DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp đƣợc nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich và đƣợc sử dụng trực tiếp không có tinh chế gì thêm.
2.1.1. Hóa chất chính - Các Isatin: - Các Isatin: + Isatin + 5-Fluoroisatin + 5-Methylisatin + 5-Bromoisatin - Methyl-3-[4(bromomethyl)phenyl]prop-2- enoat - Ethylen glycol - Hydroxylamin hydroclorid - Sắt (III) clorid - Acid p-toluensulfonic
2.1.2. Dung môi và hóa chất khác
DMF Aceton MeOH Acid acetic băng n-Hexan
HCl EtOH NaOH Dicloromethan Nƣớc cất
2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ
- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, - Máy khuấy từ gia nhiệt
- Sinh hàn hồi lƣu
- Máy cất quay chân không
- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, giấy lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh.
- Máy Perkin Elmer ghi phổ IR
- Máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap MS ghi phổ khối lƣợng MS.
- Máy Bruker AV-500 ghi phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và 13C-NMR.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Tổng hợp hóa học 2.3.1. Tổng hợp hóa học
2.3.1.1. Tổng hợp
- Dựa trên những nguyên tắc và phƣơng pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất theo thiết kế.
- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết
- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng chạy sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.1.3. Xác định cấu trúc các chất tổng hợp được
Các chất tổng hợp đƣợc đƣợc xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.
- Phổ hồng ngoại (IR): đƣợc ghi tại khoa Hóa, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000- 600 cm-1. Các mẫu rắn đƣợc phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dƣới dạng film mỏng dƣới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lƣợng (MS): đƣợc đo bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap của Viện Hóa học Việt Nam, chế độ đo LC-MS, dung môi methanol.
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMRđƣợc ghi trên máy Bruker AV-500 tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi DMSO-d6. Độ chuyển dịch hóa học (δ) đƣợc biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
2.3.2. Thử tác dụng sinh học
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thƣ đại tràng (SW620). Phân tích dựa trên Western Blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng.
Ngoài ra tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp đƣợc còn đƣợc thử tại Khoa Dƣợc Trƣờng Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc. Enzym HDAC2 đƣợc cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) và sử dụng bộ kit định lƣợng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience). Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ Kit thử nghiệm.
Tóm tắt các bƣớc nhƣ sau: Enzym HDAC2 đƣợc ủ với KBH-A42 ở nhiều nồng độ khác nhau ở 37oC trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang. HDAC developer (tạo chất phát huỳnh quang trong hỗn hợp phản ứng) đƣợc thêm vào sau khi ủ và mức độ phát huỳnh quang đƣợc ghi bằng mày VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) với bƣớc sóng kích thích 360 nm và bƣớc sóng phát xạ 460 nm. Kết quả đƣợc ghi lại và giá trị IC50 đƣợc tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
2.3.2.2. Thử độc tính tế bào
* Nguyên tắc thử
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ (thử độc tính tế bào) in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, trƣờng Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phƣơng pháp MTT và giá trị IC50 đƣợc tính trên phần mềm GraphPad Prism [24,25].
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng).
Các tế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10 FBS (huyết thanh bào thai bò). Độc tính tế bào của các chất đƣợc thử bằng phƣơng pháp MTT theo các bƣớc sau:
Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit đƣợc trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trƣờng RPMI bổ sung 10 FBS và điều chỉnh đến nồng độ
khoảng 1,5.104 đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 l. Các đĩa sau đó đƣợc ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2. Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử đƣợc chuẩn bị trong 20 l môi trƣờng RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 l mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó đƣợc ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đƣợc chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%.
Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 l thuốc nhuộm MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) với nồng độ MTT là 5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS. Các đĩa đƣợc ủ thêm 3 giờ ở 37o
Ctrong điều kiện 5% CO2. Tiếp theo, mỗi giếng đƣợc cho 100 l dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan đƣợc hòa tan. Độ hấp thụ đƣợc đọc ở bƣớc sóng 510 nm.
* Tính kết quả
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50 so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trƣờng nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5 . Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism.
2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp đƣợc
Tính giá trị logP của các chất tổng hợp bằng phần mền EPTsuite cung cấp bởi US Environmental Protection Agency's Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC). Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đƣa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinsky [26]: + Khối lƣợng phân tử của chất không lớn hơn 500 g/mol.
+ Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10. + Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5. + Giá trị logP của chất không lớn hơn 5.