3.1.1. Mô tả dược liệu
Toàn cây phơi hay sấy khô hoặc cây tươi của cây Cần tây (Apium graveolens
L.), họ Cần (Apiaceae).
- Mô tả: Những đoạn thân màu xanh nhạt, khô, dai, có nhiều rãnh dọc, dài 4 – 6cm. Đoạn thân ở ngọn mang lá hay cuống lá, đoạn cuống ở sát gốc có bẹ. Lá màu xanh lục, mỏng, khô quăn, chia 3 thuỳ, mép có răng cưa không đều, dài 1,5 – 3cm. Rễ chùm màu nâu nhạt, có nhiều rễ con, một số rễ con phát triển to hơn. Dược liệu không vị, có mùi thơm đặc trưng.
3.1.2. Soi bột
- Đặc điểm bột thân: Bột màu xanh xám, mùi thơm, không vị. Soi dưới kính hiển vi, bột thân cả 3 mẫu CT1, CT2, CT3 đều có những đặc điểm sau:
1. Mảnh mô mềm gồm những tế bào hình trứng, thành mỏng. 2. Sợi dài, thường kết thành từng bó.
3. Mảnh mạch thường là mạch vạch, mạch xoắn.
4. Ống tiết tinh dầu là những tế bào có thành tròn đều nằm rải rác. 5. Lỗ khí hình hạt đậu.
6. Tinh thể calci oxalate hình khối, hình hộp chữ nhật.
Ảnh chụp các đặc điểm bột thân mẫu CT1, CT2, CT3 dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.1.
- Đặc điểm bột rễ: Bột màu nâu xám, không mùi, không vị. Soi dưới kính hiển vi, bột rễ cả 3 mẫu CT1, CT2, CT3 đều có những đặc điểm sau:
1. Mảnh bần gồm những tế bào hình chữ nhật, có thành dày. 2. Mảnh mô mềm gồm những tế bào hình trứng, thành mỏng. 3. Sợi dài, thường kết thành từng bó.
4. Mảnh mạch thường là mạch vạch, mạch xoắn. 5. Tinh thể calci oxalat hình khối, hình hộp chữ nhật.
6. Hạt tinh bột hình tròn, rốn hạt hình sao rõ, có đường kính 8,2 – 12,3µm, nằm riêng lẻ hay tập trung thành đám trong tế bào mô mềm.
Ảnh chụp các đặc điểm bột rễ mẫu CT1, CT2, CT3 dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.2.
- Đặc điểm bột lá: Bột màu xanh, mùi thơm, vị đắng. Soi dưới kính hiển vi, bột lá cả 3 mẫu CT1, CT2, CT3 đều có những đặc điểm sau:
1. Mảnh mô mềm gồm những tế bào hình trứng, thành mỏng. 2. Sợi dài, thường kết thành từng bó.
3. Mảnh mạch thường là mạch vạch, mạch xoắn.
4. Ống tiết tinh dầu là những tế bào có thành tròn đều nằm rải rác. 5. Lỗ khí hình hạt đậu.
6. Tinh thể calci oxalat hình khối, hình hộp chữ nhật.
Ảnh chụp các đặc điểm bột lá mẫu CT1, CT2, CT3 dưới kính hiển vi được trình bày ở hình 3.3.
1. Mảnh mô mềm 2. Sợi 3. Mảnh mạch
4. Ống tiết tinh dầu 5. Lỗ khí 6. Tinh thể calci oxalat
Hình 3.1: Ảnh chụp các đặc điểm bột thân mẫu CT1, CT2, CT3 dưới KHV
Mẫu CT1
Mẫu CT3 Mẫu CT2
1. Mảnh bần 2. Mảnh mô mềm 3. Sợi 4. Mảnh mạch 5. Tinh thể calci oxalat 6. Tinh bột
Hình 3.2: Ảnh chụp các đặc điểm bột rễ mẫu CT1, CT2, CT3 dưới KHV
Mẫu CT3 Mẫu CT2 Mẫu CT1
1. Mảnh mô mềm 2. Sợi 3. Mảnh mạch
4. Ống tiết tinh dầu 5. Lỗ khí 6. Tinh thể calci oxalat
Hình 3.3: Ảnh chụp các đặc điểm bột lá mẫu CT1, CT2, CT3 dưới KHV
Mẫu CT2
Mẫu CT3 Mẫu CT1
Nhận xét: Kiểm nghiệm bột dược liệu bằng phương pháp hiển vi trên 3 mẫu thấy những đặc điểm vi học của bột Cần tây: Mảnh bần, mảnh mô mềm, sợi, mảnh mạch, lỗ khí, ống tiết tinh dầu, tinh thể calci oxalat, tinh bột.
3.1.3. Vi phẫu
Tiến hành trên mẫu thân, lá, rễ tươi cắt, tẩy và nhuộm theo phương pháp nhuộm kép, soi dưới kính hiển vi.
- Đặc điểm vi phẫu thân: từ ngoài vào trong thấy
1. Biểu bì: Gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn.
2. Mô dày góc: Gồm những tế bào có thành dày, xếp sít nhau tạo thành từng đám màu đỏ đậm sát dưới biểu bì.
3. Mô mềm: Gồm những tế bào hình trứng có thành mỏng, không đều, xếp lộn xộn, bắt màu hồng.
4. Ống tiết: là những tế bào có thành tròn đều nằm trong lớp mô mềm.
5 – 6: Libe – gỗ: hình cung mặt lõm quay vào trong, tạo thành những bó to nhỏ khác nhau xếp đều đặn. Có 7 bó libe-gỗ. Libe ở ngoài bắt màu hồng, gỗ ở trong bắt màu xanh.
7. Mô mềm ruột: gồm các tế bào hình trứng to nhỏ không đều, có thành mỏng bắt màu hồng. (Chỉ có ở mẫu 3)
Ảnh chụp đặc điểm vi phẫu thân mẫu CT1, CT2, CT3 dưới KHV được trình bày ở hình 3.4.
- Đặc điểm vi phẫu rễ:
1. Bần: gồm hai hàng tế bào hình chữ nhật xếp sát nhau tạo thành vòng đồng tâm, dãy xuyên tâm, bắt màu xanh.
2. Mô mềm vỏ: gồm những tế bào hình trứng thành mỏng, có vài lớp tế bào nằm sau lớp bần, bắt màu hồng.
3-3’. Libe – gỗ: Libe phát triển mạnh, chiếm phần lớn rễ. Các mạch gỗ lớn nằm sát nhau. Libe ở ngoài, gỗ ở trong tạo thành đám xếp sít nhau.
4. Tia ruột: gồm những tế bào hàng dọc nằm ngăn cách giữa các bó libe – gỗ. Ảnh chụp đặc điểm vi phẫu rễ mẫu CT1, CT2, CT3 dưới KHV trình bày ở hình 3.5.
- Đặc điểm vi phẫu lá:
Phần gân giữa
1- 1’. Biểu bì trên và biểu bì dưới: Gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn bắt màu hồng.
2- 2’. Mô dày: gồm những tế bào có thành dày, bắt màu hồng đậm, xếp sít nhau thành đám ở chỗ lồi của gân chính.
3. Mô mềm: gồm những tế bào hình trứng, có thành mỏng, không đều, bắt màu hồng.
4-4’. Libe – gỗ: Gồm 1 bó libe-gỗ có hình cung, quay mặt lõm lên trên. Libe ở dưới dày hơn libe ở trên. Gỗ ở trong, libe ở ngoài.
5. Ống tiết tinh dầu: là những tế bào có thành tròn đều nằm rải rác trong phần mô mềm.
Phần phiến lá
6- 6’. Biểu bì trên và biểu bì dưới: Gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn bắt màu hồng.
7. Mô mềm: gồm những tế bào hình trứng, có thành mỏng, không đều, bắt màu hồng.
8- 8’. Bó libe – gỗ (có nếu phần phiến lá đó có gân phụ): có hình cung, quay mặt lõm lên trên. Gỗ ở trong, libe ở ngoài.
Ảnh chụp đặc điểm vi phẫu lá mẫu CT1, CT2, CT3 dưới KHV được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3.4: Ảnh chụp đặc điểm vi phẫu thân mẫu CT1, CT2, CT3 dưới KHV
7
1. Biểu bì 2. Mô dày góc 3. Mô mềm 4. Ống tiết 5 – 6: Libe – gỗ
Hình 3.5: Ảnh chụp đặc điểm vi phẫu rễ mẫu CT1, CT2, CT3 dưới KHV 1 2 4 3’ 3 1. Bần 2. Mô mềm vỏ 3-3’. Libe–gỗ 4. Tia ruột
Hình 3.6: Ảnh chụp đặc điểm vi phẫu lá mẫu CT1, CT2, CT3 dưới KHV 6 7 6’ 6’ 6 7 6’ 7 6 1;6: Biểu bì trên 1’;6’: Biểu bì dưới 2;2’:Mô dày 3;7: Mô mềm 4;8: Libe 4’;8’: Gỗ
Nhận xét: Vi phẫu thân, lá, rễ Cần tây tiến hành trên 3 mẫu thấy sự tương đồng của các đặc điểm. Riêng vi phẫu thân mẫu 3 có thêm mô mềm ruột có thể do khác nhau về thời điểm sinh trưởng (thời gian lấy mẫu khác nhau). Lúc đầu tế bào mô mềm ruột là các tế bào sống, sau đó có thể bị chết đi tạo thành một khoang rỗng giữa thân.
3.1.4. Định tính
Tiến hành: Cân 10g bột dược liệu Cần tây cho vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm khoảng 30 ml ethanol 90º, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng định tính sau:
• Định tính coumarin
- Phản ứng mở, đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết ethanol. Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%
Ống 2: Để nguyên
Đun cả 2 ống đến sôi, để nguội, quan sát thấy: Ống 1: Xuất hiện tủa vàng
Ống 2: Trong
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều rồi quan sát thấy Ống 1: Trong suốt
Ống 2: Có tủa đục
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 trở lại tủa đục như ống 2. Kết quả: Phản ứng dương tính (+).
- Quan sát hiện tượng huỳnh quang
Nhỏ 2-3 giọt dịch chiết ethanol lên một khoanh giấy thấm. Nhỏ 2-3 giọt dung dịch NaOH 5% lên vị trí có dịch chiết. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che. Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sáng dần lên, sau vài phút cả 2 phần đều phát quang như nhau.
Kết quả: Phản ứng dương tính (+) với cả 3 mẫu CT1, CT2, CT3. Kết luận: Trong dược liệu Cần tây có chứa coumarin.
• Định tính flavonoid
Phần dịch chiết ethanol còn lại đem cô tới cắn, thêm vào khoảng 10ml nước nóng rồi lọc nóng thu được dịch chiết nước. Cô dịch chiết nước tới cắn rồi thêm khoảng 10ml ethanol 90othu được dịch chiết cồn để làm phản ứng định tính flavonoid.
- Phản ứng Cyanidin: Cho 1ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi kim loại. Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt). Để yên một vài phút, dung dịch sẽ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam .
Kết quả: Phản ứng dương tính (+) với cả 3 mẫu CT1, CT2, CT3.
- Phản ứng với kiềm:
Phản ứng với NH3: Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết ethanol lên một mảnh giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên.
Kết quả: Phản ứng dương tính (+) với cả 3 mẫu CT1, CT2, CT3.
Phản ứng với dd NaOH: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện tủa vàng. Thêm 1 ml nước cất thấy tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng lên.
Kết quả: Phản ứng dương tính (+) với cả 3 mẫu CT1, CT2, CT3.
- Phản ứng với dd FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ethanol. Thêm vào 2-3 giọt dung dich Sắt (III) clorid 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen.
Kết quả: Phản ứng dương tính (+) với cả 3 mẫu CT1, CT2, CT3. Kết luận: Trong dược liệu Cần tây có flavonoid.
3.1.5. SKLM
- Bản mỏng: Silicagel F254 đã hoạt hóa ở 110ºC trong 1h
- Dung môi khai triển: Hệ I: Toluen – Ethyl acetat – Acid fomic (4:4:0,5) Hệ II: Toluen – Ethyl acetat – Acid fomic (5:4:1)
- Dung dịch thử: Cân khoảng 3g bột dược liệu, thêm 15ml ethanol tuyệt đối, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Bốc hơi dịch lọc còn khoảng 2ml, được dung dịch thử. - Dung dịch đối chiếu: 0,1 mg Apigenin chuẩn được hoà tan trong 1ml methanol, được dung dich chuẩn dùng để đối chiếu.
- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm. Hiện màu bằng hơi amoniac.
- Kết quả:
• Định tính DC dược liệu Cần tây bằng SKLM với hệ dung môi I được trình bày ở sắc ký đồ hình 3.7
• Định tính DC dược liệu Cần tây bằng SKLM với hệ dung môi II được trình bày ở sắc ký đồ hình 3.8
Hình 3.7: Ảnh chụp sắc ký đồ dịch chiết EtOH dược liệu Cần tây với hệ dung môi I
0 cm
3,40 cm 6,70 cm
Hình 3.8: Ảnh chụp sắc ký đồ dịch chiết EtOH dược liệu Cần tây với hệ dung môi II
Chú thích hình 3.7 và 3.8:
AST: Sắc ký đồ chụp ở ánh sáng thường UV254: Sắc ký đồ chụp ở UV254
UV356: Sắc ký đồ chụp ở UV356
NH3: Sắc ký đồ chụp sau khi hiện màu bằng hơi amoniac CH: Apigenin chuẩn
Nhận xét:
- Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại và sau khi hiện màu thấy, sắc ký đồ của dung dịch thử 3 mẫu CT1, CT2, CT3 tương tự nhau ở cả 2 hệ dung môi I, II và đều có vết cùng giá trị Rf = 0,51 với vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
- Hệ I tách tốt hơn hệ II.
Kết luận: Trong dịch chiết ethanol dược liệu Cần tây có Apigenin.
0 cm
3,35 cm 6,60 cm
3.1.6. Độ ẩm
* Nguyên tắc: Sấy dược liệu tới khối lượng không đổi ở 105o
C, Khối lượng mẫu thử mất đi là khối lượng nước.
Độ ẩm (X%) của dược liệu được tính theo công thức sau:
X% = P: Số gam của mẫu thử trước khi sấy
A: Số gam của mẫu thử sau khi sấy
* Tiến hành: Xác định độ ẩm dược liệu bằng máy xác định độ ẩm Sartorius. Dải một lượng dược liệu khoảng 1g thành một lớp mỏng trên đĩa cân của máy. Đậy nắp và đọc kết quả cuối cùng sau khi quá trình xác định độ ẩm kết thúc.
* Kết quả: Độ ẩm của 3 mẫu CT1, CT2, CT3 được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Độ ẩm trong 3 mẫu dược liệu Cần tây
CT1(%) CT2(%) CT3(%) Lần 1 8,74 9,21 8,58 Lần 2 8,90 8,65 8,36 Lần 3 8,78 9,88 8,69 Lần 4 9,48 9,23 8,13 Lần 5 8,54 8,94 8,12 Lần 6 8,72 9,59 8,34 TB=8,86 TB=9,25 TB=8,37 Trung bình 8,83 ± 1,09% (mức ý nghĩa α = 0,05)
- Đề nghị: Độ ẩm của dược liệu Cần tây không vượt quá 11%.
3.1.7. Tro toàn phần.
* Tiến hành: Cân chính xác 1g mẫu thử rải đều vào một chén sứ đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ 600o
C trong 4 giờ đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng ( đến khối lượng không đổi). Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô.
Tro toàn phần được tính theo công thức:
X= m1: Khối lượng dược liệu khô tuyệt đối. m2: Khối lượng tro
* Kết quả: Tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần trong các mẫu CT1, CT2, CT3 được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: Tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần trong các mẫu Cần tây
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
m1(g) m2(g) X(%) m1(g) m2(g) X(%) m1(g) m2(g) X(%) 1 0,9324 0,2234 23,96 0,9307 0,2251 24,19 0,9413 0,2200 23,37 2 0,9288 0,2188 23,56 0,9313 0,2301 24,71 0,9330 0,2095 22,45 3 0,9306 0,2270 24,39 0,9294 0,2341 25,19 0,9302 0,2176 23,39 4 0,9511 0,2328 24,48 0,9518 0,2290 24,06 0,9358 0,2133 22,79 5 0,9522 0,2292 24,07 0,9470 0,2245 23,71 0,9312 0,2244 24,10 6 0,9572 0,2381 24,87 0,9435 0,2309 24,47 0,9503 0,2328 24,50 TB=24,22 TB=24,39 TB=23,43 TB 24,01 ± 1,27% (mức ý nghĩa α = 0,05)
- Đề nghị: Tro toàn phần của dược liệu Cần tây không vượt quá 26%.
3.1.8. Xác định các chất chiết được bằng ethanol (phương pháp chiết nóng)
Cân chính xác khoảng 4,0000 g bột dược liệu có cỡ bột nửa thô cho vào bình nón 100 hoặc 250 ml. Thêm chính xác 50,0 ml cồn tuyệt đối, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1 giờ, sau đó đun sôi nhẹ dưới hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng cồn tuyết đối để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô, cắn thu được sấy ở 105 0
C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm
30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn. Tính phần trăm lượng chất chiết được bằng cồn tuyết đối theo dược liệu khô.
Phần trăm chất chiết được trong dược liệu bằng ethanol tính theo công thức: X(%) =
m1: Khối lượng dược liệu khô tuyệt đối. m2: Khối lượng chất chiết được.
* Kết quả: Phần trăm lượng chất chiết được trong 3 mẫu dược liệu CT1, CT2, CT3 được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3: Phần trăm lượng chất chiết được trong 3 mẫu dược liệu Cần tây
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
m1(g) m2(g) X(%) m1(g) m2(g) X(%) m1(g) m2(g) X(%) 1 3,5920 0,3764 10,48 3,7078 0,3010 8,12 3,6898 0,3384 9,18 2 3,5868 0,4224 11,78 3,7158 0,3494 9,40 3,6880 0,3690 10,00 3 3,5670 0,4218 11,82 3,7069 0,3522 9,50 3,6542 0,3658 10,02 4 3,5635 0,4210 11,82 3,7027 0,3464 9,36 3,6543 0,3566 9,76 5 3,5942 0,3844 10,70 3,7132 0,3892 1,48 3,6713 0,3646 9,94 6 3,5992 0,4322 12,00 3,7085 0,3720 10,04 3,6714 0,3290 8,96 TB = 11,44 TB = 9,48 TB = 9,64 TB 10,19 ± 2,70% (mức ý nghĩa α = 0,05)