Tủ ấm vi sinh (Heraeus-Đức), tủ sấy (Heraeus-Đức), nồi hấp (TOMY- Nhật), máy lắc ổn nhiệt (BR300LF-Nhật), pipette (lapsystem-Phần Lan), máy đo pH (MP200R-Thụy Sĩ), ống nghiệm, que trang, đĩa peptri, bình tam giác, máy đo độ đƣờng… .
2.1.4. Môi trường
Dựa vào tính chất của nấm men chúng tôi lựa chọn môi trƣờng theo tỉ lệ sau:
2.1.4.1. Môi trường HanSen (MT1) g/l: môi trường phân lập và sơ tuyển chủng nấm men
Đƣờng glucoz: 50g Pepton : 5,0g MgSO4.7H2O: 0,5g
19
KH2PO4 : 1,0g (NH4)2SO4 : 1,0g Thạch agar : 20g
Nƣớc cất : 1000ml
2.1.4.2. Môi trường nhân giống (MT2): g/l
Đƣờng glucoz: 50g Pepton : 5,0g MgSO4.7H2O: 0,5g KH2PO4 : 1,0g (NH4)2SO4 : 1,0g Nƣớc cất : 1000ml
2.1.4.3. Môi trường lên men (MT3): g/l
Dịch siro hoa quả: 200ml MgSO4.7H2O : 0,5g
KH2PO4 : 1,0g (NH4)2SO4 : 1,0g Nƣớc cất : 1000ml
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp thu mẫu
Nguyên liệu để sản xuất rƣợu vang là nho Cabernet sauvignon. Dùng siro nho Cabernet sauvignon do TS. Nguyễn Quang Thảo cung cấp, đem pha loãng với nƣớc cất theo tỉ lệ 2 :1 ta đƣợc dịch siro nho, dùng dịch đó để phân lập và lên men. Siro nho lấy về bảo quản trong tủ lạnh ở 40
C.
2.2.2. Phương pháp phân lập
Dịch siro nho sau khi pha loãng, ta để trong tủ ấm 280
C trong 3 ngày rồi tiến hành phân lập. Dùng pipet hút 1ml dịch siro này chuyển sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nƣớc biển đã thanh trùng, trộn đều, đƣợc dịch siro có độ
20
pha loãng 10-2. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ hai, thu đƣợc dịch siro có độ pha loãng 10-3. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ ba, thu đƣợc dịch siro có độ pha loãng 10-4. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ tƣ, thu đƣợc dịch siro có độ pha loãng 10-5. Thao tác tƣơng tự với ống nghiệm thứ năm, thu đƣợc dịch siro có độ pha loãng 10-6. Dùng pipet hút 100µl dịch siro có độ pha loãng 10-5 , 10-6 nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri chứa môi trƣờng phân lập MT1, trang đều dịch siro trên bề mặt thạch, sau đó gói các hộp petri lại và đặt trong tủ ấm 24 - 28ºC. Sau 24 - 48h trên mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc to, trơn, nhẵn, bóng. Sau đó đem cấy vào ống thạch nghiêng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo [5].
2.2.3. Phương pháp giữ giống
Tiến hành cấy truyền các chủng nấm men giống định kỳ 1.5 - 2 tháng một lần trên ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trƣờng MT1, đặt trong tủ ấm 24 - 28ºC, sau 1- 2 ngày khi nấm men đã mọc tốt thì chuyển sang giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC.
2.2.4. Phương pháp hoạt hóa giống
Cấy chủng nấm men nghiên cứu trên môi trƣờng MT1 ở nhiệt độ 28ºC trong 48h, cấy chuyển sang môi trƣờng MT2, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC trong 24 giờ, lúc này chủng nấm men đã đƣợc hoạt hóa xong (giống nấm men) sẵng sàng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình [9].
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
Xác định hoạt lực lên men của nấm men thông qua hàm lƣợng CO2
đƣợc sinh ra (g/l dịch lên men) khi tiến hành lên men các chủng nấm men đã hoạt hóa trong các bình tam giác chứa môi trƣờng lên men MT3 và có cùng số lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Hàm lƣợng CO2 sinh ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt. Sau 72 giờ lên men đem cân trọng
21
lƣợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại. Hàm lƣợng CO2 sinh ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt. Kết hợp với việc phân tích hàm lƣợng cồn và hàm lƣợng đƣờng sót để xác định hiệu suất lên men, nếu hiệu suất lên men càng cao thì hoạt lực lên men của nấm men càng cao [8].
2.2.6. Xác định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của nấm men đƣợc xác định dựa trên tốc độ lắng của sinh khối. Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (pH: 4,5) trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc bằng nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hoàn toàn bằng nhau. Sau đó lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3 – 5 phút, để lắng 15 phút. Khối dịch chia thành 2 lớp bằng, phần đáy là nấm men. Tiến hành đo lớp kết lắng của chủng nấm men trong các ống nghiệm. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất tức là có độ kết lắng tốt nhất [8].
2.2.7. Phương pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào nấm men
Cấy chủng nấm men theo hình dích dắc trên môi trƣờng MT1, ủ ở 28ºC trong 48 giờ để nấm men mọc thành khuẩn lạc. Quan sát, lựa chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ mô tả các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc. Làm tiêu bản nhuộm đơn, quan sát và mô tả đặc điểm hình thái tế bào của chủng nấm men tuyển chọn trên kính hiển vi quang học [5].
2.2.8. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật
• Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc [5]
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa nấm men, pha loãng theo phƣơng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng pipet hút 0,1ml dịch pha loãng rồi trang đều trên môi trƣờng thạch đĩa. Nuôi ở 280C trong 48 giờ đếm số lƣợng khuẩn lạc (CFU) trong môi trƣờng đĩa peptri, từ đó xác định số lƣợng tế bào nấm men trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức:
22
Trong đó: N: Tổng số CFU trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu A: Số CFU trung bình đếm đƣợc trên một đĩa petri V: Thể tích mẫu cấy trên một đĩa petri (V = 0,1ml) Df: Độ pha loãng của mẫu (n lần)
• Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào bằng buồng đếm Goriaev [5]
Đây là phƣơng pháp đếm trực tiếp số lƣợng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phù VSV đến 10-n, nhỏ một giọt dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa buồng đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ buồng đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm số lƣợng tế bào theo các ô theo đƣờng chéo hoặc theo các góc ở trung tâm buồng đếm. Thƣờng đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của buồng đếm để tính số lƣợng tế bào trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml ban đầu:
N = A . 25 : V : n
Trong đó: N: Số lƣợng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù A: Số lƣợng tế bào trung bình có trong 1 ô lớn V: Thể tích của 1 ô lớn (V = 0.004 mm3)
n: Độ pha loãng của dung dịch huyền phù (10-n) 25 là số ô lớn của toàn khung đếm
2.2.9. Phương pháp hóa học
Xác định hàm lƣợng đƣờng bằng đƣờng kế. Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH. Xác định hàm lƣợng axit bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Xác định hàm lƣợng cồn bằng cồn kế.
2.2.10. Phương pháp thống kê toán học trong xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê Giá trị trung bình số học:
23 Độ lệch chuẩn: nếu n < 30 nếu n ≥ 30 Sai số trung bình số học: Hệ số biến thiên: Trong đó: n: Số lần lặp lại Xi: Giá trị đo lần thứ i
24
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho
Cabernet sauvignon
3.1.1. Phân lập chủng nấm men từ dịch nho Cabernet sauvignon
Căn cứ vào mật độ nấm men trong dịch siro nho thu đƣợc, chúng tôi chọn dịch siro nho có độ pha loãng 10-5
và 10-6 để phân lập, kết quả thu đƣợc 10 chủng nấm men, đƣợc kí hiệu từ N1 đến N10.
Bảng 3.1. Các chủng nấm men thu đƣợc qua các lần phân lập STT Kí hiệu Hình thái khuẩn lạc Đƣờng kính khuẩn
lạc 1 N1 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 3mm
2 N2 Trắng bóng, không răng cƣa 1mm 3 N3 Trắng, tròn, nhẵn bóng 1,5mm 4 N4 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 1,5mm 5 N5 Trắng bóng, không răng cƣa 1mm
6 N6 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 2mm
7 N7 Trắng, tròn, nhẵn bóng 1mm 8 N8 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 1.5mm
9 N9 Trắng bóng, lồi, không răng cƣa 2,5mm
25
Hình 3.1. Chủng nấm men phân lập trên môi trường đĩa thạch
Theo nguyên lí của chọn lọc tự nhiên, từ 10 chủng nấm men phân lập đƣợc, chúng tôi chọn ra 3 chủng có đƣờng kính khuẩn lạc lớn nhất, trắng, bóng, lồi, không răng cƣa là N1, N6 và N9 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
Sau đó, ba chủng nấm men tuyển chọn này chúng tôi chuyển sang môi trƣờng giữ giống ở thạch nghiêng để thuận lợi cho các nghiên cứu tiếp theo. Sau 2 – 3 ngày thu đƣợc kết quả ở hình 3.2.
Hình 3.2. Chủng nấm men N1, N6, N9 trên môi trường thạch nghiêng
Vậy từ 10 chủng nấm men phân lập chúng tôi đã sơ tuyển được 3 chủng nấm men N1, N6, N9 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon Cabernet sauvignon
26
Để khẳng định kết quả tuyển chọn và chọn ra chủng có khả năng lên men vang nho Cabernet sauvignon tốt nhất, chúng tôi tiến hành lên men từ đó tìm ra chủng nấm men:
Chịu đƣợc độ cồn và độ axit cao.
Tốc độ phát triển nhanh, chu kì lên men ngắn.
Có khả năng lên men tốt trong môi trƣờng có hàm lƣợng đƣờng cao. Hƣơng thơm tạo este đặc biệt, không sinh độc tố.
Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm.
Khả năng cạnh tranh tốt với các vi sinh vật khác, ổn định lâu dài trong sản xuất.
3.1.2.1. Xác định hoạt lực lên men
Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men đƣợc đánh giá bằng lƣợng CO2 thoát ra. Lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Chúng tôi tiến hành lên men 3 chủng N1, N6 và N9 trong 72 giờ, kết quả thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lƣợng CO2 giải phóng sau 72 giờ lên men của 3 chủng nấm men N1, N6 và N9 Tên chủng nấm men Trọng lƣợng bình ban đầu (g) Trọng lƣợng bình sau 72 giờ lên men (g)
Lƣợng CO2
thoát ra (g)
N1 155.5 ± 0.02 152.5 ± 0.02 3,0 ± 0.02
N6 156.95 ± 0.03 154.4 ± 0.03 2.55 ± 0.03 N9 157.04 ± 0.02 154.24 ± 0.02 2,8 ± 0.02
Kết quả cho thấy 3 chủng nấm men N1, N6 và N9 lên men đều mạnh, hàm lƣợng CO2 thoát ra nhiều đạt yêu cầu dùng cho lên men rƣợu vang các loại hoa quả ( trên 2g/100ml). Sự phát triển của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn khó xâm nhập, sự tạo cồn hạn chế 1 số nấm men dại và vi khuẩn bị ức
27
chế không phát triển đƣợc trong môi trƣờng lên men. Qua đây ta thấy chủng N1 có hàm lƣợng CO2 thoát ra mạnh nhất là 3,0g/100ml, tiếp đó là chủng N9
với hàm lƣợng CO2 thoát ra là 2,8g/100ml và chủng N6 hàm lƣợng CO2 thoát ra thấp nhất là 2,55g/100ml. Vậy chủng N1 có hoạt lực lên men mạnh nhất. 3.1.2.2. Khả năng lên men đường
Để xác định khả năng lên men đƣờng của các chủng nấm men thu đƣợc từ đó tìm ra chủng có hiệu suất lên men cao nhất, chúng tôi tiến hành xác định lƣợng đƣờng sót và nồng độ cồn trong dịch lên men. Các chủng nấm men đã hoạt hóa đƣợc đƣa vào môi trƣờng lên men MT3 100ml với hàm lƣợng đƣờng 220g/l, pH: 4 và ở nhiệt độ 280C. Sau 7 ngày lên men, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.2.
Bảng 3.3. Khả năng lên men đƣờng của các chủng nấm men Chỉ tiêu đánh giá Đơn
vị Chủng nấm men N1 N6 N9 Đƣờng tổng số g/l 220 ± 0,2 220 ± 0,2 220 ± 0,2 Lƣợng đƣờng sót % 4,8 ± 0,05 6,3 ± 0,06 5,5 ± 0,06 Độ cồn %V 11,2 ± 0,04 10,04 ± 0,04 10,34 ± 0,04 Kết quả cho thấy, chủng nấm men N1 sau 7 ngày lên men thì lƣợng đƣờng sót thấp nhất (4,8) và đạt độ cồn cao nhất (11,2); tiếp đó là chủng N9
(lƣợng đƣờng sót là 5,5 và độ cồn là 10,34); chủng N6 có hiệu suất lên men thấp nhất (lƣợng đƣờng sót là 6,3 và độ cồn là 10,04). Vậy chủng N1 có hiệu suất lên men cao nhất.
3.1.2.3. Khả năng kết lắng của các chủng nấm men
Trong lên men rƣợu vang, việc tạo ra các sản phẩm có độ trong có ý nghĩa rất lớn trong sản xuất, tạo giá trị cảm quan tốt cho sản phẩm từ đó mang
28
lại giá trị cao. Chính vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng kết lắng của các chủng nấm men, để tìm ra chủng nấm men dễ lắng trong nhất.
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của ba chủng nấm men
Tên chủng N1 N6 N9
Chiều cao cột sinh khối (mm) 18 16 17,5
Kết quả cho thấy chủng N1 có khả năng kết lắng tốt nhất (với chiều cao cột sinh khối là 18mm), tiếp đó là chủng N9 (với chiều cao cột sinh khối là 17,5mm) và chủng N6 có khả năng kết lắng thấp nhất (với chiều cao cột sinh khối là 16mm). Vậy chủng N1 có khả năng tạo độ trong cho sản phẩm tốt nhất.
3.1.2.4. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau
Để xác định ảnh hƣởng của độ pH môi trƣờng tới khả năng lên men của các chủng nấm men. Chúng tôi tiến hành lên men 3 chủng nấm men N1, N6 và N9: các chủng nấm men sau khi đã đƣợc hoạt hóa đƣợc đƣa vào môi trƣờng lên men MT3 100ml, ở 280C với độ pH biến đổi ở các mức là 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5 trong 72 giờ, kết quả thu đƣợc ở hình 3.3.
29
Kết quả cho thấy cả 3 chủng nấm men đều lên men mạnh nhất ở độ pH từ 4 đến 4,5; ở độ pH này cũng phù hợp với độ pH của dịch quả, trong đó chủng N1 có hoạt lực lên men mạnh nhất (với hàm lƣợng CO2 thoát ra là 3 và 2,85) tiếp đó là chủng N9 và thấp nhất là chủng N6. Ở độ pH từ 2,5 đến 3,5 hàm lƣợng CO2 đƣợc tạo ra thấp là do ở độ pH thấp môi trƣờng axit ức chế quá trình sinh trƣởng của tế bào nấm men. Ở độ pH 5 hàm lƣợng CO2 đƣợc tạo ra cũng thấp là do các tế bào nấm men phát triển chậm môi trƣờng dịch lên men thuận lợi cho nấm mốc phát triển ảnh hƣởng đến chất lƣợng rƣợu.
Vậy độ pH thích hợp cho lên men là 4 – 4,5 và chủng N1 có hoạt lực lên men mạnh nhất trong tất cả các độ pH khác nhau.
3.1.2.5. Nghiên cứu động thái phát triển của các chủng nấm men trong môi trường nhân giống trường nhân giống
Trong công nghệ sản xuất vang, giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn khoảng 24 – 28 giờ, nhƣng lại đóng vai trò hết sức quan trọng, giai đoạn này làm tăng nhanh số lƣợng tế bào nấm men và giúp ta chọn đƣợc nấm men có chất lƣợng tốt nhất để đáp ứng cho quá trình lên men vang. Việc tìm ra thời điểm nào chủng có khả năng sinh trƣởng tốt nhất có ý nghĩa rất lớn trong quá trình làm thí nghiệm và trong thực tế. Do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu động thái phát triển của các chủng nấm men trong môi trƣờng nhân giống MT2, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC. Thu mẫu ở các thời điểm 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ, 48 giờ và đếm số lƣợng tế bào.
30
Hình 3.4. Động thái phát triển của các chủng nấm men trong môi trường nhân giống
Kết quả cho thấy cả 3 chủng nấm men sau khi đƣợc đƣa vào môi trƣờng nhân giống từ 24 – 30 giờ đều sinh trƣởng đạt giá trị cực đại.
Đối với chủng N1 trong quá trình nuôi cấy, quần thể nấm men sinh trƣởng tăng dần và đạt giá trị cực đại ở thời điểm 24 giờ (135 . 106
tế bào). Từ 30 – 48 giờ, quần thể sinh trƣởng giảm dần, trong đó ở thời điểm 48 giờ là