Chuẩn độ đục Mac Farland 0,5
Ống Mac Farland 0,5 được mua với nồng độ tương đương là 1 x 108 CFU/ml.
Chuẩn độ vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn gốc Salmonella spp, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda và Edwardsiella ictaluri được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường NA.
Đem ủ ở nhiệt độ 28-30oC đối với 2 chủng vi khuẩn E. ictaluri và E. tarda
trong 24-48 giờ. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ đối với 6 chủng vi khuẩn còn lại (Salmonella spp, S. aureus, S. faecalis, P. aeruginosa, E. coli, A. hydrophila)
Sau khi vi khuẩn đã tăng sinh, dùng que cấy vô trùng lấy ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước muối NaCl 0,9% (đã hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội) và lắc đều ống nghiệm.
Điều chỉnh độ đục của các ống nghiệm dùng chuẩn độ vi khuẩn sao cho bằng với độ đục của ống Mac Farland 0,5 (tương đương 1 x 108 CFU/ml). Để thử hoạt tính kháng khuẩn và xác định MIC, huyễn dịch vi khuẩn trên được pha loãng 100 lần để có nồng độ 106 CFU/ml bằng cách rút 1 ml huyễn dịch vi khuẩn có nồng độ 108 CFU/ml sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước muối 0,9% được huyễn dịch vi khuẩn có nồng độ 107 CFU/ml. Lắc đều ống nghiệm bằng máy lắc và tiếp tục rút 1 ml huyễn dịch vi khuẩn từ ống nghiệm có nồng độ 107 CFU/ml sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước muối 0,9% được huyễn dịch vi khuẩn có nồng độ 106 CFU/ml (chú ý lắc đều ống nghiệm chứa
Vi khuẩn sau khi điều chỉnh độ đục được dùng trong vòng 15 phút, nếu để lâu hơn chuẩn độ lại.
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng liên tiếp cao dược liệu trong thạch.
Chuẩn bị nồng độ chất thử
Theo Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm (CLSI, 2011) Sử dụng công thức: C1 x V1= C2 x V2
Trong đó:
C1: nồng độ dung dịch gốc C2: nồng độ dung dịch cần pha
V1: thể tích cần tính để tạo nồng độ dung dịch cần pha V2: thể tích dung dịch cần pha
Cân 800 mg cao pha vào 10 ml dung dịch DMSO đã được tiệt trùng được dung dịch cao gốc có nồng độ 80.000 μg/ml.
Môi trường thạch MHA đã được pha với nước cất và hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút, lấy ra và để nguội đến khoảng 50oC.
Sau đó pha loãng dung dịch gốc trong môi trường MHA đã được hấp tiệt trùng để được các nồng độ theo dãy nồng độ sau: 4096 μg/ml, 2048 μg/ml, 1024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml. Lắc đều và đổ vào đĩa petri đã tiệt trùng và để nguội. Bên cạnh đó cũng tiến hành đĩa đối chứng không có chất thử mà thay bằng DMSO ở nồng độ 4096 μg/ml. Sau đó để yên chờ đĩa thạch đã pha cao đặc lại. Lật ngược các đĩa thạch đã nguội đặt vào tủ sấy để khô mặt thạch.
Tiến hành cấy vi khuẩn
Dùng micropipette nhỏ 1 μl huyễn dịch vi khuẩn đã chuẩn độ ở nồng độ 106 CFU/ml lên bề mặt thạch có chứa các loại cao thử nghiệm. Mỗi chủng vi khuẩn được nhỏ thành một chấm.
Ở mỗi nồng độ, cấy 2 chủng E. tarda, E. ictaluri trên cùng một đĩa petri, 6 chủng còn lại (Salmonella spp, S. aureus, S. faecalis, P. aeruginosa, E. coli, A. hydrophila) cấy trên cùng một đĩa.
Để yên đĩa thạch khoảng 15 phút đến khi vết cấy khô, lật ngược đĩa petri lại rồi đem ủ trong tủ ấm 37oC trong 18 - 24 giờ đối với 6 chủng vi khuẩn
Salmonella spp, S. aureus, S. faecalis, P. aeruginosa, E. coli, A. hydrophila và ủ mát ở nhiệt độ 28-30oC trong 24-48 giờ đối với 2 chủng vi khuẩn còn lại (E. tarda, E. ictaluri).
Thí nghiệm được tiến hành trên 6 dòng cao Nha đam.
Đọc kết quả
Đọc kết quả dựa trên việc mọc hay không mọc của vi khuẩn trên mặt thạch. Nếu vi khuẩn không mọc thì có nghĩa là cao Nha đam ức chế được vi khuẩn ở nồng độ đó, còn nếu mọc là không ức chế được. MIC được xác định là nồng độ thấp nhất mà ở đó vi khuẩn không mọc.
Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao các dòng Nha đam được tóm tắt qua Sơ đồ 3.2