hơn 2%. Vậy t1/2 và Ke của thuốc thử và thuốc chứng khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
3.2.4.2. Phân tích thống kê và so sánh SKD
Từ kết quả xác định các thông số DĐH của thuốc thử và thuốc đối chứng ở bảng 3.14, so sánh đánh giá TĐSH chế phẩm Salbutamol TDKD theo qui định của dược điển Mỹ 26 [50].
Kết quả phân tích phương sai, xác định khoảng tin cậy 90% được trình bày ở các bảng 3.16, 3.17 và 3.18.
a. Phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy 90% của tỷ sốln[ Cmax]
Bảng 3.16: Phân tích phương sai với biến phụ thuộc là ln[Cmax]
Nguồn biến thiên Bậc tự do (df) Tổng bình phương bình phương Trung bình F P
Tổng 11 0.2546 Trình tự thử 1 0.0324 0.0324 0.6003 0.4817 Chó 4 0.2158 0.0539 62.1811 0.0007 Thuốc (mẫu) 1 0.0022 0.0022 2.4815 0.1903 Giai đoạn 1 0.0008 0.0008 0.9141 0.3932 Sai số 4 0.0035 0.0009
Căn bậc 2 của trung bình
bình phương sai số 0.0295 CV = 0,70%
Kết quả phân tích phương sai ở bảng 3.16 cho thấy:
- PTrình tự > 0,05 chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các nhóm chó (hay trình tự thử thuốc) đến ln[Cmax] không có ý nghĩa thống kê.
- P chó < 0,01 chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các cá thể đến ln[Cmax] có ý nghĩa thống kê.
- PMẫu > 0,05 chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa thuốc thử và thuốc chứng đến ln[Cmax] không có ý nghĩa thống kê.
Giaiđoạn
thử thuốc đến ln[Cmax] không có ý nghĩa thống kê.
Từ kết quả xác định giá trị trung bình bình phương (0,0009) và bậc tự do của sai số (4), xác định được khoảng tin cậy 90% của hiệu số giữa ln[Cmax]thuốc thử và ln[Cmax]thuốc chứng là:
[ 0,111] [; 0,075] 057 , 0 018 , 0 12 0009 , 0 2 ) 4 ; 1 , 0 ( ) ln( ) ln( ___ __________ max ___ __________ max − ± ì =− ± = − = C T C R t CI
Vậy giới hạn dưới giá trị Cmax của thuốc thử là e-0,111 = 0,918 và giới hạn trên là e0,075 = 1,204. Khoảng tin cậy của giá trị Cmax nằm trong khoảng 0,8 – 1,25 hay 80 đến 125 %.
Hai giá trị Cmax tương đương nhau theo qui định của USP 26 [50].
b. Phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy 90% của tỷ số ln [AUC0-∞]
Bảng 3.17: Phân tích phương sai với biến phụ thuộc là ln[AUC0-∞]
Nguồn biến thiên do (df) Bậc tự Tổng bình phương Trung bình bình phương F P Tổng 11 0.4650 Trình tự thử 1 0.0531 0.0531 0.5588 0.4963 Chó 4 0.3799 0.0950 67.2061 0.0006 Thuốc (mẫu) 1 0.0096 0.0096 6.8063 0.0595 Giai đoạn 1 0.0168 0.0168 11.8848 0.0261 Sai số 4 0.0057 0.0014
Căn bậc 2 của trung bình
bình phương sai số 0.03759 CV = 0,57%
Kết quả phân tích phương sai ở bảng 3.17 cho thấy:
- PTrình tự > 0,05 chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các nhóm chó (hay trình tự thử thuốc) đến ln[AUC0-∞] không có ý nghĩa thống kê.
chó
ln[AUC0-∞] có ý nghĩa thống kê.
- PMẫu = 0,026 (> 0,01 và < 0,05) chưa đủ số liệu để chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa mẫu thử và mẫu chứng đến ln[AUC0-∞].
- PGiai đoạn > 0,05 chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các giai đoạn thử thuốc đến ln[AUC0-∞] không có ý nghĩa thống kê.
Từ kết quả xác định giá trị trung bình bình phương (0,03759) và bậc tự do của sai số (4), xác định được khoảng tin cậy 90% của hiệu số giữa ln[AUC0- ∞]thuốc thử và ln[AUC0-∞] thuốc chứng là:
[0,039] [; 0,219] 090 , 0 129 , 0 4 0,03759 2 ) 10 ; 1 , 0 ( ) ln( ) ln( ___ __________ 0 ___ __________ 0 − ± ì = ± = = AUC −∞T AUC −∞R t CI
Vậy giới hạn dưới giá trị AUC0-∞ của thuốc thử là e0,039 = 1,040 và giới hạn trên là e0,219 = 1,244. Khoảng tin cậy của giá trị AUC0-∞ nằm trong khoảng 0,8 – 1,25 hay 80 đến 125 %.
Hai giá trị AUC0-∞tương đương nhau theo qui định của USP 26[50].
c. Phân tích phương sai và xác định khoảng tin cậy 90% của tỷ số ln[MRT]
Bảng 3.18: Phân tích phương sai với biến phụ thuộc là ln[MRT]
Nguồn biến
thiên do (df) Bậc tự Tổng bình phương bình phương Trung bình F P
Tổng 11 0,0443 Trình tự thử 1 0,0169 0,0169 3,0244 0,1570 Chó 4 0,0224 0,0056 55,4489 0,0009 Thuốc (mẫu) 1 0,0016 0,0016 15,6614 0,0167 Giai đoạn 1 0,0030 0,0030 29,3229 0,0056 Sai số 4 0,0004 0,0001
Căn bậc 2 của trung bình
- PTrình tự > 0,05 chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các nhóm chó (hay trình tự thử thuốc) đến ln[ MRT] không có ý nghĩa thống kê.
- P chó < 0,01 chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các cá thể đến ln[ MRT] có ý nghĩa thống kê.
- PMẫu = 0,0167 (> 0,01 và < 0,05) chưa đủ số liệu để chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa mẫu thử và mẫu chứng đến ln[ MRT].
- PGiai đoạn > 0,05 chứng tỏ ảnh hưởng của sự khác nhau giữa các giai đoạn thử thuốc đến ln[ MRT] không có ý nghĩa thống kê.
Từ kết quả xác định giá trị trung bình bình phương (0,0001) và bậc tự do của sai số (4), xác định được khoảng tin cậy 90% của hiệu số giữa ln[ MRT]thuốc thử và ln[ MRT]thuốc chứng là: [0,0107] [; 0,0353] 0,0123 0,0230 6 0,0001 2 ) 4 ; 1 , 0 ( ) ln( ) ln( _______ __________ 0 ________ __________ 0 − ± ì = ± = = MRT−∞T MRT−∞R t CI
Vậy giới hạn dưới giá trị AUC0-∞ của thuốc thử là e0,0353 = 1,036 và giới hạn trên là e0,0107 = 1,0108. Khoảng tin cậy của giá trị MRT nằm trong khoảng 0,8 – 1,25 hay 80 đến 125 %.
Hai giá trị MRT tương đương nhau theo qui định của USP 26.[50]
d. Kết quả so sánh Tmax
So sánh sự khác nhau giữa thời gian đạt đến nồng độ cực đại của thuốc thử và thuốc chứng theo phương pháp thống kê không tham số (Wincoxon
Signed Rank Test) [11]. Kết quả so sánh trình bày ở bảng 3.19.
Bảng 3.19: So sánh giá trị Tmax theophương pháp thống kê không tham số
ĐVTN Tmax (giờ) Chênh lệch Thứ tự
Thuốc thử Thuốc chứng (+) (-) (+) (-)
1 8 9 1 3
2 9 11 2 6
4
5 9 8 1 3
6 9 8 1 3
Tổng 9 12
Giá trị tổng thứ tự xếp hạng dương và âm là 9 và 12 (sum of positive/negative ranks) đều lớn hơn 5 – giá trị biểu thị cho mức độ sai khác của phương pháp với n = 6, cho thấy giá trị Tmax của hai thuốc thử và thuốc chứng khác nhau không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy lớn hơn 95%.
Kết quả phân tích phương sai, xác định khoảng tin cậy 90% cho thấy giá trị Cmax, AUC 0-∞ và MRT của thuốc thử và thuốc chứng tương đương nhau, giá trị t1/2, Tmax, Ke khác nhau không có ý nghĩa thống kê, vì vậy viên nang Salbutamol TDKD có SKD tương đương với viên Volmax, theo qui định của dược điển Mỹ [49, 50, 51].
3.3. BàN LUậN
3.3.1. Về bào chế viên nang salbutamol TDKD
Với tiêu chuẩn xây dựng được, hiện tại ở Việt Nam chưa có sản phẩm pellet salbutamol TDKD nào lưu hành trên thị trường, vì vậy chỉ so sánh phần thể hiện sự kiểm soát giải phóng với tiêu chuẩn của viên Volmax.
Về phương pháp thẩm định qui trình, đã thực hiện theo các bước thẩm định qui trình được khuyến cáo cho kiểm soát sản xuất theo GMP WHO. Qua qúa trình thẩm định cho thấy:
− Các biến số phụ thuộc: độ đồng đều hàm lượng, độ đồng đều khối lượng và tốc độ giải phóng hoạt chất là các biến số quan trọng, liên quan đến tính an toàn và hiệu quả của thuốc.
− Các biến số phụ thuộc đều có thể kiểm soát, để đảm bảo tính ổn định của qui trình sản xuất.
− Tất cả các biến số độc lập (công thức, thông số qui trình) đều quan trọng và phải được tuân thủ nghiêm túc trong suốt quá trình sản xuất.
3.3.2. Về nghiên cứu dược động học nang salbutamol và so sánh SKD
3.3.2.1. Phương pháp xử lý mẫu
Để phân tích được salbutamol có nồng độ rất thấp trong mẫu huyết tương có thành phần rất phức tạp, tỷ lệ tạp chất lớn bằng phương pháp HPLC thì mẫu huyết tương phải được xử lý bằng các kỹ thuật thích hợp. Xử lý mẫu giúp loại bỏ một hoặc nhiều thành phần tạp chất có trong mẫu, tạo thuận lợi cho quá trình phân tách, định lượng salbutamol bằng phương pháp HPLC. Kỹ thuật chiết SPE là một kỹ thuật hiện đại, đã được nhiều tác giả sử dụng trong chiết xuất salbutamol, nó cho phép tách được lượng hoạt chất rất nhỏ ra khỏi huyết tương.
3.3.2.2. Phương pháp phân tích định lượng SALBUTAMOL trong huyết tương
Phương pháp định lượng salbutamol trong dịch sinh học bằng HPLC đã được công bố trong nhiều tài liệu [30], [31], [32].
Tuy nhiên, các tài liệu trên ít đề cập đến vấn đề thẩm định phương pháp phân tích hoặc chỉ mới thẩm định một vài chỉ tiêu. Phương pháp HPLC định lượng salbutamol trong huyết tương, sử dụng trong nghiên cứu đã được thẩm định đầy đủ (full validation) theo các chỉ tiêu của FDA bao gồm: tính chọn lọc – đặc hiệu, đường chuẩn – khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, giới hạn định lượng, hiệu suất chiết và độ ổn định của mẫu [22], [49], [50], [51].
Với một điều kiện sắc ký không quá phức tạp, dễ dàng triển khai tại các phòng thí nghiệm của Việt Nam, hoạt chất salbutamol đã phân tách hoàn toàn khỏi các thành phần tạp có trong mẫu huyết tương với thời gian triển khai sắc ký dưới 9 phút. Thời gian sắc ký không dài cho phép định lượng toàn bộ số lượng mẫu của mỗi cá thể trong một ngày.
James R. Loss II [30], giá trị LLOQ của phương pháp nhỏ hơn 6 lần (0,83 ng/mL) vì vậy nếu có điều kiện có thể nghiên cứu để tìm phương pháp phân tích tối ưu hơn. Mặt khác, kết quả định lượng mẫu huyết tương của 06 chó trong đánh giá TĐSH cho thấy giá trị LLOQ của phương pháp ≈ 1/14 nồng độ Cmax, cho phép xác định nồng độ SALBUTAMOL trong huyết tương ngay cả tại các thời điểm sau 24h (1/11,8 Cmax), thời gian lưu của salbutamol < 9 phút cũng là một điều kiện thuận lợi cho việc phân tích hết số mẫu của 1 cá thể trong ngày. Do vậy, phương pháp đã có giới hạn định lượng đạt yêu cầu, kết quả phân tích đáng tin cậy. Với điều kiện hiện có tại Việt Nam có thể chấp nhận sử dụng phương pháp này để xác định TĐSH của salbutamol TDKD.
3.3.2.3. Về đánh giá SKD viên nang Salbutamol TDKD
– Thiết kế nghiên cứu:
Một trong những yếu tố có ảnh hưởng tới sự chính xác, phù hợp của kết quả thử TĐSH là phải có một thiết kế nghiên cứu phù hợp. Kết quả thực nghiệm cho thấy giá trị Cmax của tất cả chó đều nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát (bảng 3.3 và 3.14) và Cmax > 15 lần giá trị LLOQ (5 ng/mL) - bảng 3.4 và 3.16; đường cong nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian đã phản ánh được các thông số DĐH của thuốc (hình 3.6), vì vậy, thiết kế nghiên cứu của đề tài là chính xác và phù hợp.
– Về định lượng nồng độ salbutamol trong máu và xác định các thông số DĐH:
Từ kết quả định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương của 06 chó sử dụng 8 mg salbutamol thuốc đối chứng (bảng 3.11), xác định được một số thông số DĐH của viên nang salbutamol TDKD trên chó là: Cmax = 69,1 ng/mL, AUC0-∞= 687,5g.mL/h, MRT = 10,8 giờ và giá trị Tmax = 8,8 giờ (bảng 3.14).
P
PhhầầnnIIVV
K
KẾẾTT LLUUẬẬNN -- ĐĐỀỀ XXUUẤẤTT
4.1. Kết luận
Nghiên cứu bào chế và SKD thuốc TDKD có hoạt chất là salbutamol đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới và trong khu vực trong vài thập niên gần đây nhằm lựa chọn được chế phẩm có tác dụng tốt và tiện lợi phục vụ điều trị. ở Việt nam, đây vẫn là một vấn đề cần được nghiên cứu, để tạo ra một sản phẩm TDKD có chất lượng cao, giá thành rẻ góp phần thực hiện tốt chính sách thuốc quốc gia, chúng tôi đã thực hiện đề tài "nghiên cứu bào chế và sinh khả dụng nang salbutamol TDKD" và rút ra được các kết luận sau:
1. Nghiên cứu sản xuất nang salbutamol TDKD:
− Đã xây dựng được công thức bào chế, qui trình sản xuất, tiêu chuẩn chất lượng và sản xuất 03 lô ổn định viên nang salbutamol TDKD bằng phương pháp đùn
- tạo cầu và bao màng kiểm soát giải phóngsau đó đóng nang và ép vỉ.
−Đã thẩm định qui trình sản xuất trên 03 lô liên tiếp bằng phương pháp thẩm định trước với các bước: xác định nguy cơ, xác định thông số trọng yếu, thông số kiểm soát, thẩm định từng thông số, so sánh dữ liệu sơ cấp trong từng lô và dữ liệu thứ cấp giữa các lô. Kết quả thẩm định chứng minh qui trình sản xuất là ổn định và được kiểm soát về mặt thống kê.
2. Nghiên cứu sinh khả dụng:
− Đã xây dựng được phương pháp định lượng salbutamol trong huyết tương với các điều kiện sau:
Qui trình xử lý mẫu: Lấy 1 ml mẫu huyết tương cho chảy chậm qua cột SPE đẫ được hoạt hoá, thu lấy dịch rửa giải, cô đuổi dung môi trong môi trường khí nitơ, hoà tan cắn bằng 1ml pha động.
Cột: Gemini C18e, 250 x 4 mm; 5àm. Nhiệt độ cột: 400C
Pha động: MeCN: MeOH : Đệm phosphat pH3,0 tỷ lệ 14: 10: 76 (v/v/v). Tốc độ dòng 1,0 ml/phút.
Detector huỳnh quang: λex = 265 nm; λem = 310 nm. Thể tích tiêm mẫu: 50àl
−Phương pháp đã được thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn của dược điển Mỹ: đặc hiệu - chọn lọc với salbutamol, giới hạn định lượng dưới là 5ng/ml, khoảng nồng độ tuyến tính: 5 - 250 ng/ml... đáp ứng các yêu cầu của phương pháp phân tích dùng trong sinh học. Phương pháp trên đã được áp dụng để xác định nồng độ của salbutamol trong huyết tương chó trong thí nghiệm nghiên cứu sinh khả dụng của nang salbutamol.
−Đãtriển khai đánh giá SKD nang salbutamol TDKD trên 6 chó và thu được kết quả như sau:
ThôngsốDĐH Nang salbutamol TDKD Viên Volmax
Cmax … SD (ng/ml) 69,1 ±11,16 70,8 ±9,90 AUC … SD (ng. giờ /ml) 687,5 ±138,07 729,5 ±154,95 MRT ±SD (giờ) 10,8 ±0,56 10,6 ±0,84 Tmax … SD (giờ) 8,8 ±0,41 9,0 ±1,26 T1/2… SD (giờ) 9,8 ±0,64 10,09 ±0,96 Ke … SD 0,071 ±0,004 0,069 ±0,006
−Kết quả phân tích phương sai xác định khoảng tin cậy 90% cho thấy Cmax, AUC0 - ∞ và MRT của thuốc thử và thuốc chứng tương đương nhau, giá trị Tmax, t1/2 và λz khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Vậy có thể kết luận SKD của nang salbutamol và viên Volmax là tương đương nhau khi thử nghiệm trên chó.
4.2. Đề xuất
- Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về sinh khả dụng của nang salbutamol TDKD: Về đối tượng thử, số lượng đối tượng thử, tương quan in - vivo, in - vitro.
Hồ sơ của 3 lô sản xuất 1. Lô SA01
Đơn vị Hồ sơ lô sản xuất
Viên nang
Salbutamol TDKD
Tên sản phẩm: Viên nang Salbutamol TDKD
Số lô: SA01 Hạn dùng: Số lượng: 3000 viên Ngày bắt đầu:22/8/06 Ngày kết thúc:26/8/06 thành phần đặc điểm 1. Cho 1 viên: Salbutamol sulfat Avicel Lactose Tá dược vđ 9,6 mg 192 mg 118,4 mg 1viên 1.Mô tả:
Viên nang số 1, thân nang màu trắng, nắp nang màu cam. Bên trong chứa
những hạt pellet màu trắng đục.
2. Cho 1 lô pha 3.000 viên
Salbutamol sulfat Avicel PH101 Lactose
Dung dich HPMC 5% trong nước
36 g 720 g 444 g Vđ
2. Nguyên phụ liệu:
Tất cả nguyên phụ liệu phải đạt tiêu
chuẩn.
3. Máy - Thiết bị
Cân phân tích điện tử 300 g
Cân điện tử 5 kg
Máy xay Việt Nam
2 cái 1 cái 2 cái
3. Cho 1 lô bao màng 3.000 viên
Ethyl cellulose (EC) N10
Dibutylphtalat (DBP) Eudragid RSPO Titan dioxyd Tween 80 Ethanol 96% 67,3 g 39,4 g 10,3 g 16,3 g 14,5 g 1500 ml Máy trộn khô Máy trộn ẩm Tủ sấy tầng sôi Tủ sấy tĩnh điện Máy khuấy từ Máy ép vỉ Đài Loan Rây inox các cỡ Dụng cụ đóng gói