5. Điểm mới của đề tài
3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau
3.3.1.1. Khả năng sử dụng đa dạng các loại đường
Nguồn dinh dƣỡng cacbon của nấm men rất đa dạng, chúng có thể là các loại đƣờng và dẫn xuất, các rƣợu, các axit hữu cơ, axit amin... Trong đó nguồn dinh dƣỡng cacbon đƣợc ƣu tiên sử dụng là các loại đƣờng. Để xác định khả năng lên men với các loại đƣờng của mẫu T1, T4, T11 chúng tôi sử dụng phƣơng pháp lên men trong các bình lên men có thể tích 100 ml bằng cách lấy từng mẫu vào 3 loại môi trƣờng lên men (mỗi môi trƣờng ứng với một loại đƣờng đƣợc bổ sung) với HL đƣờng ban đầu là 250 g/l, HL men giống 10%, pH: 4, nhiệt độ 26 – 280C với TG lên men là 8 ngày.
Chúng tôi dựa vào một số chỉ tiêu sau để đánh giá khả năng lên men các loại đƣờng là:
HL đƣờng sót. HL cồn.
Lƣợng CO2 tạo thành.
Kết quả thu đƣợc sau 8 ngày lên men đƣợc thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khả năng sử dụng đa dạng các loại đường trong dịch lên men của 3 chủng nấm men T1, T4 và T11 Chỉ tiêu Loại đƣờng Chủng nấm men HL đƣờng sót (%) Etanol (%V) Glucozo T1 5.3 ± 0.2 9.8 ± 0.2 T4 5.1 ± 0.1 10.0 ± 0.2 T11 4.9 ± 0.2 9.7 ± 0.2 Saccarozo T1 7.3 ± 0.2 8.2 ± 0.1 T4 7.7 ± 0.3 7.7 ± 0.1 T11 7.8 ± 0.1 8.6 ± 0.2 Mantozo T1 9.2 ± 0.1 5.7 ± 0.3 T4 9.7 ± 0.3 5.5 ± 0.2 T11 9.6 ± 0.3 5.8 ± 0.3
Từ kết quả tên ta nhận thấy chủng S. cerevisiae T1, T4 và T11 có khả năng sử dụng cả 3 loại đƣờng glucozo, saccarozo và mantozo. Tuy nhiên khả năng sử dụng các loại đƣờng là khác nhau.
Với đƣờng saccarozo: nấm men có khả năng hấp thụ tốt, lƣợng CO2
thoát ra nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men mạnh, cho sinh khối nấm men lớn, sản phẩm tạo ra có mùi thơm nhẹ.
Đƣờng mantozo: nấm men hấp thụ mạnh hơn cho sinh khối lớn, sản phẩm tạo ra cho chất lƣợng cảm quan tốt với hƣơng thơm, màu sắc và độ trong cao.
Đƣờng glucozo: đây là loại đƣờng thích hợp cho lên men rƣợu vang, lƣợng CO2 thoát ra nhiều, sinh khối tăng cao. Sản phẩm cho chất lƣợng tốt. còn đối với môi trƣờng có đƣờng saccaroza và mantozo có khả năng lên men nhƣng không mạnh bằng.
Kết quả nghiên cứu của tôi phù hợp với tác giả Phạm Thị Vƣợng [16].
Như vậy, 3 chủng nấm men sử dụng được cả 3 loại đường glucozo, saccarozo và mantozo. Tuy nhiên glucozo là nguồn đường thích hợp với quá trình lên men vang nho.
3.3.1.2. Khả năng lên men ở các hàm lượng đường khác nhau
Đƣờng là nguồn cacbon đóng vai trò quan trọng nhất trong việc tạo thành rƣợu trong vang nho. Để nghiên cứu ảnh hƣởng của HL đƣờng tới quá trình lên men vang nho, chúng tôi chọn HL đƣờng ban đầu ở các mức khác nhau là: 230g/l, 250g/l, 270g/l, 290g/l. Môi trƣờng lên men đƣợc bổ sung với HL men giống là 10%, pH: 4, tiến hành lên men ở nhiệt độ 26 – 280C trong các bình lên men có dung tích 100ml với TG lên men là 8 ngày [10]. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae T1, T4 và T11 trên môi trường có hàm lượng đường ở các mức khác nhau
Đơn vị Chỉ tiêu HL đƣờng (g/l) 230 250 270 290 HL đƣờng sót (%) T1 5.6 ± 0.2 3.4 ± 0.2 6.0 ± 0.2 9,2 ± 0.2 T4 5.0 ± 0.2 3.1 ± 0.2 6.5 ± 0.2 9.8 ± 0.2 T11 4.9 ± 0.2 3.0 ± 0.2 6.7 ± 0.2 9.5 ± 0.2 Etanol (%V) T1 9.7 ± 0.1 11.6 ± 0.1 10.5 ± 0.1 8.7 ± 0.1 T4 10.4 ± 0.1 11.7 ± 0.1 10.8 ± 0.1 9.3 ± 0.1 T11 10.2 ± 0.1 12.0 ± 0.1 11.4 ± 0.1 9.2 ± 0.1 Kết quả cho thấy trong môi trƣờng có HL đƣờng 25% thì lƣợng rƣợu tạo thành cao 11.6 – 12.0%, HL đƣờng sót trong dịch lên men thấp chỉ còn 3.0 – 3.4%. Với mẫu có HL đƣờng 29% thì nấm men phát triển kém, HL đƣờng sót cao tới 9.2 – 9.8%, HL cồn tạo ra thấp 8.7 – 9.2%, do vậy rất khó bảo quản và ổn định chất lƣợng của vang trong quá trình tàng trữ. Kết quả nghiên cứu của tôi phù hợp với một số tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thế Trang [10] [15].
Từ kết quả trên tôi xác định HL đường thích hợp cho quá trình lên men vang nho đối với chủng S. cerevisiae N1 là 25%.
Tổng hợp kết quả nghiên cứu từ 3.3.1.1 và 3.3.1.2, chúng tôi nhận thấy nguồn đường glucozo là thích hợp cho quá trình lên men của chủng
3.3.2. Ngiên cứu sự đa dạng dựa vào khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau khác nhau
3.3.2.1. Sự đa dạng từ việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ
Nguồn nitơ ảnh hƣởng trực tiếp đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men. Trong lên men ngƣời ta thƣờng sử dụng nguồn nitơ vô cơ để tránh gây mùi cho sản phẩm. Tiến hành khảo sát khả năng sử dụng nguồn nitơ của 3 chủng nấm men với các muối (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4OHnồng độ 0.2‰. HL men giống 10%, nuôi cấy trên may lắc trong TG 4 – 5 ngày với tốc độ 150 vòng/phút. Sau đó chúng tôi tiến hành đếm SLTB nấm men trên 1ml dịch lên men để xác định sự phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae T1, T4 và T11 . Kết quả đếm đƣợc dẫn ra ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Sự đa dạng từ việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ của các chủng nấm men
Loại nitơ Chủng nấm men SLTB (x. 106) (NH4)2SO4 T1 124 ± 0.2 T4 129 ± 0.2 T11 120 ± 0.2 NH4Cl T1 105 ± 0.2 T4 98 ± 0.2 T11 103 ± 0.2 NH4OH T1 89 ± 0.2 T4 95 ± 0.2 T11 102 ± 0.2
Kết quả cho thấy, khả năng sử dụng nguồn nitơ của các chủng nấm men rất đa dạng. Chúng phát triển tốt trên môi trƣờng dinh dƣỡng chứa(NH4)2SO4, NH4Cl, NH4OH. Tuy nhiên tùy từng môi trƣờng mà chúng phát triển mạnh
NH4OH: Đây là nguồn nitơ dễ hấp thụ với tế bào nấm men, nó tạo cho nấm men có khả năng trao đổi chất tốt. Do đó lƣợng CO2 thoát ra nhiều, khả năng tích tụ cao, cho sinh khối nấm men lớn.
NH4Cl: Nấm men hấp thụ mạnh hơn do đó sinh khối nấm men lớn hơn, sản phẩm tạo ra có màu sắc và độ trong cao, mùi vị khá ngon.
(NH4)2SO4: Nguồn nitơ này nấm men có thể hấp thụ mạnh nhất, lƣợng CO2 thoát ra rất mạnh. Do nguồn nitơ ở dạng NH4
+
gần với tiền chất của nitơ hữu cơ nấm men dễ sử dụng, sinh khối tăng cao. Sản phẩm cho chất lƣợng cảm quan tốt. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với một số tác giả Vũ Thu Hồng, Trần Thị Tâm [8], [14].
Vì vậy, chúng tôi thấy rằng nguồn nitơ vô cơ mà các chủng nấm men sử dụng rất đa dạng có thể là (NH4)2SO4, NH4Cl hoặc NH4OH. Tuy nhiên thích hợp là (NH4)2SO4.
3.3.2.1. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 ở các hàm lượng khác nhau tới quá trình lên men.
Nghiên cứu xác định HL (NH4)2SO4 phù hợp nhất đối với sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiaeT1, T4 và T11 chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu trong môi trƣờng lên men, HL đƣờng 250g/l, pH: 4, HL men giống 10%, (NH4)2SO4 ở các nồng độ 0.1‰, 0.2‰, 0.3‰, 0.4‰, 0.5‰, với TG lên men là 7 – 9 ngày. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 ở các hàm lượng khác nhau tới quá trình lên men Đơn vị Chỉ tiêu Nồng độ (NH4)2SO4‰ 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 HL đƣờng sót (%) T1 5.7 4.6 4.7 6.5 7.7 T4 5.9 4.8 4.0 6.6 7.5 T11 5.8 4.0 4.1 5.8 7.9 Etanol (%V) T1 7.7 9.9 9.6 8.5 8.4 T4 8.4 10.5 10.2 8.2 7.8 T11 8.8 10.7 10.6 9.0 7.6 pH T1 3.5 3.8 3.9 3.4 3.1 T4 3.7 3.9 4.2 3.5 3.1 T11 3.4 3.9 4.0 3.2 3.0
Từ kết quả ở bảng 3.9 chúng tôi thấy rằng khả năng sử dụng (NH4)2SO4 ở các HL khác nhau rất đa dạng. Nồng độ (NH4)2SO4 trong khoảng 0.2‰ – 0.3‰ thích hợp cho quá trình lên men. Vì ở nồng độ này dịch lên men có HL đƣờng sót thấp từ 4.0 – 4.6 g/l, HL cồn ở mức 9.6 – 10.7%V.
Bên cạnh đó chúng ta thấy rằng nồng độ (NH4)2SO4 trong dịch lên men tăng 0.4 – 0.5‰ thì HL đƣờng sót cũng tăng 5.8 – 7.9‰, trong khi đó độ cồn đạt đƣợc giảm do pH của dung dịch thay đổi làm rối loạn quá trình TĐC của tế bào nấm men.
Nếu ít 0.1‰ sẽ làm tốc độ lên men yếu, HL đƣờng sót cũng tăng, HL cồn giảm. Kết quả nghiên cứu phù hợp với các tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Vũ Thu Hồng [8], [10].
Như vậy, 3 chủng nấm men phát triển tốt trong môi trường chứa (NH4)2SO4 ở các HL khác nhau. Tuy nhiên chúng tôi quyết định chọn nguồn nitơ vô cơ từ (NH4)2SO4 với HL 0.2‰ – 0.3‰ để bổ sung vào dịch lên men.
Tổng hợp kết quả nghiên cứu từ 3.3.2.1 và 3.3.2.2, chúng tôi nhận thấy chủng S. cerevisiae T1, T4 và T11 sử dụng (NH4)2SO4 với HL 0.2‰ – 0.3‰ là thích hợp cho quá trình lên men vang nho.
3.3.3. Nghiên cứu khả năng lên men ở các độ pH khác nhau đến quá trình lên men
Trong quá trình lên men rƣợu vang pH luôn luôn thay đổi đã ảnh hƣởng tới quá trình lên men. Để xác định khả năng lên men của các chủng lên men ở các độ pH khác nhau, chúng tôi tiến hành lên men trong các bình tam giác 100 ml, HL đƣờng 250g/l, nhiệt độ 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 106 KH2PO4 0.8% ở pH biến đổi khác nhau (pH: 3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5). pH đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 0.1N, dung dịch axit axetic 98% và đo độ pH bằng giấy đo pH. Xác định lƣợng CO2 thoát ra sau 48h nuôi cấy, kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.10.
Bảng 3.10. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau
Chủng pH
3 3.5 4 4.5 5
T1 + + ++++ ++++ ++
T4 + ++ ++++ ++++ +
Trong đó:
++++: HL CO2 đƣợc tạo ra > 30g/l dịch lên men
+++ : HL CO2 đƣợc tạo ra từ 20 – 30 g/l dịch lên men
++ : HL CO2 đƣợc tạo ra trên 10 – 20 g/l dịch lên men
+ : HL CO2 đƣợc tạo ra trên < 10 g/l dịch lên men
Từ kết quả thu đƣơc chúng tôi thấy rằng 3 chủng T1, T4, T11 có khả năng lên men mạnh ở môi trƣờng có pH cao (pH: 4.5), HL CO2 đƣợc tạo ra lớn > 30g/l dịch lên men.
Ở pH: 3 – 4 HL CO2 đƣợc tạo ra thấp dƣới 30g/l dịch lên men,môi trƣờng axit ức chế quá trình sinh trƣởng của tế bào nấm men.
Ở pH > 5 HL CO2 đƣợc tạo ra cũng thấp < 10 g/l các tế bào nấm men phát triển chậm môi trƣờng dịch lên men thuận lợi cho nấm mốc phát triển ảnh hƣởng đến chất lƣợng rƣợu.
Nhƣng thực tế pH: 4 – 4.5 là phù hợp với pH dịch quả do đó chủng T1, T4 và T11 vẫn là chủng có khả năng lên men tốt nhất.
Như vậy, 3 chủng nấm men có khả năng lên men ở các độ pH từ 3 – 5. Tuy nhiên chúng tôi thấy pH: 4 – 4.5 là phù hợp với nhất đối với sự phát triển của 3 chủng nấm men T1, T4 và T11.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Kết quả nghiên cứu, dựa vào đặc điểm hình thái, kích thƣớc khuẩn lạc chúng tôi đã phân lập đƣợc 15 mẫu nấm men sau đó chọn sơ bộ đƣợc 5 chủngT1, T4, T5, T9 và T11.
1.2. Tuyển chọn đƣợc các chủng nấm men có khả năng sinh trƣởng, phát triển, hoạt lực lên men cao 2.67 – 3.02 (g/100ml), HL đƣờng sót trong dịch lên men thấp >3.4% , độ lắng của 5 chủng nấm men cao. Sau đó chọn đƣợc 3 chủng T1, T4 và T11 có các chỉ tiêu cao hơn cả rồi tiến hành quan sát tế bào trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.
Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1971) chúng tôi xác định đƣợc tên của các chủng nấm men chọn đƣợc là S. cerevisiae T1, S. cerevisiae T4,S. cerevisiae T11.
1.3. Đánh giá sự đa dạng của các chủng nấm men dựa vào dựa trên khả năng sử dụng nguồn dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy.
Sử dụng đa dạng các nguồn đƣờng glucozo, saccarozo, mantozo. Tuy nhiên glucozo là thích hợp với hàm lƣợng là 25%.
Khả năng sử dụng đa dạng các nguồn nitơ (NH4)2SO4, NH4Cl hoặc NH4OH. Tuy nhiên thích hợp là (NH4)2SO4 ở nồng độ 0.2 – 0.3‰.
Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau (pH: 3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5), nhƣng phù hợp là pH: 4 – 4.5.
2. Kiến nghị
Với kết quả thu đƣợc, chúng tôi mong muốn chủng nấm men đã đƣợc lựa chọn ở trên cùng với những kết quả nghiên cứu sẽ đƣợc áp dụng vào sản xuất rƣợu vang nho Cabernet sauvigon ở Việt Nam, góp một phần nhỏ vào thị trƣờng vang trong nƣớc cũng nhƣ với mong muốn vang Việt sẽ vƣơn tầm ra thế giới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2011). Hóa sinh hoc, Nxb Giáo dục (pp 156 – 161)
[2]. Nguyễn Lân Dũng và cộng tác viên (1976). Một số phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật tập II, III, Nxb Khoa học kỹ thuật
[3]. Nguyễn Thành Đạt (1979). Vi sinh học đại cƣơng, Nxb Giáo dục
[4]. Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000). Sinh học vi sinh vật, Nxb Giáo dục
[5]. Nguyễn Thị Hào (2010). Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo, Khóa luận tốt nghiệp trường ĐHSP Hà Nôi 2
[6]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại học Sư phạm
[7]. Vũ Công Hậu (1982). Chế vang trái cây trong gia đình, Nxb Nông nghiệp
[8]. Vũ Thu Hồng (2012). Nghiên cứu ảnh hưởng của nitơ tới quá trình lên men rượu vang, Khóa luận tốt nghiệp Đai học Sư phạm Hà Nội 2
[9]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Phƣơng Châm, Đặng Thị Thu Hiền (1998). Tuyển chọn chủng nấm men dùng cho lên men rượu vang,
Thông báo khoa học trường ĐHSP Hà Nội 2, số 1
[10]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh (2011). Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của chủng S.cerevisiae H2 và H8, Thông báo khoa học, trường ĐHSP Hà Nội 2, số 1 (pp 300 – 310)
[11]. Lƣơng Đức Phẩm (2004). Công nghệ vi sinh vật,Nxb Nông nghiệp HN
(pp 237 – 243)
[12]. Lƣơng Đức Phẩm (2009). Nấm men công nghiệp, Nxb Khoa học và kĩ thuật
[13]. Lê Xuân Phƣơng (2011). Vi sinh vật học công nghiệp, Nxb Giáo dục
[14]. Trần Thị Tâm (2014). Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men trong lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ, trường ĐHSP Hà Nội 2
[15]. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Văn Hiếu, Lƣơng Đức Phẩm, Trần Đình Mấn, Nguyễn Thị Diễn (2001). Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men S. cerevisiae sp phù hợp với yêu cầu sản xuất rượu vang từ dịch quả nho,Tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị Quốc tế Sinh học Hà Nội 7/2001, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tập 2 (pp 476 – 481)
[16]. Phạm Thị Vƣợng (2014). Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình lên men rượu vang, Khóa luận tốt nghiệp đại học Sư phạm Hà Nội 2
[17]. J. Lodder (1971). “The yeast. A taxonomic study”, North Holland. Publ. Co. Amsterdam London
[18]. Mark Berkowitz (September/October năm 1996). “World's Earliest Wine”, Archaeology(Archaeological Institute of America) 49 (5), truy cập ngày 13 tháng 1 năm 2011
[19]. David Keys (28 tháng 12 năm 2003), “Now that's what you call a real vintage: professor unearths 8,000-year-old wine”,The Independent (independent.co.uk), bản gốc lƣu trữ 15 tháng 5, 2011, truy cập ngày 13 tháng 1 năm 2011.