Kháng thuốc kháng sinh là một vấn đề nan giải, hiện đang là mối quan tâm của cộng đồng bởi nó gây ra những dòng khuẩn khỏe hơn, nguy hiểm hơn làm cho dịch bệnh lây lan nhanh hơn, khó chữa trị hơn và gây tốn kém, đặc biệt là cho người già, trẻ em và những người có sức khỏe hệ miễn dịch yếu làm tăng rủi ro khuyết tật, tử vong.
Trong số các bệnh của thuỷ sản thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây ra với những vụ dịch bệnh có qui mô lớn. Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh. Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc (antibiotic resistence) và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản. Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là việc sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của thuỷ sản như một chất kích thích sinh trưởng [7].
Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác động của các loại kháng sinh. Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi sinh vật tạo ra kháng sinh (antibiotic - producing -bacteria) nhằm bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng sinh này. Những gen này có thể được hình thành trong các loài vi khuẩn khác thông qua sự trao đổi gen với một vi khuẩn tạo ra kháng sinh, do vậy chúng có khả năng tạo ra cơ chế làm trung hoà hoặc phá huỷ các loại thuốc kháng sinh [3].
Trong một nghiên cứu phỏng vấn được thực hiện ở Thái Lan năm 2000 cho thấy 20% số người nuôi tôm được phỏng vấn đã sử dụng thuốc kháng sinh để chống lại các bệnh về virút. Thêm vào đó, hơn 60% các trại đã sử dụng kháng sinh để phòng bệnh. Các kết quả nghiên cứu này đã cho thấy rằng có một sự sử dụng sai rộng rãi các loại thuốc kháng sinh. Nhưng nó cũng chỉ ra rằng việc sử dụng này có thể giảm, theo những chỉ dẫn đã nêu trên mà không ảnh hưởng xấu tới sản lượng tôm nuôi. Một vấn đề lớn còn lại cần phải giải quyết là các nhà sản xuất và người bán lẻ các sản phẩm kháng sinh thường không chú ý tới việc cung cấp cho người nuôi tôm những thông tin chính xác về những sản phẩm của họ [10].
Khi vấn đề sử dụng kháng sinh tăng lên theo cấp số cộng, đồng thời dư lượng kháng sinh trong thủy sản xuất khẩu trở nên bức xúc. Hơn thế, để nâng cao chất lượng sản phẩm thủy sản đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của người dân cũng như nhu cầu của các nước nhập khẩu. Chính phủ và Bộ NN&PTNT đã có nhiều biện pháp ngăn ngừa việc sử dụng kháng sinh cấm. Ngày 25 tháng 2 năm 2014, Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn đã đưa văn bản hợp nhất số 08/VBHN-BNNPTNT: Ban hành Danh mục thuốc, hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng (Phụ lục 1) và (Phụ lục 2).
Song song với vấn đề dư lượng thuốc trong sản phẩm thủy sản thì vấn đề kháng thuốc của vi khuẩn đã được đề cập và quan tâm. Một trong số những nguyên nhân gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh là do nguyên nhân sử dụng thuốc có tính chất lạm dụng thuốc, dùng không đúng liều lượng, dùng một cách tràn lan.
Vì thế khi sử dụng thuốc kháng sinh trong thủy sản cần phải thận trọng, chính xác và tuân theo những nguyên tắc dưới đây:
- Thật hạn chế khi sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng trị bệnh thủy sản để tránh ảnh hưởng đến người tiêu thụ sản phẩm và thuốc sử dụng phải được luật pháp của các nước cho phép sử dụng.
- Chọn lựa và sử dụng đúng loại thuốc kháng sinh: kháng sinh sử dụng phải nằm trong danh mục cho phép sử dụng. Tránh sử dụng những kháng sinh được dùng điều trị bệnh cho người để hạn chế hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc. Nếu sử dụng những kháng sinh này thì dư lượng (MRL) không được phép hiện diện trong sản phẩm.
- Chỉ sử dụng kháng sinh cho bệnh nhiễm khuẩn ở ĐVTS.
- Không nên sử dụng kháng sinh để phòng bệnh, chỉ nên dung để trị bệnh – khi có dịch bùng phát. Khi dùng kháng sinh liều thấp, kéo dài lien tục có thể ảnh hưởng đến sức khỏe động vật nuôi và nguy cơ gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn.
- Không nên sử dụng kháng sinh của người, thú y để trị bệnh cho động vật thủy sản. - Phải dùng đúng nồng độ, thời gian chỉ dẫn của nhà sản xuất. Theo nguyên tắc thì dùng kháng sinh tối thiểu từ 3-5 ngày. Nếu có thể thì nên phối hợp kháng sinh để tăng hiệu quả của việc sử dụng điều trị bệnh.
- Chấm dứt dùng kháng sinh 14 ngày trước khi thu hoạch để giảm tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản.
- Việc sử dụng kháng sinh trong NTTS thường gây tốn kém, gặp nhiều khó khăn lớn khi sử dụng và hiệu quả không cao. Vì thế thật cần thiết mới sử dụng kháng sinh.
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Chủng Streptococcus spp. gây bệnh cá rô phi nuôi tại Hải Phòng
- Thời gian nghiên cứu: 01/2013 - 08/2014 - Địa điểm nghiên cứu:
+ Phòng Lab – Cơ quan thú y Vùng II – Cục thú y (số 23 Đà Nẵng – Ngô Quyền – Hải Phòng).
+ Phòng Lab – Trường Trung cấp nghề thủy sản Hải Phòng (số 10 Đà Nẵng – Ngô Quyền – Hải Phòng).
2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung phương pháp nghiên cứu.
Thu mẫu cá bệnh tại hiện trường và nhận mẫu tại phòng Lab Điều tra tình hình dịch bệnh và sử dụng kháng sinh trên cá rô
phi tại Hải Phòng
Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi
Thử kháng sinh đồ xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh
Kết luận và đề xuất ý kiến
Tái cảm nhiễm lại vi khuẩn gây bệnh trên cá
2.3 Vật liệu nghiên cứu
2.3.1 Dụng cụ, các thiết bị phục vụ nghiên cứu.
Dụng cụ:
- Dụng cụ thu mẫu: Bông thấm cồn, túi PE đã tiệt trùng, bộ giải phẫu (pank, kéo, dao, rùi…), thùng bảo ôn bảo quản mẫu, đồ bảo hộ cá nhân…
- Dụng cụ dùng để phân tích và nghiên cứu vi khuẩn: ống nghiệm, đĩa pertri, đèn cồn, ống eppenrtdoft, que cấy, dụng cụ nhuộm Gram…..
- Dụng cụ dùng để chế vi khuẩn gây cảm nhiễm lại: Kim tiêm, lam kính, ống eppendort, băng dính…
Thiết bị:
- Nồi khử hấp trùng - Kính hiển vi
- Tủ ấm - Cân điện tử
- Máy Vortex - Pipet tự động
- Tủ lạnh - Máy Vitek 2 Compart
- Máy lắc ổn nhiệt - Máy vi tính
- Máy li tâm - Máy đo các thông só pH, to, DO
- Buồng an toàn sinh học cấp 2 - Buồng đếm hồng cầu
- Máy khuấy từ - Máy đo độ đục
- Bể nuôi cá - Sục khí
2.3.2 Môi trường, hóa chất phục vụ nghiên cứu
Môi trường.
- Môi trường dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Brain heart infusion broth (BHI, Merk), Brain heart infusion agar (BHIA, Merk), hoặc Trip soy agar (TSA, Merk), thạch máu Blood agar, columbia agar.
- Môi trường tăng sinh vi khuẩn: Brain heart infusion broth (BHI, Merk). - Môi trường dùng để pha loãng vi khuẩn: Nước muối sinh lý 0.85%. Hóa chất:
- Bộ thuốc nhuộm Gram - H2O2, NaOH, HCL, cồn
- Các hóa chất dùng cho làm kháng sinh đồ - Kit API 20Strep (BioMereux, Pháp)
2.3.3 Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu vi khuẩn Streptococcus spp.phân lập từ cá Rô phi có dấu hiệu bị bệnh với dấu hiệu bơi lờ đờ, mất định hướng, trướng bụng, xuất huyết, lồi mắt, sưng ruột, cơ quan nội tạng như gan, lách, thận, gan bị xuất huyết, sưng to tại 3 huyện Thủy Nguyên, Tiên Lãng, Vĩnh Bảo của Hải Phòng.
- Cá thí nghiệm dùng để phân lập vi khuẩn sau khi cảm nhiễm vi khuẩn
Streptococcus spp phân lập được.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Điều tra tình hình bệnh và sử dụng kháng sinh trong nuôi cá rô phi tại Hải Phòng Phòng
(Biểu mẫu điều tra: Phụ lục số 03)
Tại Hải Phòng, một số vùng nuôi cá rô phi như huyện Thủy Nguyên, Tiên Lãng, Vĩnh Bảo. Tại mỗi huyện sẽ điều tra 30 hộ gia đình nuôi cá rô phi và việc sử dụng thuốc kháng sinh trong khi nuôi.
Bảng 2.1. Số phiếu điều tra tình hình dịch bệnh và sử dụng thuốc kháng sinh trên cá rô phi nuôi tại Hải Phòng
Số phiếu điều tra
Thủy nguyên 30
Vĩnh Bảo 30
Tiên Lãng 30
2.4.2 Phương pháp thu mẫu cá bệnh
- Một số mẫu cá rô phi bệnh tại 3 huyện: Thủy Nguyên, Vĩnh Bảo, Tiên Lẵng được Chi cục thú y tỉnh Hải Phòng gửi tới phòng Lab – Cơ quan thú y Vùng II. Một số mẫu cá rô phi bệnh có dấu hiệu điển hình do tác nhân Streptococcus spp.được thu trực tiếp trong quá trình điều tra.
- Mẫu cá bệnh được đựng trong túi nilon có đá viên để bảo quản, tất cả các mẫu đều được gửi tới phòng lab trong vòng 12 giờ từ khi bắt đầu thu mẫu. Trong trường hợp không gửi được đến phòng thí nghiệm, mẫu cá được cấy vi khuẩn trực tiếp tại hiện trường.
- Nguyên tắc thu mẫu cá bệnh như sau:
+ Phải kiểm tra ngay khi cá được vớt lên khỏi mặt nước các biểu hiện bệnh tích bên ngoài, dùng găng tay thu mẫu cá bệnh vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong thời gian gần nhất (<12 giờ).
+ Cá bệnh là những con cá có dấu hiệu điển hình như bơi lội bất thường, mắt lồi hoặc nổ mắt, xuất huyết da, gốc vây, mang, dịch cổ trướng, cá còn sống hoặc mới chết.
+ Cơ quan để sử dụng nuôi cấy vi khuẩn bao gồm: gan, thận, não và mắt cá.
Hình 2.2. Cá rô phi có dấu hiệu bệnh Streptoccocus spp. A: Cá bơi lội bất thường
B: Mắt cá rô phi bị lồi lên, xuất huyết gốc
2.4.3 Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng
Cơ quan để nuôi cấy phân lập vi khuẩn bao gồm: thận, lách, não, gan, mắt cá. Phương pháp mổ cá lấy nội tạng: cá được mổ bằng ba đường cắt (như hình vẽ)
Hình 2.3. Cách mổ khám bụng cá
- Đường thứ nhất: bắt đầu từ trước hậu môn, theo đường rãnh bụng cho đến phần đầu, dừng trước nắp mang.
- Đường thứ 2: bắt đầu từ lỗ hậu môn, chạy dọc lên phía trên, dọc theo thành ngực đến phần mang cá.
- Đường thứ 3: nối 2 đường thứ nhất và đường thứ hai lại.
Phương pháp mổ sọ não cá: sát trùng mặt ngoài của vùng da phần sọ não cá bằng
cồn 70oC. Sau đó cắt 4 đường cắt, mỗi đường cắt khoảng 0,5 – 1 cm sao cho lộ phận sọ não ra ngoài ( như hình vẽ).
Hình 2.4. Cách mổ sọ não cá
2.4.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn Streptoccoccus spp. từ mẫu cá bệnh phẩm
Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Streptoccoccus spp. gây bệnh trên cá rô phi theo phương pháp của Frerich G.N.(1993), thử các đặc tính sinh hóa bằng test API20Step hoặc trên card Gram dương định danh Strep trên máy Vitek 2.4.
Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Streptoccoccus spp. trên môi trường TSA, môi trường đặc trưng Columbiaagar có bổ sung 5% máu cừu, các chủng vi khuẩn phân lập được giữ bảo quản trong môi trường (BHI, Merck) có chứa 25% glycerol.
Các thao tác phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Làm thuần vi khuẩn: dùng que cấy lấy vi khuẩn cấy lên môi trường TSA đem ủ ở 28oC – 30oC trong 18-24 giờ kết quả.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm có chứa 10ml BHI, đặt vào tủ ấm 30oC trong 24 - 32 giờ kiểm tra.
Mỗi chỉ tiêu sinh hóa được lặp lại 3 lần.
2.4.5 Phương pháp định danh vi khuẩn Streptococcus spp.
Định danh vi khuẩn Streptococcus spp.trên máy Vitek 2.4 và test định danh API Strep (BioMerieux, Pháp).
Hình dạng, kích thước của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram. Các đặc tính sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang của Cowan và Steels (Barrow và Feltham, 1993).
2.4.5.1 Xác định các chỉ tiêu cơ bản.
(Theo cẩm nang Cowan và Steels (Barrow và Feltham, 1993)). Quan sát tính di động.
- Tiến hành thử nghiệm trên môi trường thạch bán lỏng, nhằm xác định khả năng tính di động của vi khuẩn trên môi trưởng thạch nghiêng BHIA (Brain heart infusion agar).
- Kết quả:
+ Vi khuẩn di động: sẽ phát triển lan trên bề mặt nuôi cấy. + Vi khuẩn không di động: sẽ phát triển quanh đường ria cấy Nhuộm Gram.
- Từ đĩa thạch cấy vi khuẩn đã được làm thuần, chọn những khuẩn lạc rời đã ủ nuôi cấy 24-48h tiến hành nhuộm Gram.
- Quan sát trên kính hiển vi.
+ Vi khuẩn bắt màu tím đỏ : Vi khuẩn G+ + Vi khuẩn bắt màu hồng: Vi khuẩn G- Phản ứng oxidase.
- Phản ứng này nhằm xác định sự hiện diện của enzyme oxidase. - Kết quả:
+ Sau 10 giây vết bôi vi khuẩn chuyển sang màu tím đen: phản ứng oxidase cho kết quả dương tính
+ Sau 60 giây mới chuyển màu: Phản ứng oxidase cho kết quả âm tính
Kiểm tra sự dung huyết của vi khuẩn Streptoccocus spp.trên môi trường thạch máu. - Chọn vi khuẩn rời rạc trên môi trường TSA được nuôi cấy sau 24-48h ria cấy trên môi trường thạch máu (Blood agar) có bổ sung 5% máu thỏ, sau đó ủ nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC/24h-48h đọc kết quả.
- Kết quả:
Dung huyết (tiêu huyết) dạng : khuẩn lạc được bao quanh bằng một vòng màu xanh nhạt tương đối hẹp (1-2mm). Đây là hiện tượng tiêu huyết không hoàn toàn, chỉ có một phần hồng cầu bị tan.
+ Dung huyết (tiêu huyết) dạng: xung quanh nhóm vi khuẩn này là một vòng trong suốt 2-4mm. Đây là hiện tượng tiêu huyết hoàn toàn, không còn hồng cầu ở xung quanh khúm.
+ Dung huyết (tiêu huyết) dạng : màu thạch xung quanh khúm vi khuẩn vẫn còn nguyên vẹn. Trong trường hợp này hồng cầu không bị tiêu huyết.
2.4.5.2 Định danh bằng bộ kít API 20Strep (Biomériuex).
- Các chỉ tiêu cơ bản (hình dạng, khả năng di động, oxidase, catalase, khả năng dung huyết trên thạch máu) được thược hiện trước khi sử dụng bộ kit API 20Strep.
- Bộ kít gồm 20 giếng:
+ 9 giếng nhỏ: VP, HIP, ESC, PYRA, GUR, GAL, PAL, LAP.
+ 11 giếng lớn: ADH, RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD, GLYG.
- Nguyên lý: Phương pháp này cho phép định tên một số loài liên cầu và vi khuẩn đường ruột. Kit API 20Strep gồm các ống nghiệm nhỏ, bên trong có chứ các chất nền đã được khử trùng để thực hiện các phản ứng sinh hóa. Trong quá trình ủ, hoạt động của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục môi trường. Đọc kết quả sau 4h, 24h bằng cách quan sát các phản ứng chuyển màu khi tiếp xúc với những thuốc thử, đối chiếu với bảng kết quả chuẩn của bộ kit để định danh bằng phần mềm:
http://apiweb.biomerieux.com.
- Các bước tiến hành: các bước tiến hành thực hiện theo chỉ dẫn của hãng sản xuất của bộ kít API20 Strep (Biomerieux).
+ Cho 5 ml nước muối sinh lý vào trong khay để giữ ẩm trong suốt quá trình ủ thực hiện phản ứng sinh hóa
+ Tạo huyền phù: lấy 1 khuẩn lạc đã được nuôi cấy sau 24h (36±2oC) phân lập vào 0,3ml nước muối sinh lý để tạo huyền phù có độ đục ≥ 4mFc.
Bước 2: Thực hiện các phản ứng sinh hóa trên các giêng của bộ kit.
+ Hút 100µl huyền phù cho vào các giếng từ VP – LAP. Riêng giếng ADH cho đầy miệng giếng.
+ Hút 0,5 ml huyền phù vào ống API GP medium, sau đó hút cho đầy vào miệng các giếng từ RIB – GLYG.
+ Cho paraffin vô trùng vào các giếng từ giếng ADH – GLYG. + Đậy khay lại đem ủ bộ test định danh ở tủ ấm 30oC.