Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Streptoccoccus spp. gây bệnh trên cá rô phi theo phương pháp của Frerich G.N.(1993), thử các đặc tính sinh hóa bằng test API20Step hoặc trên card Gram dương định danh Strep trên máy Vitek 2.4.
Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Streptoccoccus spp. trên môi trường TSA, môi trường đặc trưng Columbiaagar có bổ sung 5% máu cừu, các chủng vi khuẩn phân lập được giữ bảo quản trong môi trường (BHI, Merck) có chứa 25% glycerol.
Các thao tác phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Làm thuần vi khuẩn: dùng que cấy lấy vi khuẩn cấy lên môi trường TSA đem ủ ở 28oC – 30oC trong 18-24 giờ kết quả.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm có chứa 10ml BHI, đặt vào tủ ấm 30oC trong 24 - 32 giờ kiểm tra.
Mỗi chỉ tiêu sinh hóa được lặp lại 3 lần.
2.4.5 Phương pháp định danh vi khuẩn Streptococcus spp.
Định danh vi khuẩn Streptococcus spp.trên máy Vitek 2.4 và test định danh API Strep (BioMerieux, Pháp).
Hình dạng, kích thước của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram. Các đặc tính sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang của Cowan và Steels (Barrow và Feltham, 1993).
2.4.5.1 Xác định các chỉ tiêu cơ bản.
(Theo cẩm nang Cowan và Steels (Barrow và Feltham, 1993)). Quan sát tính di động.
- Tiến hành thử nghiệm trên môi trường thạch bán lỏng, nhằm xác định khả năng tính di động của vi khuẩn trên môi trưởng thạch nghiêng BHIA (Brain heart infusion agar).
- Kết quả:
+ Vi khuẩn di động: sẽ phát triển lan trên bề mặt nuôi cấy. + Vi khuẩn không di động: sẽ phát triển quanh đường ria cấy Nhuộm Gram.
- Từ đĩa thạch cấy vi khuẩn đã được làm thuần, chọn những khuẩn lạc rời đã ủ nuôi cấy 24-48h tiến hành nhuộm Gram.
- Quan sát trên kính hiển vi.
+ Vi khuẩn bắt màu tím đỏ : Vi khuẩn G+ + Vi khuẩn bắt màu hồng: Vi khuẩn G- Phản ứng oxidase.
- Phản ứng này nhằm xác định sự hiện diện của enzyme oxidase. - Kết quả:
+ Sau 10 giây vết bôi vi khuẩn chuyển sang màu tím đen: phản ứng oxidase cho kết quả dương tính
+ Sau 60 giây mới chuyển màu: Phản ứng oxidase cho kết quả âm tính
Kiểm tra sự dung huyết của vi khuẩn Streptoccocus spp.trên môi trường thạch máu. - Chọn vi khuẩn rời rạc trên môi trường TSA được nuôi cấy sau 24-48h ria cấy trên môi trường thạch máu (Blood agar) có bổ sung 5% máu thỏ, sau đó ủ nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC/24h-48h đọc kết quả.
- Kết quả:
Dung huyết (tiêu huyết) dạng : khuẩn lạc được bao quanh bằng một vòng màu xanh nhạt tương đối hẹp (1-2mm). Đây là hiện tượng tiêu huyết không hoàn toàn, chỉ có một phần hồng cầu bị tan.
+ Dung huyết (tiêu huyết) dạng: xung quanh nhóm vi khuẩn này là một vòng trong suốt 2-4mm. Đây là hiện tượng tiêu huyết hoàn toàn, không còn hồng cầu ở xung quanh khúm.
+ Dung huyết (tiêu huyết) dạng : màu thạch xung quanh khúm vi khuẩn vẫn còn nguyên vẹn. Trong trường hợp này hồng cầu không bị tiêu huyết.
2.4.5.2 Định danh bằng bộ kít API 20Strep (Biomériuex).
- Các chỉ tiêu cơ bản (hình dạng, khả năng di động, oxidase, catalase, khả năng dung huyết trên thạch máu) được thược hiện trước khi sử dụng bộ kit API 20Strep.
- Bộ kít gồm 20 giếng:
+ 9 giếng nhỏ: VP, HIP, ESC, PYRA, GUR, GAL, PAL, LAP.
+ 11 giếng lớn: ADH, RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD, GLYG.
- Nguyên lý: Phương pháp này cho phép định tên một số loài liên cầu và vi khuẩn đường ruột. Kit API 20Strep gồm các ống nghiệm nhỏ, bên trong có chứ các chất nền đã được khử trùng để thực hiện các phản ứng sinh hóa. Trong quá trình ủ, hoạt động của vi khuẩn sẽ làm chuyển màu hoặc làm đục môi trường. Đọc kết quả sau 4h, 24h bằng cách quan sát các phản ứng chuyển màu khi tiếp xúc với những thuốc thử, đối chiếu với bảng kết quả chuẩn của bộ kit để định danh bằng phần mềm:
http://apiweb.biomerieux.com.
- Các bước tiến hành: các bước tiến hành thực hiện theo chỉ dẫn của hãng sản xuất của bộ kít API20 Strep (Biomerieux).
+ Cho 5 ml nước muối sinh lý vào trong khay để giữ ẩm trong suốt quá trình ủ thực hiện phản ứng sinh hóa
+ Tạo huyền phù: lấy 1 khuẩn lạc đã được nuôi cấy sau 24h (36±2oC) phân lập vào 0,3ml nước muối sinh lý để tạo huyền phù có độ đục ≥ 4mFc.
Bước 2: Thực hiện các phản ứng sinh hóa trên các giêng của bộ kit.
+ Hút 100µl huyền phù cho vào các giếng từ VP – LAP. Riêng giếng ADH cho đầy miệng giếng.
+ Hút 0,5 ml huyền phù vào ống API GP medium, sau đó hút cho đầy vào miệng các giếng từ RIB – GLYG.
+ Cho paraffin vô trùng vào các giếng từ giếng ADH – GLYG. + Đậy khay lại đem ủ bộ test định danh ở tủ ấm 30oC.
Bước 3: Đọc kết quả và thêm hóa chất cho các phản ứng
+ Sau 4h đem khay API đọc kết quả và nhỏ thêm hóa chất vào các giếng. + Giếng VP: nhỏ 1 giọt VP1, VP2.
+ Giếng HIP: nhỏ 2 giọt NIN.
+ Giếng PYRG, GUR, GAL, PAL, LAP: nhỏ 1 giọt ZYMA, ZYMB
+ 10 phút sau đọc kết quả lần 1 và sau đó đem ủ khay định danh trong 24h/30oC để đọc kết quả lần 2.
Bảng 2.2. Thuốc thử và cách đọc kết quả các phản ứng sinh hóa API 20 Strep Test Kết quả Âm tính (-) Dương dính (+) VP VP1+VP2/đợt 10 phút Không màu Đỏ hồng HIP NIN/đợi 10 phút
Không màu/xanh nhạt/xám nhạt Xanh sẫm/tím
ESC 4 giờ 24 giờ 4 giờ 24 giờ
Không màu/vàng Không màu/vàng Đen xám/đen Đen
PYRA ZYMA+ZYMB/đợi 10 phút ( PYRA đến LAP)
Không màu/cam rất nhạt Cam
GAL Không màu Tím
GUR Không màu Xanh
GAL Không màu/tím rất nhạt Tím
PAL Không màu/tím rất nhạt Tím
LAP Không màu Cam
ADH Vàng Đỏ
RIB 4 giờ 24 giờ 4 giờ 24 giờ
Đỏ Cam/đỏ Cam/vàng Vàng
ARA Đỏ Cam/đỏ Cam/vàng Vàng
MAN Đỏ Cam/đỏ Cam/vàng Vàng
SOR Đỏ Cam/đỏ Cam/vàng Vàng
LAC Đỏ Cam/đỏ Cam/vàng Vàng
TRE Đỏ Cam/đỏ Cam/vàng Vàng
INU Đỏ Cam/đỏ Cam/vàng Vàng
RAF Đỏ Cam/đỏ Cam/vàng Vàng
AMD Đỏ Cam/đỏ Cam/vàng Vàng
GLYG Cam/đỏ Vàng
2.4.5.3 Quy trình định danh trên máy Vitek 2 Compact.
Máy Vitek 2 Compact là phần mềm vi tính giúp phân tích và dự trữ số liệu các vi khuẩn, nấm (nấm men) tại các phòng thí nghiệm. Nguyên lý hoạt động dựa trên các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn, nấm men đã được cài mặc định trên các thẻ Card định danh. Máy Vitek 2 Compact bao gồm:
- Bộ hút chân không dung dịch vi khuẩn, nấm - Các Catset hỗ trợ cho bộ hút chân không
- Thẻ card định danh nấm, vi khuẩn, kháng sinh đồ.
- Máy in và bộ lưu trữ điện. Quy trình thực hiện
- Nhuộm khuẩn lạc xác định Gram (+) của vi khuẩn, hình dạng vi khuẩn để xác định Card chạy trên máy Vitek 2 compact.
- Chuẩn bị thẻ (Card Gram+) ra khỏi tủ lạnh, để nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút. - Pha huyền dịch của vi khuẩn: Lấy 3ml nước muối 0,45% từ Dispenser vào ống nghiệm và pha huyền dịch của vi khuẩn
- Chuẩn mẫu huyên dịch: lấy huyền dịch vừa pha, lắc đều và đưa vào máy DENSICHER để đo độ đục sao cho độ đục đạt 0,5 – 0,63 Mc Fland.
- Lấy thẻ Card từ túi và đặt vào casstele.
- Từ phần mềm của máy Vitek 2 compact, tạo virtual castele. - Đưa casstele vào buồng hút, nhấn Start fill.
- Sau khi hút xong huyền dịch vào castele, chuyển ngay castele sang buồng vận hành Loadding Station.
- Sau khoảng 4 – 5 phút đèn nháy báo đã hút xong, mở buồng Loading station đưa castele ra ngoài, nhập thông tin mã bệnh phẩm để phần mềm vận hành.
- Chờ kết quả xét nghiệm, máy vitek 2 Compact sẽ tự in kết quả trên giấy.
2.4.5.4 Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn (thử phản ứng kháng sinh đồ)
- Thử kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby – Bauet trên môi trường Tryptic Soy Agar (TSA, Merck).
- Đo đường kính vòng vô trùng (mm): Dựa vào chuẩn đường kính của vòng vô trùng theo tài liệu của “The Clinical and Laboratory Standards Insititute, Anonumous, 2002) nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình, và kháng.
- Các bước tiến hành:
+ Cho khuẩn lạc vào 4ml nước muối sinh lý (0,85%) có độ đục 0,5McFland. + Hút 0,1ml cho vào bề mặt đĩa BHIA, chang đều bề mặt thạch, sau đó để khô 5- 10 phút.
+ Kẹp đĩa giấy kháng sinh vào đĩa BHIA đem ủ 30oC/ 48h
Bảng 2.3: Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn chuẩn TT Loại KS Lượng KS (µg) R(≤) (mm) I (mm) S (≥) (mm) 1 Trimethoprim (TR) 25 13 14-16 16 2 Gentamycin (GE) 10 12 13-14 15 3 Neomycine (NE) 10 12 13-14 15 4 Erythromycin (ER) 5 13 14-17 18 5 Clindamycine (CL) 20 19 20-22 23 6 Norfloxacin (NO) 10 12 13-16 17 7 Ciprofloxacin 5 15 16-20 20 8 Doxycycline (DO) 25 10 11-13 14 9 Tetracycline (Te) 30 11 12-14 15
(Nguồn: Oxiod từ NCCLS(1990) M2A4 (Oxiod,1982))