3.1.1.1. Chuẩn bị dung môi
Nước cất 2 lần loại ion
3.1.1.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử
Chuẩn bị mẫu chuẩn:
- Pha dãy dung dịch CP chuẩn: 10, 15, 20, 25, 30, 35 mg/l
Pha dung dịch CP gốc 5000 mg/l: cân chính xác khoảng 0,2500 g CP, cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml nước và lắc đều, siêu âm khoảng 5 phút, bổ sung nước vừa đủ.
Pha dãy dung dịch CP chuẩn trong bình định mức 50 ml từ dung dịch CP gốc 5000 mg/l.
- Tương tự, pha dãy dung dịch SB chuẩn trong bình định mức 50 ml từ dung dịch SB gốc 5000 mg/l.
- Pha dung dịch hai thành phần CP (10, 15, 20, 25, 30, 35 mg/l) và SB (20 mg/l) từ các dung dịch gốc đơn chất đã nêu.
- Pha dung dịch hai thành phần SB (10, 15, 20, 25, 30, 35 mg/l) và CP (20 mg/l).
Chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác một lượng bột thuốc tiêm tương ứng với khoảng 0,2500 g CP và 0,2500 g SB cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml nước và lắc đều, siêu âm khoảng 5 phút, bổ sung nước vừa đủ.
Lấy 200 µl dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung nước vừa đủ được dung dịch thử có nồng độ CP 20 mg/l và SB 20 mg/l.
3.1.1.3. Xây dựng phương pháp định lượng A. Chọn bước sóng định lượng A. Chọn bước sóng định lượng
a. Xác định khoảng cộng tính
Hình 3.1. Phổ hấp thụ của SB 20 mg/l, CP 20 mg/l, phổ cộng và phổ hỗn hợp SB 20 mg/l + CP 20 mg/l
Hình 3.1 biểu diễn phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn SB 20 mg/l, CP 20 mg/l, hỗn hợp SB 20 mg/l + CP 20 mg/l. So sánh phổ cộng tương ứng của SB và CP với phổ hỗn hợp của hai chất này cho thấy SB và CP có tính cộng tính ánh sáng trong khoảng bước sóng khảo sát từ 210,0 đến 300,0 nm.
b. Phương pháp giao điểm 0 * Đạo hàm bậc 1 phổ hấp thụ * Đạo hàm bậc 1 phổ hấp thụ
Xây dựng PĐH từ phổ hấp thụ của từng dãy dung dịch chuẩn một chất (ở các nồng độ khác nhau), lấy đạo hàm bậc 1 của phổ hấp thụ với các thông số:
- Phép lấy đạo hàm: Order: 5; No of coefficient: 9. - Phép làm trơn: Order: 3; No of coefficient: 125.
Hình 3.2.PĐH bậc 1 của dãy dung dịch SB (10 - 35 mg/l) và dãy dung dịch CP (10 - 35 mg/l)
Trên PĐH bậc 1 của dãy dung dịch CP có nồng độ thay đổi từ 10 mg/l đến 35 mg/l, tại = 217,9; 228,0 và 262,7 nm giá trị PĐH bậc 1 của CP bằng 0. Tại các bước sóng này, giá trị PĐH bậc 1 của hỗn hợp CP và SB chỉ còn phụ thuộc vào giá trị PĐH bậc 1 của SB, nghĩa là chỉ phụ thuộc vào nồng độ của SB mà không bị ảnh
hưởng bởi nồng độ CP. Qua khảo sát, định lượng SB tại = 228,0 nm cho sai số nhỏ nhất.
Tương tự, trên PĐH bậc 1 của dãy dung dịch SB có nồng độ từ 10 đến 35 mg/l, tại các = 255,7 300,0 nm thì giá trị PĐH bậc 1 bằng 0. Tại khoảng bước sóng này, giá trị PĐH bậc 1 của hỗn hợp CP và SB chỉ còn phụ thuộc vào nồng độ của CP mà không bị ảnh hưởng bởi nồng độ SB. Qua khảo sát, định lượng CP tại bước sóng 286,0 nm cho sai số nhỏ nhất.
* Biến đổi Fourier phổ hấp thụ
Hình 3.3. Fourier PHT của dãy đơn chất CP (10 - 35 mg/l) và Fourier của dãy đơn chất SB (10 - 35 mg/l)
bằng 0. Tại hai bước sóng này, giá trị Fourier PHT của hỗn hợp CP 20 mg/l và SB từ 10 đến 35 mg/l không phụ thuộc vào nồng độ CP. Vì vậy, hai bước sóng này được sử dụng để định lượng SB. Qua khảo sát lựa chọn λ = 246,0 nm cho kết quả chính xác hơn.
Tương tự với dãy dung dịch SB, phép biến đổi Fourier cho các bước sóng từ 266,0 đến 298,0 nm có giá trị bằng 0. Trong dải bước sóng này, giá trị Fourier PHT của hỗn hợp SB 20 mg/l và CP từ 10 đến 35 mg/l không phụ thuộc vào nồng độ SB. Qua khảo sát lựa chọn bước sóng λ = 278,0 nm cho kết quả chính xác nhất để định lượng SB (hình 3.3).
* Biến đổi wavelet phổ hấp thụ
Từ phổ hấp thụ của từng dãy dung dịch chuẩn một chất, thực hiện phép biến đổi wavelet với ba hàm sym6 (a = 256, f = 0,182); haar (a = 256, f = 0,249); mexh (a = 256, f = 0,063) (hình 3.4).
Hình 3.4. Biến đổi wavelet PHT của dãy chuẩn CP (10 - 35mg/l) và dãy chuẩn SB(10 - 35 mg/l) với các hàm (a) sym6 (256); (b) haar (256); (c) mexh (256)
Trên phổ biến đổi wavelet của dãy dung dịch CP từ 10 đến 35 mg/l, xác định được các bước sóng mà tại đó giá trị wavelet bằng 0: 231,8 nm (sym6); 222,8 nm (haar); 281,0 nm (mexh). Khi giá trị wavelet của CP bằng 0, giá trị wavelet của hỗn hợp CP và SB chỉ còn phụ thuộc vào giá trị wavelet của SB, nghĩa là chỉ phụ thuộc vào nồng độ của SB mà không bị ảnh hưởng bởi nồng độ CP (hình 3.4).
Tương tự trên phổ biến đổi wavelet của dãy SB từ 10 đến 35 mg/l, các bước sóng 274,0 nm (sym6); 288,0 nm (haar); 241,4 nm (mexh) đã được lựa chọn để định lượng CP trong sự có mặt của SB.
c. Phương pháp phổ tỷ đối
PTĐ của dãy CP được xây dựng bằng cách lấy PHT dãy dung dịch chuẩn một chất có nồng độ từ 10 đến 35 mg/l và dãy hỗn hợp SB 20 mg/l và CP từ 10 đến 35 mg/l chia cho SB 20 mg/l. Sau khi làm trơn với hệ số: Order: 3; No of coeficient: 125, PTĐ được xử lý với ĐH bậc 1, Fourier, wavelet để tìm bước sóng định lượng CP.
Tương tự với SB sử dụng số chia là CP 10 mg/l. * Đạo hàm bậc 1
Hình 3.5. PĐHTĐ của dãy dung dịch hỗn hợp CP (10 - 35 mg/l) + SB 20 mg/l và dãy dung dịch CP (10 - 35 mg/l) với số chia là SB 20 mg/l
Lấy phổ hấp thụ của dãy dung dịch hỗn hợp CP từ 10 đến 35 mg/l và SB 20 mg/l chia cho phổ hấp thụ của dung dich SB 20 mg/l được PTĐ. Lấy đạo hàm bậc 1 của phổ tỷ đối với các thông số:
- Phép lấy đạo hàm: Order: 5; No of coefficient: 9. - Phép làm trơn: Order: 3; No of coefficient: 125.
Tương tự lấy PĐHTĐ bậc 1 với dãy dung dịch CP từ 10 đến 35 mg/l. Qua khảo sát, = 260,9 nm được lựa chọn để định lượng CP (hình 3.5). Với SB
Hình 3.6. PĐHTĐ bậc 1 của dãy dung dịch hỗn hợp SB (10 - 35 mg/l) + CP 20 mg/l và dãy dung dịch SB (10 - 35 mg/l) với số chia là CP 10 mg/l
Lấy phổ hấp thụ của dãy dung dịch hỗn hợp SB từ 10 đến 35 mg/l và CP 20 mg/l chia cho phổ hấp thụ của dung dich CP 10 mg/l được PTĐ. Lấy đạo hàm bậc 1
Tương tự lấy PĐHTĐ bậc 1 với dãy dung dịch CP từ 10 đến 35 mg/l. Qua khảo sát, = 236,6 nm được lựa chọn để định lượng SB (hình 3.6). * Biến đổi Fourier
Với CP:
Hình 3.7. Biến đổi Fourier PTĐ của dãy dung dịch hỗn hợp CP (10 - 35 mg/l) + SB 20 mg/l và dãy dung dịch CP (10 - 35 mg/l) với số chia là SB 20 mg/l
Ta tiến hành lấy PTĐ của dãy CP từ 10 đến 35 mg/l chia cho SB 20 mg/l được PTĐ của dãy đơn chất. Sau khi khảo sát các hàm biến đổi Fourier, hàm (cos x + cos x + 450)), ∆λ = 0,1 nm được lựa chọn.
Qua khảo sát, = 266,0 nm được lựa chọn để định lượng CP (hình 3.7).
Với SB:
Ta tiến hành lấy PTĐ của dãy SB từ 10 đến 35 mg/l chia cho CP 10 mg/l được PTĐ của dãy đơn chất. Qua khảo sát các hàm Fourier, hàm (cos x + cos (x + 450)), ∆λ = 4 nm được lựa chọn.
Tương tự với dãy hỗn hợp SB từ 10 đến 35 mg/l và CP 20 mg/l cũng được biến đổi Fourier sau khi có PTĐ (Hình 3.8).
Hình 3.8. Biến đổi Fourier PTĐ của SB (10 - 35 mg/l) và hỗn hợp CP 20 mg/l + SB (10 - 35 mg/l) với số chia CP 10mg/l
*Biến đổiwavelet
Hình 3.9. Biến đổi wavelet PTĐ của dãy dung dịch hỗn hợp CP (10 - 35 mg/l) + SB 20 mg/l và dãy dung dịch CP (10 - 35 mg/l) với số chia là SB 20 mg/l theo các hàm
(a) sym6; (b) haar; (c) mexh.
Tiến hành biến đổi wavelet PTĐ được wavelet PTĐ với số chia là SB 20 mg/l
Tương tự biến đổi wavelet PTĐ với dãy dung dịch CP từ 10 đến 35 mg/l. Qua khảo sát, các bước sóng = 284,7 nm (sym6); = 293,5 nm (haar); = 273,5 nm (mexh) được lựa chọn để định lượng CP (hình 3.9).
Hình 3.10. Wavelet PTĐ của dãy dung dịch hỗn hợp SB (10 - 35 mg/l) + CP 20 mg/l với số chia là CP 10 mg/l và wavelet PTĐ của dãy dung dịch SB (10 - 35 mg/l)
với số chia là CP 10 mg/l theo các hàm (a) sym6; (b) haar; (c) mexh
Qua khảo sát ba hàm, hàm haar với a=256, f = 0,249, λ=241,5 nm được sử dụng để định lượng SB (hình 3.10).
B. Khảo sát khoảng tuyến tính
Mối tương quan giữa nồng độ và giá trị đạo hàm, Fourier, wavelet trong khoảng nồng độ 10 - 35 mg/l được biểu diễn trong bảng 3.1, 3.2
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CP và SB với phương pháp giao điểm 0 Phương pháp Hoạt chất Bước sóng (nm)
Phương trình hồi quy R2
PĐH bậc 1 CP 286,0 Y = - 0,0541x - 0,0116 0,9996 SB 228,0 Y = - 0,0143x - 0,0001 0,9996 Fourier PHT CP 278,0 Y = - 0,0037x - 0,0015 0,9998 SB 246,0 Y = 0,0011x + 0,029 0,9988 Wavelet sym6 CP 274,0 Y = 0,0343x + 0,0206 0,9994 SB 231,8 Y = - 0,0136x + 0,0072 0,9986 Wavelet haar CP 288,8 Y = 0,078x + 0.0153 0,9998 SB 222,8 Y = 0,0281x + 0,0067 0,9994 Wavelet mexh CP 241,4 Y = 0,3006x + 0,1375 0,9998 SB 281,0 Y = - 0,0275x - 0,0635 0,9970
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CP và SB với phương pháp phổ tỷ đối Phương pháp Hoạt chất Bước sóng (nm)
Phương trình hồi quy R2
PĐHTĐ CP 260,9 Y = 2,3005x + 0,7769 0,9996 SB 236,6 Y = - 0,0336x - 0,0251 0,9996 Fourier PTĐ CP 266,0 Y = - 0,1829x - 0,0196 0,9998 SB 250,0 Y = - 0,0024x - 0,0004 0,9994 Wevelet sym6 CP 284,7 Y = 12,43x + 9,6102 0,9983 SB Wavelet haar CP 293,5 Y = 23,954x + 13,685 0,9992 SB 241,5 Y = - 0,0405x + 0,0026 0,9996 Wavelet mexh CP 273,5 Y = 51,122x + 22,018 0,9996 SB
3.1.1.4. Độ lặp và độ đúng của phương pháp
Độ lặp và độ đúng của phương pháp được xác định dựa trên kết quả định lượng của 6 hỗn hợp tự tạo CP 20 mg/l + SB 20 mg/l trong cùng điều kiện (Bảng 3.3, 3.4).
Bảng 3.3. Độ lặp và độ đúng của các phương pháp với nguyên tắc giao điểm 0
Hàm lượng % tìm lại
STT PĐH bậc 1 Fourier PHT Wavelet sym Wavelet haar Wavelet mexh CP SB CP SB CP SB CP SB CP SB 1 100,3 100,1 100,0 97,5 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 2 99,7 101,8 97,9 101,9 100,0 99,9 100,0 97,9 100,0 101,1 3 101,3 100,7 101,1 101,0 100,6 105,2 100,6 100,9 100,6 105,2 4 101,6 102,9 103,2 101,9 102,0 101,2 99,8 100,9 101,6 100,0 5 102,2 102,1 102,7 100,0 101,3 102,8 102,0 98,1 100,9 101,4 6 101,3 105,0 100,3 97,8 100,1 102,8 101,8 97,7 100,4 102,0 TB 101,1 102,1 100,9 100,0 100,6 101,9 100,7 99,2 100,6 101,5 SD 0,9 1,7 1,9 1,9 0,8 2,0 1,0 1,5 0,6 2,0 RSD 0,9 1,7 1,9 1,9 0,8 2,0 1,0 1,5 0,6 2,0
Bảng 3.4. Độ lặp và độ đúng của các phương pháp với nguyên tắc phổ tỷ đối
Hàm lượng % tìm lại
STT PĐHTĐ Fourier PTĐ Wavelet sym Wavelet haar Wavelet mexh CP SB CP SB CP SB CP SB CP SB 1 100,2 100,2 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 2 101,8 97,1 98,5 100,7 102,0 101,5 96,8 100,0 3 101,9 101,9 100,4 102,0 101,8 100,0 101,3 102,1 4 101,6 101,9 99,5 98,2 101,8 101,5 100,3 101,5 5 100,5 101,8 100,1 100,9 99,9 100,7 100,0 100,9 6 99,9 101,9 101,6 103,2 100,0 97,1 101,1 100,1 TB 101,0 100,8 100,0 100,8 100,9 99,8 100,0 100,8 SD 0,9 1,9 1,0 1,7 1.0 1,9 1,6 0,9 RSD 0,9 1,9 1,0 1,7 1,0 1,9 1,6 0,9
3.1.2. Phương pháp HPLC
3.1.2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Dung môi: Nước cất 2 lần loại bỏ ion
Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Các dung dịch chuẩn và thử được chuẩn bị như mô tả trong mục 3.1.1.2
3.1.2.2. Xây dựng phương pháp HPLC
- Điều kiện sắc ký:
Cột: Apollo C18 150 mm x 4,6 mm; 5 µm Detector UV: 210 nm
Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
Pha động: hỗn hợp acetonitril - acid photphoric pH 3,2 (75 : 25 tt/tt) Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
- Hình 3.11 biểu diễn sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn CP 20 mg/l + SB 20 mg/l.
- Các thông số của quá trình sắc ký được trình bày trong Bảng 3.7.
-
Bảng 3.5. Thông số quá trình HPLC của hỗn hợp CP 20 mg/l và SB 20 mg/l STT Thông số CP SB 1 Độ lặp RSD < 2% 99 - 101% R2 > 0,990 AF = 1,2 AF = 0,95 2 Độ đúng 3 Khoảng tuyến tính 10 - 35 mg/l 4 Hệ số bất đối 5 Độ phân giải Rs = 12 6 Số đĩa lý thuyết 990 3645
7 Thời gian lưu (phút) tR = 4,4 tR = 2,7
3.1.3. Kết quả định lượng
Kết quả định lượng một số chế phẩm thuốc bột pha tiêm hiện đang lưu hành trên thị trường bằng các phương pháp quang phổ và HPLC được trình bày trong bảng 3.6. Kết quả cho thấy không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) về độ đúng (ANOVA) và độ lặp (Bartlett) khi so sánh các số liệu của các phương pháp quang phổ và HPLC với các chế phẩm đem định lượng.
Bảng 3.6.Kết quả định lượng các chế phẩm bằng phương pháp quang phổ và HPLC
Chế phẩm Hàm lượng % so với nhãn (TB ± SD, n = 6) HPLC PĐH Fourier PHT WPHT sym WPHT haar WPHT mexh PĐHTĐ Fourier PTĐ WPTĐ haar Cefactam CP 100,1 ± 1,1 99,4 ± 0,7 100,2 ± 0,7 100,7 ± 0,6 100,0 ± 0,7 99,9 ± 0,7 100,4 ± 0,9 99,5 ± 0,9 100,0 ± 1,0 SB 99,3 ± 1,2 99,3 ± 1,7 100,0 ± 0,9 100,9 ± 1,3 100,8 ± 1,1 99,1 ± 1,1 99,2 ± 0,8 100,3 ± 1,0 99,7 ± 1,5 Sulperazon CP 100,4 0,9 99,9 1,3 99,5 ± 0,8 101,3 ± 0,9 100,0± 1,2 100,0 ± 1,1 100,5 0,6 99,8± `1,0 99,7 ± 1,3 SB 100,3 1,2 99,4 1,8 99,9 ± 1,5 100,9 ± 1,7 100,9 ± 1,7 100,4 ±1,3 99,7 1,3 100,6 ± 1,0 100,8 ± 1,9 Jincetam CP 99,8 0,7 100,6 1,0 99,5 ± 1,2 100,7 ± 0,9 100,0 ± 0,8 101,1 ± 0,9 100,0 0,8 100,3 ± 1,0 100,3 0,7 SB 99,1 1,0 99,6 1,2 100,4 ± 1,0 99,5 ± 1,5 100,8 ± 0,8 100,7 ± 1,1 99,8 1,3 100,6 ± 1,2 100,9 ± 1,0 Bacamp CP 100,9 1,1 101,6 0,7 100,2 ± 1,3 101,1 ± 0,9 100,2 ± 1,0 101,0 ± 1,1 100,4 0,9 99,9 ± 1,3 100,5 ± 1,2 SB 100,8 0,8 101,2 1,3 101,5 ± 1,0 100,7 ± 0,9 100,6 ± 1,1 99,6 ± 1,9 100,5 1,2 100,8 ± 1,2 100,6 ± 1,4
3.2. BÀN LUẬN
Về nguyên tắc, không thể sử dụng quang phổ tử ngoại để định lượng đồng thời CP và SB do phổ hấp thụ CP 20 mg/l bao phủ hoàn toàn phổ hấp thụ SB 20 mg/l trong khoảng bước sóng khảo sát 200,0 – 300,0 nm (hình 3.1). Kết quả thực nghiệm cho thấy các phép biến đổi đạo hàm, Fourier và wavelet có khả năng phân tách các dải phổ đan xen này cho phép định lượng được đồng thời cả hai hoạt chất trong cùng một hỗn hợp mà không cần chiết tách. Ngoài ra, việc sử dụng nước làm dung môi là một ưu điểm nổi bật của các phương pháp này.
Trong đề tài này, việc xác định bước sóng định lượng được dựa trên nguyên tắc tìm giao điểm 0 của phổ hấp thụ dãy dung dịch một thành phần đã được biến đổi