3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nhân giống đến sự sinh trưởng của chủng nấm men tuyển chọn
3.2.1.1 Ảnh hưởng của độ pH
pH của môi trƣờng ảnh hƣởng đến sự phân li của các ion, đến cấu trúc và hoạt tính của protein nên có ý nghĩa quyết định đến sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp các chất của nấm men [10]. Xuất phát từ lý do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hƣởng của pH đến chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 trong môi trƣờng nhân giống MT2 với các độ pH 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5 ở 280
C trong máy lắc 180 vòng/phút, sau 24 giờ đếm số lƣợng tế bào.
33
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng S. cerevisiae N1
Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng, phát triển trên tất cả các pH mà nghiên cứu tiến hành (3 đến 5,5). Tuy nhiên sự sinh trƣởng đạt tốt nhất ở pH 4 – 4,5 chứng tỏ chủng này thuộc nhóm vi sinh vật ƣa axit và ở độ pH này cũng phù hợp với pH của dịch quả. Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn pH là 4 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh, Nguyễn Thị Huệ [1], [14].
3.2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là tác nhân vật lý có ảnh hƣởng sâu sắc đến tốc độ của các phản ứng hóa sinh trong tế bào vi sinh vật [10], vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 nhằm tìm ra khoảng nhiệt độ tối ƣu để áp dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. Chủng S. cerevisiae N1 sau khi đƣợc hoạt hóa đem cấy trên môi trƣờng thạch đĩa MT1 với số lƣợng tế bào ban đầu là 3,5 . 106, ở các nhiệt độ: 240
C, 280C, 320C, 360C, sau 24 giờ đếm số lƣợng tế bào.
34
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của chủng S. cerevisiae N1
Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng tốt trên khoảng nhiệt độ từ 24 – 360C và sinh trƣởng tốt nhất ở 28 – 320C. Căn cứ vào khoảng nhiệt độ tối ƣu này có thể kết luận chủng S. cerevisiae N1 thuộc nhóm vi sinh vật ƣa ấm trung bình. Chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 280C để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung khi nghiên cứu nấm men lên men vang vải thiều [3].
3.2.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ
Nitơ có tác dụng cung cấp nguyên liệu cho tế bào tổng hợp protein và các chất khác của nguyên sinh chất. Do đó, môi trƣờng nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hóa. Có rất nhiều nguồn nitơ vô cơ khác nhau nhƣ: (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, KNO3 và KNO2. Tuy nhiên trong thực tế sản xuất thì chỉ có nguồn (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 là đƣợc sử dụng làm nguồn cung cấp nitơ cho quá trình sinh trƣởng, phát triển của nấm men. Do nguồn nitơ ở dạng NH4+ gần với tiền chất của nitơ hữu cơ, là nguồn cung cấp nitơ rất dễ cho nấm men sử dụng. Còn KNO3 và KNO2
35
thƣ cho con ngƣời. Chính vì vậy chúng tôi đã nuôi cấy chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 trên môi trƣờng nhân giống MT2 pH: 4, có nguồn nitơ là (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4 với hàm lƣợng từ 1- 8g, trên máy lắc 180 vòng/phút ở 280C và sau 24 giờ tiến hành đếm số lƣợng tế bào để đánh giá sự phát triển của chủng nấm men trên từng nguồn nitơ khác nhau, ở các nồng độ khác nhau.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ vô cơ tới sự sinh trưởng của
chủng S. cerevisiae N1
Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng và phát triển tốt trên cả 2 nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4, tuy nhiên chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng tốt nhất trên môi trƣờng có nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4. Khi sử dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4 thì chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng phát triển mạnh nhất ở hàm lƣợng từ 3 – 4g/l (với số lƣợng tế bào là 162 . 106
/ml). Còn khi sử dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2HPO4 thì sự sinh trƣởng phát triển của chủng S. cerevisiae N1 mạnh nhất ở hàm lƣợng từ 2 – 3g/l (với số lƣợng tế bào là 157 . 106
/ml). Vì vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn nguồn nitơ vô cơ từ (NH4)2SO4 với hàm lượng
36
từ 3 – 4g/l để bổ sung vào quá trình nhân giống. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung [3].
3.2.1.4. Ảnh hưởng của pepton
Có rất nhiều nguồn nitơ khác nhau đƣợc sử dụng trong nuôi cấy nấm men. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng là hỗn hợp các axit amin (nấm men chỉ sử dụng đƣợc axit amin ở dạng tự nhiên), các peptit, các nucleotit,... .Trong thực tế ngƣời ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tƣơng, khô lạc,...) làm nguồn nitơ hữu cơ. Tuy nhiên chúng ta thấy rằng pepton là nguồn nitơ hữu cơ đƣợc sử dụng chủ yếu, bởi pepton là nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men cộng với giá thành thấp thích hợp cho quá trình sản xuất. Chính vì vậy chúng tôi đã nuôi cấy chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 này trên môi trƣờng nhân giống MT2 pH: 4, với hàm lƣợng pepton từ 1 đến 10g, trên máy lắc 180 vòng/phút ở 280
C và sau 24 giờ đếm số lƣợng tế bào để đánh giá ảnh hƣởng của pepton tới sự phát triển của chủng nấm men tuyển chọn.
Hình 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến sự sinh trưởng của
37
Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng, phát triển trên tất cả các hàm lƣợng peton mà nghiên cứu tiến hành (từ 1 – 10g). Tuy nhiên sự sinh trƣởng đạt tốt nhất ở hàm lƣợng peton từ 4 – 5g/l (với số lƣợng tế bào 165 . 106/ml). Vì vậy, chúng tôi quyết định lựa chọn hàm lượng pepton từ 4 – 5g/l để bổ sung vào quá trình nhân giống. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh [1].
3.2.1.5. Ảnh hưởng của KH2PO4
Photpho có vai trò quan trọng đối với nấm men, là nguyên liệu để tổng hợp lên axit nucleic, các enzyme, các hợp chất cao năng ATP… nếu thay đổi nồng độ của hợp chất photpho trong môi trƣờng sẽ dẫn đến sự thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho nhƣ tế bào chất và nhân. Vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của KH2PO4 đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng S. cerevisiae N1
nhằm tìm ra hàm lƣợng KH2PO4 tối ƣu để áp dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. Chủng S. cerevisiae N1 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nhân giống MT2 với nồng độ KH2PO4 là 0,5‰, 0,8‰, 1‰, 1,5‰ và 2‰, pH: 4, trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 280
C, 24 giờ đếm số lƣợng tế bào.
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến sự sinh trưởng của chủng
38
Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 sinh trƣởng, phát triển trên tất cả các nồng độ KH2PO4 mà nghiên cứu tiến hành (từ 0,5 - 2‰). Tuy nhiên sự sinh trƣởng đạt tốt nhất ở nồng độ KH2PO4 1‰ (với số lƣợng tế bào là 165 . 106/ml). Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ KH2PO4 thích hợp cho chủng S. cerevisiae N1 là 1‰. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung khi nghiên cứu nấm men lên men vang vải thiều [3].
3.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon của chủng nấm men tuyển chọn
3.2.2.1 Khả năng lên men ở các hàm lượng đường khác nhau
Đƣờng là nguồn cacbon đóng vai trò quan trọng nhất trong việc tạo thành rƣợu trong vang nho. Để nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men vang nho, chúng tôi tiến hành lên men chủng nấm men
S. cerevisiae N1 trong môi trƣờng lên men MT3, với hàm lƣợng đƣờng: 220g/l, 250g/l, 270g/l, 290g/l, ở 26 - 280C, pH: 4, hàm lƣợng men giống là 10%, trong 7 ngày, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae N1 ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau
Chỉ tiêu phân tích Hàm lƣợng đƣờng (g/l)
220 ± 0,2 250 ± 0,2 270 ± 0,2 290 ± 0,2
Lƣợng đƣờng sót (%) 4,8 ± 0,05 5,1 ± 0,05 5,7 ± 0,05 6,4 ± 0,05 Độ cồn (%V) 11,2 ± 0,04 10,4 ± 0,04 10,0 ± 0,04 9,1 ± 0,04
Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 có khả năng lên men ở tất cả các hàm lƣợng đƣờng. Tuy nhiên, hiệu suất lên men cao nhất là ở hàm lƣợng đƣờng 220g/l (với hàm lƣợng đƣờng sót thấp nhất là 4,8 và hàm lƣợng cồn cao nhất là 11,2), hàm lƣợng đƣờng càng cao thì hiệu suất lên men càng giảm.
39
Vì vậy chúng tôi quyết định lựa chọn hàm lượng đường trong dịch lên men 220g/l cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung trƣớc đó [3].
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến khả năng lên men
Để xác định ảnh hƣởng của KH2PO4 đến khả năng lên men của chủng nấm men tuyển chọn, chúng tôi tiến lên men chủng S. cerevisiae N1 trong môi trƣờng MT3: với nồng độ KH2PO4 là 0,5‰, 0,8‰, 1‰, 1,2‰; hàm lƣợng đƣờng 220g/l, pH: 4, hàm lƣợng men giống 10%, ở 280
C, trong 7 ngày, kết quả thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến khả năng lên men của chủng S.cerevisiae N1
Chỉ tiêu phân tích Nồng độ KH2PO4 (‰)
0,5 0,8 1 1,2
Lƣợng đƣờng sót (%) 5,8 ± 0,05 5,3 ± 0,05 4,8 ± 0,05 5,6 ± 0,05 Độ cồn (%V) 10,2 ± 0,04 10,5 ± 0,04 11,2 ± 0,04 10,7 ± 0,04
Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 lên men trên tất cả các nồng độ KH2PO4 mà nghiên cứu tiến hành. Tuy nhiên, hiệu suất lên men đạt cao nhất ở nồng độ KH2PO4 1‰ (với hàm lƣợng đƣờng sót thấp nhất là 4,8 và hàm lƣợng cồn cao nhất là 11,2). Ở nồng độ KH2PO4 0,5‰ khả năng lên men của chủng nấm men thấp do nồng độ KH2PO4 quá ít làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra chậm. Tƣơng tự nhƣ vậy, khi nồng độ KH2PO4 quá cao 1,2‰ sẽ làm rối loạn quá trình sinh tổng hợp các chất trong tế bào, do đó khả năng lên men của chủng nấm men cũng giảm. Căn cứ vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ KH2PO4 thích hợp cho quá trình lên men của chủng S. cerevisiae N1 là 1‰. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Quang Thảo trƣớc đó [18].
40
3.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng lên men
Để xác định ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 đến khả năng lên men của chủng nấm men tuyển chọn, chúng tôi tiến lên men chủng S. cerevisiae N1
trong môi trƣờng MT3: với nồng độ (NH4)2SO4 là 1‰, 2‰, 3‰, 4‰, 5‰, hàm lƣợng đƣờng 220g/l, pH: 4, hàm lƣợng men giống 10%, ở 280
C, trong 7 ngày, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng lên men của chủng S.cerevisiae N1 Chỉ tiêu đánh giá Nồng độ (NH4)2SO4 (‰) 1 2 3 4 5 Lƣợng đƣờng sót (g/l) 4,8 ± 0.05 4.7 ± 0,05 4,6 ± 0,05 5,0 ± 0,05 5,3 ± 0,05 Độ cồn (%V) 11,2 ± 0,04 11,3 ± 0,04 11,4 ± 0,04 10,8 ± 0,04 10,5± 0,04
Kết quả cho thấy, chủng S. cerevisiae N1 lên men trên tất cả các nồng độ (NH4)2SO4 mà nghiên cứu tiến hành. Tuy nhiên, chúng tôi thấy rằng nồng độ (NH4)2SO4 trong khoảng 2‰ – 3‰ thích hợp nhất cho quá trình lên men. Vì ở nồng độ này dịch lên men có hàm lƣợng đƣờng sót thấp từ 4,7 – 4,6 và hàm lƣợng cồn cao 11,3 – 11,4%V.
Bên cạnh đó chúng ta thấy rằng nồng độ (NH4)2SO4 trong dịch lên men tăng thì hàm lƣợng đƣờng sót cũng tăng, trong khi đó độ cồn đạt đƣợc giảm do pH của dung dịch thay đổi làm rối loạn quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men. Nếu quá ít sẽ làm tốc độ lên men yếu, hàm lƣợng đƣờng sót cũng tăng, hàm lƣợng cồn giảm. Kết quả nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung [3]. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn nguồn nitơ vô cơ từ (NH4)2SO4 với nồng độ 2‰ – 3‰ để bổ sung vào dịch lên men.
41
3.3. Lên men vang nho Cabernet sauvignon
3.3.1. Động thái lên men vang nho Cabernet sauvignon
Để xác định động thái lên men vang nho Cabernet sauvignon, chúng tôi tiến hành lên men chủng nấm men S. cerevisiae N1 trong môi trƣờng lên men MT3: với hàm lƣợng đƣờng 220g/l, pH: 4, hàm lƣợng men giống 10%, ở 280C. Tiến hành thu mẫu ngày một lần trong thời gian 7 ngày.
Hình 3.12. Động thái lên men vang nho Cabernet sauvignon của chủng S. cerevisiae N1
Kết quả cho thấy, trong quá trình lên men số lƣợng tế bào nấm men tăng dần và đạt cực đại ngay sau 1 ngày (với số lƣợng tế bào là 156 . 106
/ml), từ ngày thứ 2 trở đi số lƣợng tế bào giảm dần và thấp nhất ở ngày thứ 7 (với số lƣợng tế bào là 51 . 106/ml). Bên cạnh đó thì hàm lƣợng đƣờng giảm dần và hàm lƣợng cồn tăng dần (với hàm lƣợng đƣờng thấp nhất là 4,8% và hàm lƣợng cồn cao nhất là 11,3%V ở ngày cuối cùng của quá trình lên men),
42
nguyên nhân do phần lớn đƣờng đã chuyển hóa thành rƣợu, ngoài ra một lƣợng nhỏ tham gia vào quá trình chuyển hóa và hình thành nhiều loại axit hữu cơ, cũng nhƣ để duy trì hoạt động sống của tế bào nấm men. Vậy trong quá trình lên men vang nho Cabernet sauvignon thì số lượng tế bào nấm men phát triển tốt nhất ở cuối ngày đầu tiên và kết thúc quá trình lên men hàm lượng đường sót thấp nhất, độ cồn thu được cao nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung khi lên men vang vải thiều [3].
3.3.2. Lên men vang nho Cabernet sauvignon quy mô phòng thí nghiệm
Qua kết quả nghiên cứu chúng tôi tiến hành lên men vang nho ở quy mô phòng thí nghiệm đối với chủng S. cerevisiae N1 với hàm lƣợng đƣờng ban đầu là 220g/l, hàm lƣợng men giống là 10 %, pH: 4, nhiệt độ 26 - 280
C trong bình lên men có dung tích 500 ml. Sau 7 ngày kết thúc giai đoạn lên men chính, đánh giá rƣợu thành phẩm sau đó chuyển tiếp sang lên men phụ. Kết quả phân tích đƣợc dẫn ở bảng 3.5.
Bảng 3.8. Kết quả phân tích rƣợu thành phẩm
Chỉ tiêu phân tích Kết quả
Đƣờng sót (%) 4,6 Độ rƣợu (%V) 11,4 Axit tổng số (%) 0,45 Độ pH 3,7
Qua bảng trên. ta thấy rƣợu vang thu đƣợc có hàm lƣợng đƣờng sót thấp 4,6%, hàm lƣợng rƣợu cao 11,4 %, pH: 3,7. Ngoài ra, rƣợu trong có hƣơng vị đặc trƣng của nho Cabernet sauvignon , khả năng kết lắng tốt. Vậy chủng nấm men tuyển chọn S. cerevisiae N1 lên men vang nho Cabernet sauvignon đạt chất lượng tốt. Trên cơ sở đó chúng tôi đã đƣa ra sơ đồ công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon.
43
3.3.3. Quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon quy mô phòng thí nghiệm
3.3.3.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon
Môi trƣờng nhân giống Giống Giống cấp 1
Giống cấp 2
Siro nho Cabernet Sauvignon
Pha loãng với nƣớc theo tỉ lệ 2: 1
Dịch siro nho
Cabernet Sauvignon
Môi trƣờng lên men
Lên men chính (7 – 9 ngày) Vang non Lên men phụ Vang thô Lọc, tàng trữ Lọc Đóng chai
44
3.3.3.2. Thuyết minh quy trình công nghệ sản xuất vang nho Cabernet sauvignon
Quy trình sản xuất vang nho Cabernet sauvignon gồm 4 giai đoạn chính:
Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men
Từ siro nho Cabernet sauvignon do TS. Nguyễn Quang Thảo cung cấp, chúng tôi tiến hành pha loãng với nƣớc theo tỉ lệ 2 : 1 để làm giảm lƣợng