2.2.1. Xây dựng qui trình sản xuất
Sơ đồ qui trình bào chế viên nang salbutamol TDKD
Dựa vào các kết quả nghiên cứu, các tài liệu tham khảo, chúng tôi đưa ra qui trình sản xuất pellet nhưsau:
Qui trình tóm tắt
a. Bào chế pellet salbutamol: Bằng phương pháp đùn tạo cầu
−Trộn khô: theo nguyên tắc đồng lượng.
−Trộn ướt: Trộn hỗn hợp bột khô với dịch HPMC 3% .
−Đùn: Đùn sợi có đường kính 1mm.
− Tạo cầu: Để thu được pellet có đường kính nằm trong khoảng 0,8 - 1,25 mm. tròn đều.
−Sấy: Đếnđộ ẩm < 3%.
b. Bào chế pellet TDKD:Dùng phương pháp bao màng kiểm soát giải phóng.
c. Đóng nang –ép vỉ: Pellet salbutamol TDKD đạt tiêu chuẩn được đóng nang bằng máy đóng nang tự động, ép vỉ 10 viên/vỉ.
2.2.2. Phương pháp thẩm định qui trình bào chế:
Dùng phương phápthẩm định trướcqui trình sản xuất, quacác bước [5]:
−Đưa ra được qui trình sản xuất và các yếu tố kiểm soát quá trình.
− Đánh giá nguy cơ: Xác định được tất cả các nguy cơ có thể xảy ra ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, mức độ xảy ra, mức độ ảnh hưởng và khả năng phát hiện.
− Xác định thông số trọng yếu và khảo sát: Dựa vào tiêu chuẩn chất lượng của sản phẩm, khả năng thiết bị, kinh nghiệm thực tế để xác định thông số trọng yếu, giới hạn và phương pháp xác định từng thông số.
−Thông số kiểm soát: Lựa chọn được đúng các thông số có giá trị kiểm soát quá trình sản xuất
−Kế hoạch lấy mẫu và khảo sát: Thiết lập được kế hoạch lấy mẫu tại các thời điểm phù hợp trong quá trình sản xuất, phương pháp lấy mẫu đảm bảo mẫu đại diện.
−Kiểm tra chất lượng:Theo các phương pháp phù hợp với từng nội dung.
− Đánh giá tính lặp lại của quy trình: Sử dụng phần mềm Excel hoặc phần mềm Phaprosol PV.
−Đánh giá sự kiểm soát thống kê của quy trình: Sử dụng phần mềm Phaprosol PV.
Dùng dữ liệu sơ cấp vẽ biểu đồ: (khảo sát từng lô) kiểm soát sự đạt tiêu chuẩn bằng biểu đồ Shewhart X_ và R.
Dùng dữ liệu thứ cấp so sánh 3 lô.
− Ghi kết quả đánh giá vào báo cáo thẩm định: Sử dụng kết quả mà phần mềm đưa ra để thiết lập báo cáo thẩm định, xác định xem 3 lô có đồng nhất về mặt thống kê đối với yếu tố đang xem xét hay không.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học
2.2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm:
Dùng phương pháp thiết kế chéo đôi, ngẫu nhiên đơn liều theo FDA để đánh giá SKD và TĐSH [22]
06 chó được chia làm hai nhóm một cách ngẫu nhiên với 2 giai đoạn thử như sau: Giai đoạn Nhóm 1 2 1 R T 2 T R Trong đó: R: viên Volmax 8 mg.
T: viên nang salbutamol TDKD 8 mg.
Cho chó uống 1 viên thuốc nguyên vẹn với 50 ml nước trong tình trạng không gây mê. Cho chó ăn nhẹ sau 2 giờ và ăn chính sau 4 giờ uống thuốc. Trong quá trình
thí nghiệm, bổ sung chất điện giải (dung dịch NaCl 0,9%) và dung dịch glucose 20% bằng cách tiêm vào hốc bụng.
Mỗi lần dùng thuốc cách nhau 7 ngày.
Yêu cầu đối với chó: Trước khi uống thuốc và trong suốt thời gian thử nghiệm chó không được cho uống bất kỳ loại thuốc nào.
2.2.3.2. Phương pháp lấy mẫu, xử lývà bảo quản:
Lấy mỗi lần khoảng 5ml máu với thời gian tính từ khi uống thuốc là: 0, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 24 và 30h. Máu được đưa vào ống nghiệm có chứa 0,05g EDTA, lắc đều, đem ly tâm ở tốc độ 3000v/phút trong 10 phút, lấy phần huyết tương. Các mẫu huyết tương thu được đem bảo quản ở nhiệt độ - 350C cho tới khi phân tích
Trước khi đưa vào phân tích, mẫu được để rã đông và đưa về nhiệt độ phòng. Chiết hoạt chất bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE - solid phase extraction) gồm các bước: hoạt hoá cột, nạp mẫu huyết tương, rửa tạp, rửa giải.
Dịch rửa giải được cô trong môi trường khí nitơ và hoà tan cắn trong 1ml pha động để chạy sắc ký. Dung dịch thu được dùng để định lượng bằng HPLC.
2.2.3.3. Phương pháp định lượng salbutamol bằng HPLC
Mẫu huyết tương thu được ở trên được phân tích trên hệ thống sắc ký HPLC Shimadzu Prominence, detector huỳnh quang, cột Gemini C18e, với các điều kiện sắc ký phù hợp.Phân tích mẫu được bắt đầu ngay sau khi lấy đủ các mẫu. Quá trình phân tích tuân thủ theo hướng dẫn về phân tích mẫu trong dịch sinh học
(bioanalytical runs) của US – FDA [22]
2.2.3.4. Phương pháp thẩm định phương pháp định lượng trong huyết tương
Việc thẩm định phương pháp định lượng salbutamol trong huyết tương chó được thực hiện theo qui định của Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ [22].
Tiến hành thẩm định trên các mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử .
– Mẫu chuẩn:
+ Dung dịch chuẩn gốc (10 àg/ml): Ho… tan 50 mg chuẩn Salbutamol trong 50 ml MeOH. Lấy 1ml dung dịch n…y, cho v…o bình định mức 100 ml, thêm MeOH tới vừa đủ thể tích.
- Dung dịch chuẩn l…m việc (1 àg salbutamol/ml huyếtt tương): lấy 0,5 ml
dung dịch chuẩn gốc cho v…o ống nghiệm, cô đuổi dung môi thu cắn (600C, khí
N2). Ho… tan cắn trong 5 ml huyết tương trắng (lắc xoaý 2000 vòng/phút x 10 phút).
- Pha dãy mẫu chuẩn nồng độ từ 5 ng/ml đến 250 ng/ml theo bảng dưới: Nồng độ(ng/ml) 0 5 10 25 50 100 200 250 Chuẩn l…m việc (àl) 0 5 10 25 50 100 200 250 Huyết tương trắng (àl) 1000 995 990 975 950 900 800 750
– Mẫu trắng: Huyết tương chó không chứa salbutamol, lấy ngẫu nhiên trên 6 chó.
– Mẫu QC: Chuẩn bị tương tự như các mẫu chuẩn. Mẫu QC chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc độc lập với dung dịch chuẩn gốc dùng để pha mẫu chuẩn. Mẫu QC gồm 3 loại: Mẫu LQC có nồng độ = 3 lần nồng độ mẫu LLOQ; mẫu MQC có nồng độ = 50
– 80 % nồng độ Cmax và mẫu HQC có nồng độ = 60 – 80 % nồng độ mẫu ULOQ.
– Mẫu thử : Huyết tương chó sau khi uống salbutamol. Các chỉ tiêu được thẩm định theo các phương pháp sau:
+ Phương pháp xác định tính chọn lọc:
Tính chọn lọc của phương pháp được xác định bằng cách so sánh sắc ký đồ của mẫu thử (mẫu huyết tương chó sau khi uống thuốc), mẫu trắng và mẫu salbutamol chuẩn pha trong huyết tương trắng. Các mẫu này đều được xử lý như nêu trong mục 2.2.3.2.và được sắc ký như nêu trong mục 2.2.3.3.
Trên sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng không được có pic tại vị trí pic của salbutamol trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn.
+ Phương pháp xây dựng đường chuẩn:
Sắc ký các mẫu trong dãy mẫu chuẩn đã pha, mẫu huyết tương trắng trong các điều kiện sắc ký như ghi trong mục 2.2.3.3. Xác định diện tích pic salbutamol thu được. Từ diện tích pic của salbutamol tại các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi qui giữa diện tích pic và nồng độ salbutamol có trong mẫu.
Đường chuẩn định lượng salbutamol trong huyết tương là đường hồi qui tuyến tính, biểu diễn bằng phương trình:
y = ax+ b
Trong đó: y: diện tích pic salbutamol
x: nồng độ salbutamol trong huyết tương chó (àg/ml) a: độ dốc
b: độ chắn
Đường chuẩn phải có hệ số tương quan > 0,98 và ít nhất 2/7 số điểm của đường chuẩn (không kể mẫu trắng), bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85% đến 115%, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%.
+ Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):
Mẫu có nồng độ salbutamol thấp nhất ở trên được coi là giới hạn định lượng dưới của phương pháp nếu trên sắc ký đồ của mẫu đó cho pic salbutamol tách biệt với các pic tạp, có độ đúng từ 80 – 120 %; độ lặp lại với giá trị RSD không vượt quá 20% và đáp ứng pic của salbutamol gấp ít nhất là 5 lần đáp ứng của mẫu trắng.
+Phương pháp xác định độ đúng
Tiến hành sắc ký các mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC, mỗi mẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập có cùng nồng độ. Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng, tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị trung bình của các lần định lượng của mỗi nồng độ với giá trị thực có trong mẫu, tính theo lượng chuẩn đã cân và thể tích đã pha. Độ đúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%.
+ Phương pháp xác định độ chính xác:
– Độ lặp lại trong ngày: Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày. Giá trị RSD phải không được vượt quá 15%, trừ mẫu LQC không vượt quá 20%.
– Độ lặp lại giữa các ngày: Tiến hành tương tự như xác định độ lặp lại trong ngày trong 3 ngày liên tiếp. Tính giá trị RSD của kết quả định lượng cho mỗi nồng
độ trong ít nhất 3 ngày phân tích khác nhau. Giá trị RSD phải không được vượt quá 15%, trừ mẫu LQC không vượt quá 20%.
+ Phương pháp thẩm định hiệu suất chiết:
Tiến hành sắc ký các mẫu LQC; MQC và HQC theo qui trình đã xây dựng. Song song tiến hành định lượng với các mẫu chuẩn pha trong pha động, có nồng độ tương ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh kết quả định lượng salbutamol của mẫu QC có qua chiết tách – với mẫu chuẩn pha trong pha động (không qua chiết tách). Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi hiệu suất chiết không quá 110% và không thấp hơn 30%; RSD của giá trị hiệu suất chiết tại các nồng độ không quá 15% và hiệu suất chiết trung bình tại các nồng độ khác nhau không quá ±15 %.
+ Phương pháp thấm định độ ổn định của mẫu thử:
* Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc:
– ổn định thời gian ngắn:
Chia dung dịch chuẩn thành 2 phần: một phần để ở điều kiện nhiệt độ phòng, một phần bảo quản ở lạnh –40oC trong khoảng thời gian 8 giờ. Xác định lượng hoạt chất có trong mẫu để ở nhiệt độ phòng và mẫu bảo quản lạnh. Kết quả phải sai khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
– Độ ổn định dài ngày của dung dịch chuẩn gốc:
Bảo quản dung dịch chuẩn gốc salbutamol ở nhiệt độ –40oC. Phân tích xác định nồng độ khi bắt đầu và sau 15 ngày bảo quản. So sánh thống kê (t-test) để đánh giá mức độ ổn định của mẫu ở điều kiện bảo quản tương ứng.
* Độ ổn định của salbutamol trong huyết tương:
Xác định độ ổn định của salbutamol sau ba chu kỳ đông – rã đông; trong quá trình xử lý mẫu và trong quá trình bảo quản dài ngày trên các mẫu LQC và HQC.
– Độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông:
Bảo quản các mẫu ở nhiệt độ –40oC trong 24 giờ, lấy ra và để tan ở nhiệt độ phòng. Sau khi đã tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 – 24giờ. Lặp lại chu kỳ đông – rã đông 2 lần nữa. Tiến hành phân tích mẫu sau lần để rã đông thứ 3. Kết quả lượng salbutamol có trong mẫu sau 3 chu kỳ đông – rã đông
phải tương đương với lượng salbutamol có trong mẫu phân tích ngay sau khi để rã đông.
– Độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu:
So sánh lượng salbutamol có trong mẫu được chiết tách ngay sau khi rã đông và mẫu có nồng độ tương ứng chỉ được chiết tách sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng tối thiểu 4 giờ. Kết quả phải sai khác không có ý nghĩa thống kê.
– Độ ổn định dài ngày:
Bảo quản mẫu trong điều kiện –40oC. Phân tích xác định nồng độ salbutamol trong các mẫu sau từng khoảng thời gian: bắt đầu và sau 10 đến 28 ngày. So sánh kết quả định lượng của các mẫu tại từng thời điểm trong quá trình theo dõi với giá trị định lượng ban đầu. Mẫu phải ổn định tại điều kiện bảo quản trong khoảng thời gian tối thiếu phải đủ để tiến hành lấy mẫu máu và phân tích hết số mẫu huyết tương của chó thí nghiệm (khoảng 4 tuần).
2.2.3.5. Phương pháp phân tích dược động học và đánh giá kết quả
Từ nồng độ thuốc đã định lượng được trong các mẫu huyết tương, vẽ đường cong nồng độ thuốc – thời gian của từng cá thể. Xác định các thông số DĐH của thuốc thử và thuốc chứng [18]:
– Cmax và Tmaxxác định trực tiếp từ các số liệu thực nghiệm.
– AUC0-t xác địnhbằng phương pháp hình thang:
[ ] ∑− ( ) ( ) = + + ì − + = 1 0 1 1 0 2 n i i i i i t C C t t AUC
Với Ci là nồng độ salbutamol tại thời điểm lấy mẫu ti.
– AUC0-∞ = AUC0-t + Cn/λz.
Với Cn là nồng độ salbutamol tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng còn đinh lượng đượcvà λZ là hệ số tốc độ thải trừ.
– λz: hệsố tốc độ thải trừ.
λz được tính từ độ dốc của đường thẳng biểu diễn logarit nồng độ salbutamol trong huyết tươngtheo thời gian tại 4 điểm lấy mẫu cuối cùng của pha thải trừ.
– T1/2: thời gian bán thải z 2 / 1 2 ln T λ =
– AUMC: diện tích dưới đườngcong nồng độ ìthời gian - thờigian
[ ] ( ) ( ) 2 z n z n n i 1 i 1 n 0 i 1 i 1 i i i 0 C t C 2 t t C t C t AUMC λ + λ ⋅ + − ⋅ ⋅ + ⋅ = − + = + + ∞ ∑
– MRT: thời gian lưu trú trung bình của phân tử salbutamol:
[ ] [ ]∞ ∞ = 0 0 AUC AUMC MRT
Đánh giá TĐSH viên nang salbutamol TDKD thông qua so sánh các thông số
Cmax, AUC0-∞, MRT và Tmax của thuốc thử với thuốc chứng (Vomax) theo qui định trong dược điển USP 26 [34]:
– Với Cmax và AUC: Phân tích phương sai (ANOVA), xác định khoảng tin cậy 90% (CI) của sự sai khác giữa hai giá trị trung bình thuốc thử và thuốc đối chứng (số liệu đã chuyển dạng logarit) [11], [4]:
N EMS N t R T CI = ln( ) ± (0,1; ') 2ì
Trong đó: + T: Giá trị Cmax , AUC0-∞ hoặcMRT của thuốc thử + R: Giá trị Cmax , AUC0-∞ hoặcMRT của thuốcchứng
+ N–: Bậc tự do của sai số xác định bằng ANOVA (N–=N-2) + ESM: Trung bình bình phương của sai số xác định bằng ANOVA + N: Tổng số chó thí nghiệmđánh giá TĐSH
+ t(0,1;N'):kết quả tra từ bảng Student t - test với bậc tự do N' và mức ý nghĩa 0,1
– Với Tmax: So sánh theo phương pháp thống kê không tham số (Wincoxon signed rank test) [11], [4].
Hai chế phẩm đượccoi là tương đương sinh học nếu khoảng tin cậy 90% của tỷ lệ các giá trị trung bình của Cmax, AUC0-∞ và MRT (đã chuyển logarit) giữa thuốc
thử và thuốc chứng nằm trong khoảng từ 0,8 – 1,25 và Tmax khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
phần III
Kết quả nghiên cứu và bàn luận
3.1. bào chế viên nang salbutamol TDKD ở qui mô pilot
3.1.1. Bào chế pellet salbutamol
3.1.1.1. Thành phần công thức:
Chúng tôi sử dụng kết quả nghiên cứu công thức bào chế pellet salbutamol của tác giả Trần Thị Thanh Tú [15], để tiếp tục triển khai ở qui mô pilot.
Thành phần nguyên liệu Viên nang 8mg lô 3000 viên
Giai đoạn tạo pellet
Salbutamol sul fat 9,6 mg 36g
Avicel 192 mg 720g
Lactose 118,4mg 444g
Dung dịch HPMC 3% trong nước vđ vđ
Giai đoạn bao màng (công thức cho 1000 g pellet)
EC 67,3 g Eudragit RSPO 10,3 g DBP 39,4 g TiO2 16,3 g Tween 80 14,5 g Ethanol 96% 1500 ml
Giai đoạn đóng nang
Pellet salbutamol TDKD 1200g
3.1.1.2. Qui trình bào chế viên nang salbutamol TDKD
Theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.2, trên cơ sở 03 lô sản xuất thực tế, mỗi mẻ 3000 nang, chúng tôi đề xuất qui trình sản xuất như sau: