S. aureus phân bố rộng rãi trong tự nhiên có nhiều trong các thực phẩm như: thịt, trứng, sữa... và trên da, tóc, lông của người và động vật.
S. aureus lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh, được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội vì nó có mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập.
Trên động vật, vi khuẩn hiện diện trên các sản phẩm động vật như thịt, sữa chưa được tiệt trùng (Werckenthin et al., 2001). Theo điều tra của El-jakee
et al. (2008), trong số 409 mẫu điều tra, chủng S. aureus hiện diện trên người 36%, trên chó 28%, bò 24%, thực phẩm 14,7% và trên gà 12%. Đối với gia cầm bệnh viêm khớp trên gà do S. aureus được phát hiện đầu tiên năm 1800 và gây thiệt hại đáng kể ở nhiều quốc gia trên thế giới. Những nghiên cứu gần đây của Lizeng (1997) và Skeeles (1998) cho thấy tỉ lệ viêm khớp do S. aureus trên đàn gà thịt là trên 3% tuy nhiên trong một số trường hợp có thể lên tới 20%. Mặt khác, theo Rasheed (2011) trong số 60 gà từ 30-55 ngày tuổi có triệu chứng viêm khớp, kết quả phân lập có 26 con (60%) có sự hiện diện của vi khuẩn S. aureus.
Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của S. aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dòng. S. aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7-480C, với nhiệt độ cực thuận là 30-450C; khoảng pH 4,2-9,3, với độ pH cực thuận là 7-7,5; và trong môi trường chứa trên 15% NaCl. Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%; nồng độ từ 33-35%, tụ cầu vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và
Salmonella bị ức chế. Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm. Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S. aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu nóng. S. aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài ký chủ. Vi khuẩn này có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn. Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 600C từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác ức chế (Bremer et al., 2004).
Có 10-50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S. aureus (Bremer et al., 2004). Tuy nhiên khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus cũng rất lớn do chúng phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố.
đoạn tiếp xúc trực tiếp với người. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus
trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc, nó chỉ xảy ra khi
S. aureus được phân lập tạo độc tố. Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ S. aureus tạo độc tố cũng có thể gây độc (Reginald et al., 2001).
2.3.4 Các yếu tố độc lực của S. aureus
S. aureus có thể phát triển gây bệnh lên đến 90% trên da, lông chó và một nghiên cứu khác về hệ vi sinh trên da và lông chó đã tìm ra S. aureus
(Krogh HV et al, 1976).
S. aureus là loại gây bệnh thường hay gặp nhất, nó có vai trò và ý nghĩa quan trọng đối với y học và thú y học. Khoảng 30% người khỏe mạnh mang S. aureus ở trên da và niêm mạc, khi có những tổn thương ở da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do S. aureus dễ dàng xuất hiện. Nó là nguyên nhân gây viêm xoang, viêm amygdale, viêm vú cho người (Trần Thị Phận, 2004).
S. aureus là vi khuẩn sinh mủ điển hình, có thể phân lập được từ phân heo, da, khoang miệng, hệ hô hấp trên, nếp gấp âm vật, âm đạo và ruột của heo khỏe. S. aureus truyền qua đường không khí, tiếp xúc, ăn uống. Giao phối có thể giúp S. aureus gây nhiễm trùng đường sinh dục. Viêm vú, viêm âm đạo, viêm tử cung và là hậu quả của nhiễm trùng diễn tiến. Sự sẩy thai có liên quan đến sự hiện diện kháng thể trong huyết thanh với chủng dung huyết alpha ở heo nái (Taylor, 1992).
S. aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ. Thường xảy ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh nhiễm nghiêm trọng như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim. S. aureus cũng là nguyên nhân chủ yếu của việc nhiễm trùng vết mổ. S. aureaus còn gây ngộ độc thực phẩm do tạo độc tố ruột enterotoxin trong thực phẩm (Kenneth Todar, 2005).
S. aureus tạo nhiều yếu tố độc lực:
- Protein bề mặt: thúc đẩy việc bám dính vào tế bào chủ. Ngoài ra, hầu hết các dòng đều tạo protein gắn kết fibrinogen và fibronetin làm kích thích sự kết dính các khối máu và mô bị chấn thương. Các protein gắn kết chất tạo keo cũng thường gặp ở những dòng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp.
- Yếu tố xâm lấn:
Hemolysin: α – toxin (α-hemolysin): đây là độc tố khử màng mạnh nhất của S. aureus. β–toxin: đây là một mạch enzyme phân hủy màng giàu lipid, γ- toxin: là một độc tố có peptide nhỏ, có thể phân hủy một số dạng tế bào khác nhau.
Leukocidin: độc tố này gây độc cho bạch cầu người và thỏ, không gây độc cho bạch cầu động vật khác, làm hoại tử da thỏ.
Hyaluronidase: làm giảm chất gian bào của tế bào chủ và có thể giúp tụ cầu lan rộng sang các vùng xung quanh.
Coagulase: coagulase là một enzyme ngoại bào sẽ gắn với prothrombin trong tế bào chủ hình thành phức hợp staphylothrombin. Coagulase là một chỉ thị thường dùng để phát hiện S. aureus ở các phòng thí nghiệm (Kenneth Todar, 2005).
Staphylokinase: đây là yếu tố phân giải fibrin. Một phức hợp sẽ được hình thành giữa staphylokinase và plasminogen kích hoạt hoạt tính phân giải protein giúp phân hủy fibrin.
- β-lactamase: enzyme này được biết đến như một độc tố giúp vi khuẩn kháng lại kháng sinh.
Một số enzyme: TNase: là enzyme kháng nhiệt, có khả năng hidro hóa DNA và RNA của tế bào chủ; DNase, protease, lipase: cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn; FAME: là enzyme rất quan trọng ở những chỗ bị áp xe, đó là nơi chúng có thể biến đổi những lipid kháng khuẩn và kéo dài sự sống của vi khuẩn.
Các loại độc tố khác nhau sẽ tác động và gây bệnh ở mức độ khác nhau. Liben et al. (2012), khi phân lập vi khuẩn S. aureus trên người và bò bị viêm vú với chủng S. aureus enterotoxin A liều gây chết 50% số động vật thí nghiệm là 2x109 cfu/ml.
Eunice (1983), liều gây chết 50% số động vật thí nghiệm khác nhau tùy theo nguồn gốc của chủng vi khuẩn và phụ thuộc vào loại độc tố.
S. aureus sinh ra những độc tố như: coagulase, hyaluronidase, hemolysine, leukocidine, exfoliatine. Năm độc tố ruột (Enterotoxin A, B, C, D, E) bền với nhiệt. Các độc tố này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm.
dựa vào tính kháng nguyên, 5 loại độc tố đầu tiên được tìm thấy đó là: độc tố A (SEA), độc tố B (SEB), độc tố C (SEC), độc tố D (SED) và độc tố E (SEE). Trong đó, SEC được chia thành SEC1, SEC2, SEC3. Sau đó, các độc tố SE mới cùng các gen tương ứng được tìm thấy và đánh dấu từ SEG đến SER và SEU (Jogensen, 2004).
Độc tố ruột enterotoxin (SE) của Staphyloccus aureus:
Staphylococcal enterotoxin (SE) là những chuỗi protein đơn có trọng lượng phân tử thấp, từ 25000-29000 dalton, mỗi chuỗi có những kháng nguyên chuyên biệt. Đặc điểm chính trong cấu trúc của độc tố là vòng cystein ở giữa phân tử. Vai trò của những vòng cystein chưa được biết rõ. Tuy nhiên, người ta chứng minh được chính những vòng cystein này giúp ổn định cấu trúc phân tử và có thể góp phần vào việc kháng sự phân giải protein. Theo sau vòng cystein là chuỗi acid amin cần thiết, ban đầu người ta nghĩ rằng trình tự này là vị trí hoạt động, nhưng những thí nghiệm thay thế amino acid vẫn chưa xác nhận được điều này.
SE là những protein đơn giản, hút ẩm, dễ tan trong nước và nước muối, là những protein cơ bản, độ đẳng điện pI là 7-8,6, trừ SEG và SEH có độ đẳng điện pI tuần tự là 5,6 và 5,7. Dù có một mức độ tương đồng giữa các SE, nhưng vẫn có sự khác nhau giữa các trình tự amino acid làm cho các độc tố có vị trí kháng nguyên khác nhau (Scott et al., 2000).
SE giàu lysine, acid aspartic, acid glutamic và tyrosine. Hầu hết có vòng cystine tạo cấu trúc thích hợp có thể liên quan đến hoạt tính gây nôn. Chúng có tính ổn định cao, kháng với hầu hết các enzyme phân hủy protein và vì thế chúng giữ được hoạt tính trong đường tiêu hóa sau khi được ăn vào bụng. Chúng còn kháng với chymotrypsin, rennin và papain (Yves Le Loir et al., 2003). Đặc biệt, tính bền nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnh vực an toàn thực phẩm. Chúng không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút (Trần Linh Thước, 2002), thậm chí ở 1210C trong 28 phút thì những SE vẫn giữ được hoạt tính sinh học (khi thí nghiệm trên mèo) (Naomi Balaban and Avraham Rasooly, 2000), tính kháng nhiệt của SE trong thực phẩm cao hơn so với trong môi trường nuôi cấy (Yves Le Loir et al.,
2.3.5 Đặc tính gây bệnh Trong tự nhiên Trong tự nhiên
Trong các loài vật, ngựa cảm nhiễm nhất rồi đến chó, bò, heo, cừu. Gia cầm có sức đề kháng cao với tụ cầu khuẩn (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977; Lưu Hữu Mãnh, 2010).
Tụ cầu ký sinh trên da, niêm mạc của người và gia súc. Khi sức đề kháng của cơ thể kém hoặc tổ chức bị tổn thương vi khuẩn sẽ xâm nhập và gây bệnh. Vi khuẩn có thể gây những ổ mủ ngoài da, niêm mạc. Một số trường hợp vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, huyết nhiễm mủ.
Ngoài ra, ở người còn thấy độc tố ruột do tụ cầu tiết ra gây nên nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997).
Trong phòng thí nghiệm
Thỏ cảm nhiễm nhất. Tiêm vào tĩnh mạch thỏ 1-2 ml canh khuẩn tụ cầu, sau 36-48 giờ thỏ chết vì chứng huyết nhiễm mủ. Mổ khám thấy nhiều ổ áp xe dưới da (Nguyễn Vĩnh Phước, 1997).
2.3.6 Tính kháng thuốc kháng sinh
Hầu hết các dòng S. aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Một vài dòng kháng với tất các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin và những dòng này ngày càng tăng. Những dòng MRSA (Meticillin resistant S. aureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh khác.
S. aureus kháng với penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase, một số còn kháng được methicillin (MRSA: methicillin resitant
S. aureus) do tạo ra một loại protein gắn vào thụ thể hoạt động của methicillin. Tỷ lệ S. aureus kháng methicillin lên trên 50%.
Theo Nguyễn Thanh Bảo (2003), Staphylococcus kháng với penicillins và cephalosporins nhờ tiết được men beta-lactamase, tính kháng thuốc được truyền bởi plasmid bằng cơ chế chuyển nạp hay giao phối. Kháng nafcillin, methicillin và oxacillin không phụ thuộc vào beta-lactamase, kháng thuốc do
Staphylococcus thiếu 1 loại PBP nên thuốc không gắn vào vi khuẩn được. Dung nạp: thuốc ức chế nhưng không giết được vi khuẩn. Plasmid cũng có thể mang nhiều gen kháng với tetracycline, erythromycin và aminoglycoside.
Theo Anakalo Shitandi and Milcah Wwangi (2004) S. aureus kháng thuốc cao với penicillin (89,4%), kế tiếp là tetracycline (82,4%),
trimethoprim-sulfamethazine (80,6%), chloramphenicol (64,8%), erythromycin (38,4%) và methicillin (35,9%).
Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S. aureus và được nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng hạn. Ngoài ra, S. aureus còn kháng với chất khử trùng và tẩy uế (Kenneth Todar, 2005).
Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn. Nhiều dòng hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường và sắp tới sẽ kháng cả kháng sinh mới. Thật sự là trong hai năm gần đây, việc thay thế kháng sinh cũ bằng vancomycin đã dẫn đến sự gia tăng các dòng kháng vancomycin VRSA (Vancomycin Resitant S. aureus) (Kenneth Todar, 2005).
Trong số 100 mẫu bệnh phẩm trên lâm sàng được phân lập có 48 chủng
S. aureus. Kết quả của kháng sinh đồ chỉ ra vi khuẩn đề kháng cao với penicillin 95,8%, ampicillin 89,6%, tetracycline 87,5% và 75% đối với chloramphenicol (Uwaezuoke et al., 2004).
Khảo sát sự đề kháng kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy đến 94,1% chủng kháng penicillin, 52,9% kháng ciprofoxacin, 52% kháng amoxicillin và 12,5% kháng gentamicin (Nguyễn Thị Kê và ctv., 2006).
CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
3.1.1 Thời gian
Từ 07/2013 đến 11/2013
3.1.2 Địa điểm
Địa điểm tiến hành thí nghiệm: phòng thí nghiệm Dược lý, Bộ môn Thý y thuộc khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng trường Đại học Cần Thơ.
3.2 Nội dung nghiên cứu
Điều chế cao thô từ lá Lược vàng.
Gây nhiễm chuột bạch với vi khuẩn S. aureus.
Điều trị bệnh chuột bạch bằng cao Lược vàng.
3.3 Phương tiện nghiên cứu
3.3.1 Nguyên liệu
Lá cây Lược vàng của dòng có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất theo Phan Thị Tư, (2013).
Vi khuẩn S. aureus 081008 có nguồn gốc từ Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.
Chuột bạch (Mus musculus domesticus) giống ddY (Nhật Bản) sạch bệnh, có trọng lượng từ 25-30 g (từ 6-8 tuần tuổi) có nguồn gốc từ Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh.
3.3.2 Dụng cụ, hóa chất chính
Autoclave, máy cô quay chân không, cân điện tử, ống kim tiêm, bình nón, đĩa petri, que cấy, phễu, ống nghiệm, ống đong, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, đèn cồn, giấy lọc…
Hóa chất: methanol, nước sinh lý, nước cất, dung môi DMSO, cồn 700, cồn 900, BaCl2.2H2O, H2SO4.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Chọn dòng và lấy mẫu Lược vàng:
Từ kết quả phân tích di truyền và thử hoạt tính kháng khuẩn các dòng cây Lược vàng của Phan Thị Tư, (2013), chúng tôi chọn dòng Lược vàng có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất trồng trong chậu, đất trồng là hỗn hợp giữa đất, xơ dừa, tro và trấu. Hàng ngày tưới nước một lần vào lúc sáng sớm.
Chọn những cây có ít nhất 9-10 đốt trở lên, lá có màu sậm. Lá Lược vàng làm thí nghiệm được hái vào buổi sáng (khoảng 8-10 giờ), rửa loại sạch đất, những dược liệu bị sâu, nấm ký sinh và loại những tạp chất khác (Nguyễn Văn Đàn và ctv., 1985).
3.4.2 Điều chế cao thô
Ngâm mẫu Lược vàng đã được sấy khô (nhiệt độ 500C) trong methanol (tỷ lệ mẫu và methanol là 1:1) 3 ngày, sau đó chiết lấy dịch chiết riêng và tiếp tục ngâm với methanol lần 2 (tỷ lệ mẫu và methanol là 1:1), chiết lần 3 (tỷ lệ mẫu và methanol là 1:1) (24 giờ/lần). Loại bỏ dung môi trong các dịch chiết và cô đặc các dịch chiết đó bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 400C cho đến cắn, thu được cao sử dụng trong thí nghiệm (Nguyễn Văn Đàn và ctv.,
1985).
- Methanol - 24 giờ/lần - Lọc Dịch chiết (lần 1, trữ) Mẫu đã loại dịch chiết (lần 1) - Sấy 40 – 500C - Nghiền nhỏ - 72 giờ/lần - Lọc - Methanol - 24 giờ/lần - Lọc Mẫu tươi
Chiết với Methanol 100% (lần 1) Dịch chiết (lần 2, trữ) Mẫu đã loại dịch chiết (lần 2) (lần 2) Dịch chiết (lần 3, trữ) Mẫu đã loại dịch chiết (lần 3), loại bỏ Cô quay Cao thô
3.4.3 Nuôi chuột
Chuột bạch sau khi được mua về từ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh được nuôi trong hộp nhựa hình chữ nhật có kích thước 30x15x10 cm và được đâm thủng nhiều lỗ cho thông thoáng. Mỗi hộp sẽ có thức ăn và nước uống riêng, phía dưới đáy mỗi hộp sẽ được lót một lớp trấu. Chuột nuôi được cho ăn thức ăn dành riêng cho chuột (được mua từ Viện Pasteur) với khẩu