2.4.6.1 Sơ đồ thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn trên cá
Hinh 2.5. Sơ đồ cảm nhiễm lại vi khuẩn gây bệnh cho cá rô phi
Cá khỏe 80- 100gram khỏe mạnh, không bị thương, bắt mồi tốt
Hình 2.6. Thí nghiệm cảm nhiễm lại cá ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau
NT1: 103 TB/con (10 con) NT2:104 TB/con ((10 con) NT3:105 TB/con (10 con) NT4:106 TB/con (10 con) NT5: đối chứng (10 con) NaCl 0,85% Các chủng vi khuẩn thuần phân lập được
Tăng sinh trên môi trường BHI
Gây nhiễm trên cá khỏe
Phân lập, định danh lại vi khuẩn trên cá có dấu hiệu điển hình bệnh
Tiến hành cảm nhiễm nhân tạo bằng vi khuẩn đã phân lập được trên đối tượng cá khỏe theo thuyết Kock. Thí nghiệm được bố trí trong phòng thí nghiệm ướt có điều khiện được lượng nước và nhiệt độ. Các bước tiến hành bao gồm:
2.4.6.2 Các bước tiến hành xác định độc lực của vi khuẩn
- Nuôi cấy tăng sinh dòng vi khuẩn đã phân lập, chọn lọc trên môi trường BHI lỏng ở 30oC trong vòng 24 giờ theo phương pháp của Hernandez và ctv., 2009.
- Định lượng vi khuẩn ở các nồng độ bằng phương pháp đếm ở buồng đếm hồng cầu, kết hợp với phương pháp xác định mật độ vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFland. Các nồng độ vi khuẩn được xác định lại bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên bề mặt thạch.
- Thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện 5 lô ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau (Lô thí nghiệm bao gồm 4 thí nghiệm từ các nồng độ vi khuẩn 103, 104, 105, 106 tương đương với độ pha loãng cơ số 10 là 10-5, 10-4, 10-3, 10-2 cfu/ml) và lô đối chứng là nước muối sinh lý NaCl 0,85%).
- Tiến hành theo dõi, quan sát, thu thập số liệu và kết thúc thí nghiệm sau khi cá ngừng chết 3 ngày liên tục, thời gian kết thúc thí nghiệm trong vòng 4 tuần.
- Tiến hành phân lập lại vi khuẩn từ các cá thể cá có dấu hiệu bệnh điển hình (phân lập từ tổ chức gan, thận, não, mắt) trên môi trường TSA kiểm tra hình thái vi khuẩn, thử phản ứng sinh hóa và test API20 Strep để khẳng định cá bị bệnh do vi khuẩn cảm nhiễm gây ra theo sơ đồ trên, đọc kết quả như Bảng 2.2.
2.4.6.3 Phương pháp đo độ đục của vi khuẩn
Đo độ đục của vi khuẩn bằng 2 phương pháp đếm mật độ vi khuẩn bằng cách chang trên đĩa thạch BHIA và đo độ đục bằng thang chuẩn McFland, để so sánh 2 phương pháp này.
Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch.
- Pha loãng dịch huyền phù tế bào theo cơ số 10 thành các nồng độ: 10-2, 10-3, 10- 4, 10-5, 10-6... tiến hành cấy mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào các đĩa petri (mỗi nồng độ cấy lặp lại 3 lần)
- Đặt đĩa thạch cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ.
- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 1 ml mẫu theo công thưc:
Trong đó Ai: số khuẩn lạc trung bình/đĩa Di : độ pha loãng
V: dung dịch tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml) Phương pháp đo độ đục theo thang chuẩn McFland.
Bảng 2.4. Dải cho phép của độ đục McFland
Nồng độ VK (cfu/ml) 103 104 105 106
Dải cho phép 1.56-1.63 1.67-1.78 1.85-2.15 2.79-3.21
2.4.6.4 Chuẩn bị huyền phù dung dịch vi khuẩn để cảm nhiễm cá
Vi khuẩn sau khi tăng sinh trên môi trường lỏng BHI, lấy những khuẩn lạc riêng rẽ pha loãng bởi nước muối sinh lý 0,85% đem mang đi chuẩn độ đục McFland. Các nồng độ tiếp theo pha loãng cơ số 10. Hoặc đem chang trên thạch BHIA để đếm khuẩn lạc vi khuẩn.
2.4.6.5 Tiến hành cảm nhiễm trên cá
- Địa điểm lấy cá cảm nhiễm: Trại cá giống Hoa động, Thủy Nguyên, Hải Phòng. - Cá thí nghiệm có trọng lượng từ 80 - 100gram/con, khỏe mạnh, không có dấu hiệu bị bệnh, bắt mồi tốt, được nuôi giữ trong điều kiện phù hợp. Nuôi thuần dưỡng trước khi cảm nhiễm 01 tuần và cho ăn 5% khối lượng cá/ngày. Cá được bố trí ngẫu nhiên 10 con/lô
- Lô thí nghiệm có thể tích 200l. Thí nghiệm gồm 5 lô (4 thí nghiệm và 1 lô chứng). Các lô thí gây cảm nhiễm với mật độ vi khuẩn 103,104, 105, 106 cfu/ml hay tương đương với liều vi khuẩn được đưa vào cơ thể cá lần lượt là 102, 103, 104, 105 TB/cá thể). Nước được lấy vào 150lít/lô sục khí 3 ngày liên tục để loại hết chlorin trong nước.
- Liều tiêm: 0,1 ml/con vào các cá thí nghiệm ở các lô thí nghiệm. Lô đối chứng được tiêm 0,1 ml nước muối sinh lý tiệt trùng 0,85%.
- Vị trí tiêm: Gây bệnh nhân tạo bằng phương pháp tiêm các nồng độ vi khuẩn vào xoang bụng cá sau khi cá được gây mê bằng MS 222 với nồng độ 50-75ppm.
- Thời gian kết thúc thí nghiệm: Theo dõi liên tục trong 12 ngày: Quan sát hoạt động của cá, số lượng cá chết.