5. Điểm mới của đề tài
2.4.Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân lập trên hộp petri
Để chọn một tập hợp tế bào nấm men ta sử dụng phƣơng pháp phân lập trên hộp petri. Môi trƣờng để tuyển chọn các lạc khuẩn nấm men là môi trƣờng Hansen (môi trƣờng 1).
Cách làm: Môi trƣờng phân lập đƣợc vô trùng và đƣợc phân bố vào các hộp vô trùng petri để nguội theo phƣơng pháp Pasteur. Dịch nho đƣợc pha loãng từ 10-1
– 10-9 bằng nƣớc cất. Dùng pipet đã vô trùng nhỏ 1 – 2 giọt huyền phù với độ pha loãng từ 10-5
– 10-9 lên bề mặt thạch rồi dùng que trang dàn đều. Gói kín lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 – 300
C trong 3 ngày. Sau 3 ngày trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện những khuẩn lạc đặc trƣng cho nấm men [6].
2.4.2. Phương pháp hoạt hóa giống
Trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng lên men để có những tế bào to khỏe ta tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trên môi trƣờng thạch nghiêng 28 – 300C trong 24h. Sau đó cấy vào dịch nhân giống trong 24h đƣợc giống cấp 2 [2].
2.4.3. Phương pháp xác định hoạt lực lực lên men của nấm men
Để xác định hoạt lực lên men của nấm men so sánh giữa các chủng ta dung các phƣơng pháp sau:
Phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng: dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250ml môi trƣờng, cùng có một lƣợng trung bình nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng khi chênh lệch giữa 2 lần là 0,1 thì dừng lại [8].
2.4.4. Phương pháp quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi
Quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần.
2.4.5. Phương pháp đếm SLTB bằng buồng đếm Goriaev
Đây là phƣơng pháp đếm trực tiếp SLTB VSV trong mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phù VSV đến 10-n, nhỏ 1 giọt dung dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa buồng đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ buồng đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm SLTB theo các ô theo đƣờng chéo hoặc theo các góc ở trung tâm buồng đếm. Thƣờng đếm 4 ô lớn ở 4 góc và một ô lớn ở trung tâm của buồng đếm để tính SLTB trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu [6].
2.4.6. Phương pháp phân tích
Xác định hàm lƣợng đƣờng bằng khúc xạ kế.
Xác định độ cồn bằng ancol kế và phƣơng pháp hóa học. Xác định độ pH bằng giấy đo pH.
Xác định hàm lƣợng axit tổng dung dịch lên men bằng cách dựa vào nguyên tắc trung hòa axit bằng dung dịch NaOH 0,1N. Từ số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ ta suy ra đƣợc hàm lƣợng axit có trong dung dịch [2], [6].
2.4.6. Phương pháp xác định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của nấm men đƣợc xác định dựa trên tốc độ lắng của sinh khối.
2.4.7. Phương pháp cảm quan
Cảm nhận và quan sát bằng mắt thƣờng
2.4.8. Phương pháp xử lý kết quả bằng thống kê toán học
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 1 n i i X X n
Trung bình bình phƣơng các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i
Sai số đại diện của trung bình cộng:
2.5. Địa điểm thực hiện đề tài
CHƢƠNG 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập chủng nấm nem có khả năng lên men rƣợu vang từ dịch nho Cabernet sauvignon nho Cabernet sauvignon
Để phân lập các chủng nấm men ngƣời ta sử dụng môi trƣờng Haxen thanh trùng theo phƣơng pháp Pasteur sau đó chia vào các đĩa peptri đã vô trùng.
Tiến hành: Chuẩn bị 10 ống nghiệm định mức, dùng pipet hút 9ml nƣớc cất vào mỗi ống. Lấy 1ml dịch quả cho vào ống thứ nhất (dịch pha loãng ở 10- 1). Sau đó lại hút 1ml dịch ở ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 đƣợc dung dịch có độ pha loãng 10-2. Làm tƣơng tự với các ống tiếp theo cho đến ống 9 sẽ có độ pha loãng 10-9. Có thể chọn ở các nồng độ 10-6
– 10-9. Dùng giấy báo gọi lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 – 300
C. Sau 4 – 5 ngày lấy ra quan sát [16]. Trên bề mặt thạch ta thấy xuất hiện những khuẩn lạc, dựa vào hình thái khuẩn lạc nấm men ta chọn những khuẩn lạc to, tròn, lồi, nhẵn bóng có màu trắng đục đặc trƣng cho nấm men.
Kết quả phân lập, chúng tôi chọn đƣợc ra 15 mẫu nấm men (kí hiệu từ T1 đến T15). Sau khi đo kích thƣớc khuẩn lạc chúng tôi chia số mẫu trên thành các nhóm đƣợc miêu tả tại bảng sau:
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái và kích thước của nấm men trong các mẫu phân lập
Nhóm Mẫu nấm men Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Kích thƣớc
1 T2, T8, T13, T14
Tròn, màu trắng ngà, bề mặt trơn nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có tâm, bờ không có răng cƣa
1.5 – 2mm
2 T3, T6, T7, T10, T12, T15
Tròn, màu trắng ngà, bề mặt trơn nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có tâm, bờ không có răng cƣa
2 – 2.5mm
3 T1, T4, T5, T9, T11
Tròn, màu trắng ngà, bề mặt trơn nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có tâm, bờ không có răng cƣa
>2.5mm
Từ kết quả thể hiện qua bảng trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn đƣợc 5 mẫu khuẩn lạc có kích thƣớc lớn đƣờng kính >2mm, trơn, bóng, nhẵn đƣợc kí hiệu là T1, T4, T5, T9, T11dùng làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo và tạm gọi là các chủng nấm men.
Sau đó các khuẩn lạc này đƣợc cấy sang các ống thạch nghiêng đã có sẵn môi trƣờng Hansen vô trùng để giữ giống, sau 2 – 3 ngày lấy ống thạch nghiêng ra quan sát.
Hình 3.2. Cấy truyền chủng nấm men T1, T4, T5, T9, T11 trên môi trường thạch nghiêng
Kết quả, chúng tôi đã phân lập 15 mẫu nấm men, dựa vào hình thái và kích thước khuẩn lạc tôi chọn sơ bộ được 5 chủng là T1, T4, T5, T9, T11.
3.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rƣợu vang từ nho
Cabernet sauvignon
Việc tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có chất lƣợng tốt cho quá trình lên men rƣợu Cabernet sauvignon chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng nấm men dựa vào đặc tính sinh học nhƣ:
Khả năng lên men các loại đƣờng. Khả năng đồng hóa các muối nitrat.
Khả năng hình thành bào tử kết hợp quan sát khuẩn lạc. Quan sát hình dạng tết bào trên kính hiển vi.
Sinh sản nảy chồi từ nhiều phía [12].
3.2.1. Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men
Cách tiến hành: Các mẫu nấm menT1, T4, T5, T9, T11 đƣợc lên men ở môi trƣờng lên men (MT3) trong các bình lên men có dung tích 100 ml với (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
– 280
C. Sau 72h, đem cân trọng lƣợng bình ban đầu sau đó mở nắp bình lên men, tiếp tục đem cân trọng lƣợng bình thấy trọng lƣợng bình giảm đi. Đó chính là lƣợng CO2 sinh ra trong quá trình lên men. Lƣợng CO2 sinh ra càng nhiều thì trọng lƣợng bình càng giảm, chứng tỏ hoạt lực lên men càng cao. Kết quả thu đƣợc ở bảng sau:
Bảng 3.3. Hoạt lực lên men của các chủng nấm nem sau 72h
Chủng nấm men Lƣợng CO2 (g/100ml) T1 2.85 ± 0.02 T4 3.02 ± 0.02 T5 1.97 ± 0.03 T9 2.10 ± 0.02 T11 2.67 ± 0.01
Kết quả nghiên cứu cho thấy 3 chủng T1, T4, T11 có lƣợng CO2 thoát ra nhiều đạt 2.67 – 3.02 g/100ml chứng tỏ tế bào nấm men phát triển nhanh làm cho vi khuẩn và nấm men dại khó xâm nhập. Các chủng T5, T9 có lƣợng CO2 thoát ra ít hơn (1.97 – 2.10 g/100ml).
Như vậy, 3, chủng T1, T4 và T11 có hoạt lực lên men mạnh.
3.2.2. Khả năng lên men đường
Xác định khả năng lên men đƣờng của các chủng nấm men thu đƣợc chúng tôi tiến hành xác định HL đƣờng sót và nồng độ cồn trong dịch lên men. Các chủng nấm men đƣợc đƣa vào môi trƣờng dịch quả 100ml, HL đƣờng 250g/l, pH: 4, nhiệt đô 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 106
tế bào/ml. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng lên men của các chủng nấm men ở các loại đường khác nhau Chỉ tiêu đánh giá Chủng nấm men T1 T4 T5 T9 T11 Đƣờng tổng số (g) 250 ±0.02 250 ± 0.02 250 ± 0.02 250 ± 0.02 250 ± 0.02 HL đƣờng sót (%) 4.2 ± 0.01 5.0 ± 0.01 6.2 ± 0.01 6.3 ± 0.02 5.4 ± 0.02 HL cồn (%V) 10.2 ± 0.02 10.4 ± 0.03 7.1 ± 0.05 6.9 ± 0.02 9.8 ± 0.04
Từ kết quả ở bảng, chúng tôi thấy 3 chủng T1, T4 và T11 lên men có HL đƣờng sót (4.2 – 5.4%), thấp hơn so với các chủng T5 6.2% và T9 6.3%, HL cồn và hiệu suất lên men của 3 chủng T1, T4 và T11 cũng cao nhất sau đó là các chủng T5, T9.
Như vậy, 3 chủng T1, T4 và T11 có khả năng lên men đường mạnh.
3.2.3. Khả năng kết lắng
Trong quá trình lên men khả năng kết lắng tốt sẽ làm cho dịch lên men trong, lọc sản phẩm dễ hơn [13]. Chúng tôi tiến hành bằng cách hòa sinh khối nấm men thu đƣợc vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút TG 3 – 5 phút và để lắng 15 phút. Chúng tôi thu đƣợc kết quả ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khả năng kết lắng của ba chủng nấm men
Tên chủng T1 T4 T5 T9 T11
Chiều cao cột sinh khối (mm)
Kết quả nghiên cứu cho thấy, các chủng T1, T4 và T11 có lớp cặn men >23mm, do đó chúng có khả năng kết lắng tốt, cho dịch lên men trong hơn 2 chủng còn lại.
Kết luận cho thấy 3 chủng T1, T4 và T11 có khả năng kết lắng tốt.
3.2.4. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm
Sau khi lên men đƣợc 30 ngày, chúng tôi tiến hành xác định khả năng tạo hƣơng thơm, độ trong bằng phƣơng pháp cảm quan. Từ kết quả cho thấy 3 chủng nấm men T1, T4 và T11 đạt độ trong và hƣơng thơm tốt hơn 2 chủng còn lại.
Tổng hợp các kết quả từ các thí nghiệm trên cho thấy chủng nấm men T1, T4 và T11 có khả năng lên men tốt nhất và tạo sản phẩm có nhiều ƣu điểm.
Vì vậy, chúng tôi chọn chủng T1, T4 và T11 để tiếp tục nghiên cứu.
3.2.5. Xác định tên khoa học của chủng nấm men nghiên cứu
Sau đó tôi tiến hành quan sát hình thái tế bào học của các mẫu nấm men bằng cách làm tiêu bản sau đó soi trên kính hiển vi Olympus CX31với độ phóng đại 1000 lần.
Hình 3.3.Tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần
Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1971) [15], và các kết quả thí nghiệm đối với các chủng nấm men T1, T4 và T11 đặc tính:
Khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng, viền xung quanh nhẵn (hình 3.1). Tế bào đều có hình ovan, hình trứng, hình cầu (hình 3.3)
Sinh sản bằng hình thức nảy chồi (hình 3.3)
Có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ saccaroza, glucoza… Điều kiện không thuận lợi hình thành 1 – 4 bào tử. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ đó có thể khẳng định đƣợc 3 chủng nấm men phân lập đƣợc từ dịch nho Cabernet sauvignon là S. cerevisiae thuộc chi Saccharomyces. Chúng tôi đặt tên là S. cerevisiae T1, S. cerevisiae T4 và S. cerevisiae T11.
Tổng hợp kết quả ở các phần 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3, 3.2.4 cho thấy 3 chủng T1, T4 và T11 là chủng tốt, có hoạt lực lên men cao, và kết lắng cao, chất lƣợng cảm quan tốt.
Như vậy, từ dịch nho Cabernet sauvignon tuyển chọn được 3 chủng T1, T4 và T11 làm đối tượng để tiếp tục nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Đánh giá sự đa dạng của nấm men dựa vào khả năng sử dụng các nguồn dinh dƣỡng và điều kiên nuôi cấy nguồn dinh dƣỡng và điều kiên nuôi cấy
3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau
3.3.1.1. Khả năng sử dụng đa dạng các loại đường
Nguồn dinh dƣỡng cacbon của nấm men rất đa dạng, chúng có thể là các loại đƣờng và dẫn xuất, các rƣợu, các axit hữu cơ, axit amin... Trong đó nguồn dinh dƣỡng cacbon đƣợc ƣu tiên sử dụng là các loại đƣờng. Để xác định khả năng lên men với các loại đƣờng của mẫu T1, T4, T11 chúng tôi sử dụng phƣơng pháp lên men trong các bình lên men có thể tích 100 ml bằng cách lấy từng mẫu vào 3 loại môi trƣờng lên men (mỗi môi trƣờng ứng với một loại đƣờng đƣợc bổ sung) với HL đƣờng ban đầu là 250 g/l, HL men giống 10%, pH: 4, nhiệt độ 26 – 280C với TG lên men là 8 ngày.
Chúng tôi dựa vào một số chỉ tiêu sau để đánh giá khả năng lên men các loại đƣờng là:
HL đƣờng sót. HL cồn.
Lƣợng CO2 tạo thành.
Kết quả thu đƣợc sau 8 ngày lên men đƣợc thể hiện ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khả năng sử dụng đa dạng các loại đường trong dịch lên men của 3 chủng nấm men T1, T4 và T11 Chỉ tiêu Loại đƣờng Chủng nấm men HL đƣờng sót (%) Etanol (%V) Glucozo T1 5.3 ± 0.2 9.8 ± 0.2 T4 5.1 ± 0.1 10.0 ± 0.2 T11 4.9 ± 0.2 9.7 ± 0.2 Saccarozo T1 7.3 ± 0.2 8.2 ± 0.1 T4 7.7 ± 0.3 7.7 ± 0.1 T11 7.8 ± 0.1 8.6 ± 0.2 Mantozo T1 9.2 ± 0.1 5.7 ± 0.3 T4 9.7 ± 0.3 5.5 ± 0.2 T11 9.6 ± 0.3 5.8 ± 0.3
Từ kết quả tên ta nhận thấy chủng S. cerevisiae T1, T4 và T11 có khả năng sử dụng cả 3 loại đƣờng glucozo, saccarozo và mantozo. Tuy nhiên khả năng sử dụng các loại đƣờng là khác nhau.
Với đƣờng saccarozo: nấm men có khả năng hấp thụ tốt, lƣợng CO2
thoát ra nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men mạnh, cho sinh khối nấm men lớn, sản phẩm tạo ra có mùi thơm nhẹ.
Đƣờng mantozo: nấm men hấp thụ mạnh hơn cho sinh khối lớn, sản phẩm tạo ra cho chất lƣợng cảm quan tốt với hƣơng thơm, màu sắc và độ trong cao.
Đƣờng glucozo: đây là loại đƣờng thích hợp cho lên men rƣợu vang, lƣợng CO2 thoát ra nhiều, sinh khối tăng cao. Sản phẩm cho chất lƣợng tốt. còn đối với môi trƣờng có đƣờng saccaroza và mantozo có khả năng lên men nhƣng không mạnh bằng.
Kết quả nghiên cứu của tôi phù hợp với tác giả Phạm Thị Vƣợng [16].
Như vậy, 3 chủng nấm men sử dụng được cả 3 loại đường glucozo, saccarozo và mantozo. Tuy nhiên glucozo là nguồn đường thích hợp với quá trình lên men vang nho.
3.3.1.2. Khả năng lên men ở các hàm lượng đường khác nhau
Đƣờng là nguồn cacbon đóng vai trò quan trọng nhất trong việc tạo thành rƣợu trong vang nho. Để nghiên cứu ảnh hƣởng của HL đƣờng tới quá trình lên men vang nho, chúng tôi chọn HL đƣờng ban đầu ở các mức khác nhau là: 230g/l, 250g/l, 270g/l, 290g/l. Môi trƣờng lên men đƣợc bổ sung với HL men giống là 10%, pH: 4, tiến hành lên men ở nhiệt độ 26 – 280C trong các bình lên men có dung tích 100ml với TG lên men là 8 ngày [10]. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae T1, T4 và T11 trên môi trường có hàm lượng đường ở các mức khác nhau
Đơn vị Chỉ tiêu HL đƣờng (g/l) 230 250 270 290 HL đƣờng sót (%) T1 5.6 ± 0.2 3.4 ± 0.2 6.0 ± 0.2 9,2 ± 0.2 T4 5.0 ± 0.2 3.1 ± 0.2 6.5 ± 0.2 9.8 ± 0.2 T11 4.9 ± 0.2 3.0 ± 0.2 6.7 ± 0.2 9.5 ± 0.2 Etanol (%V) T1 9.7 ± 0.1 11.6 ± 0.1 10.5 ± 0.1 8.7 ± 0.1 T4 10.4 ± 0.1 11.7 ± 0.1 10.8 ± 0.1 9.3 ± 0.1 T11 10.2 ± 0.1 12.0 ± 0.1 11.4 ± 0.1 9.2 ± 0.1 Kết quả cho thấy trong môi trƣờng có HL đƣờng 25% thì lƣợng rƣợu tạo thành cao 11.6 – 12.0%, HL đƣờng sót trong dịch lên men thấp chỉ còn 3.0 – 3.4%. Với mẫu có HL đƣờng 29% thì nấm men phát triển kém, HL