn công cà thân và lá ở 3 NSKLB (D): Cây bệnh thối nhũn hoàn toàn ở 4 NSKLB

D C

3.2. XÁC ĐỊNH NẤM SCLEROTIUM SP. 3.2.1. Triệu chứng bệnh ngoài đồng 3.2.1. Triệu chứng bệnh ngoài đồng

Nấm gây bệnh cả trên thân và lá, tạo nhiều tơ nấm màu trắng bao quanh rất dễ qua sát trong buổi sáng sớm (Hình 3.5 A). Nấm tấn công từ thân lên lá, ban đầu mô bệnh nhũn nƣớc làm thân bị thối và lá rất dễ rách, sau đó vết bệnh khô lại chuyển sang màu nâu, có sự xuất hiện của nhiều hạch nấm (Hình 3.5 B).

3.2.2. Đặc điểm nấm

Nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PDA bằng hạch nấm hoặc sợi nấm ở nhiệt độ phòng, quan sát dƣới kính hiển vi cho thấy sợi nấm không màu, phân nhánh, có vách ngăn, có các mấu liên kết tại vị trí vách ngăn (Hình 3.6), đƣờng kính sợi nấm từ 7,5 – 12,5 µm, trung bình 10,3 µm.

Hình 3.5: Triệu chứng bệnh do nấm Sclerotium sp. trong điều kiện ngoài đồng (A): Triệu chứng trên thân, có nhiều tơ nấm

(B): Cây chết hoàn toàn và có sự xuất hiện của nhiều hạch nấm

Quan sát 3 NSKC nấm phát triển rất nhanh, mạnh và dày. Tản nấm hình tròn, chia ra làm hai phần, phần phía ngoài sợi nấm mọc nhô lên và dày, phần phía trong gần hạch nấm hoặc tại vị trí cấy thì mọc thƣa và sát môi trƣờng (Hình 3.7 A và B). Đến thời điểm 4 NSKC nấm phát triển chạm đến mép đĩa và có khả năng mọc lên thành đĩa. Nấm tạo hạch vào thời điểm 18 NSKC (Hình 3.7 C). Hạch nấm có dạng hình cầu, bề mặt trơn láng, rắn chắc, ban đầu hạch nấm có màu trắng sau chuyển sang màu vàng và cuối cùng là màu nâu đỏ (Hình 3.7 D). Kích thƣớc đƣờng kính hạch nấm 1,18 – 1,40 x 1,23 – 1,55 mm, trung bình 1,31 x 1,41 mm.

So sánh các đặc điểm mô tả trên với tài liệu của Barnett và Hunter (1998), Watanabe (2002), Agrios (2005) và Lê Thị Thùy (2013) thì đây là nấm Sclerotium

sp.

A B

3.2.3. Kết quả lây bệnh nhân tạo

Thời điểm 2 NSKLB, hạch nấm bắt đầu nảy mầm, vết bệnh xuất hiện trên thân và có nhiều tơ nấm màu trắng (Hình 3.8 A).

Thời điểm 4 NSKLB, vết bệnh xuất hiện cả trên thân và lá của cây (Hình 3.8 B). Giữa mô bệnh và mô khỏe trên lá có đƣờng viền rõ ràng, ban đầu lá bị bệnh có màu vàng chuyển sang màu nâu khi bệnh phát triển nặng.

Thời điểm 8 NSKLB, có nhiều tơ nấm xuất hiện cả trên thân và lá, làm lá và thân bị thối (Hình 3.8 C).

Thời điểm 12 NSKLB, thân và lá cây bệnh bị thối hoàn toàn với sự xuất hiện của nhiều hạch nấm (Hình 3.8 D).

Hình 3.8: Triệu chứng bệnh do nấm Sclerotium sp. sau khi lây bệnh nhân tạo

A B

3.3. KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA 4 CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS ĐỐI VỚI NẤM CHOANEPHORA SP. VỚI NẤM CHOANEPHORA SP.

Kết quả đánh giá bán kính vành khăn vô khuẩn (mm) của các chủng vi khuẩn AG-B1 (Bacillus sp.), AG-B4 (Bacillus pumilus), AG-B17 (Bacillus sp.), AG-B27 (Bacillus megaterium) đối với nấm Choanephora sp. đƣợc trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy các nghiệm thức vi khuẩn cho bán kính vành khăn vô khuẩn có sự khác nhau và khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng ở mức 5%. Qua đó cho thấy:

Thời điểm 12 GSKC, chủng vi khuẩn AG-B27 cho BKVKVK cao nhất, khác biệt ý so với các chủng vi khuẩn còn lại và đạt 5,0 mm. Tiếp đến là hai chủng vi khuẩn AG-B4 và AG-B17 cho BKVKVK không khác biệt nhau và đạt lần lƣợt là 3,0 mm và 3,8 mm. Chủng vi khuẩn AG-B1 cho BKVKVK thấp nhất là 2,0 mm.

Bốn chủng vi khuẩn cho BKVKVK có sự khác biệt rõ rệt vào thời điểm 18 GSKC. Theo đó, chủng vi khuẩn AG-B27 cho BKVKVK cao nhất và đạt 4,6 mm, tiếp đến là chủng vi khuẩn AG-B17 (3,4 mm) và AG-B4 (2,4 mm), chủng vi khuẩn AG-B1 cho BKVKVK thấp nhất (1,6 mm).

Đến thời điểm 24 GSKC, chủng vi khuẩn AG-B27 vẫn cho BKVKVK cao

XÁC ĐỊNH NẤM SCLEROTIUM SP