3. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn
2.3. Phương pháp nghiêncứu
2.3.1. Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa sinh
2.3.1.1. Xác định hoạt độ catalase bằng phương pháp chuẩn độ (theo mô tả của Phạm Thị Trân Châu) [2]
Nguyên tắc: Catalase xúc tác cho phản ứng:
Để định lượng catalase có thể dùng dung dịch KMnO4 0,1N để xác định lượng H2O2trước và sau khi enzym tác dụng, từ đó tính lượng H2O2 đã bị chuyển hóa.
Từ phản ứng trên có 1ml dung dịch KMnO4 0,1N tương ứng với 1,7mg H2O2. Hóa chất: Đệm photphat 50mM (pH 7,0): (a) hòa tan 6,81g KH2PHO4 trong 1000ml nước cất; (b) hòa tan 11,41g KH2PHO4.3H2O trong 1000ml nước cất; trộn dung dịch a và b cho đến khi đạt pH 7,0. KMnO4 0,1N, H2SO4 10%, H2O2 0,1% trong đệm photphat 50mM (pH 7). Chiết enzym: cân 1g mẫu, nghiền trong 10ml đệm photphat (pH 7,0) 50mM, li tâm lạnh ở 17000g/15 phút/20C, dịch trong phía trên là dịch chiết enzym thu được.
Cách tiến hành:
Lấy 2 bình nón dung tích 100ml
Bình thí nghiệm
5H2O2 + 2KMnO4 2MnSO3H2SO4, 8H2O 4 + K2SO4 + 5O2
Dung dịch H2O2 0,1% (10 ml), dịch chiết enzym (10ml), giữ ở 300C trong 30 phút Axit H2SO4 10% (5ml), chuẩn độ H2O2 dư thừa bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền.
Bình đối chứng
Dịch chiết enzym (10ml), đun sôi cách thủy trong 5 phút để biến tính enzym, lấy ra để nguội, dung dịch H2O2 0,1% (10 ml), giữ ở 300C trong 30 phút Axit H2SO4 10% (5 ml), chuẩn độ H2O2 dư thừa bằng KMnO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền.
Cách tính hoạt độ:
Tính số mg H2O2 bị phân giải dưới tác dụng của enzym có trong a(g) mẫu: a V V B A X . 2 1 . 7 , 1 ). ( Trong đó:
A: số ml KMnO4 0,1N đã dùng để chuẩn độ H2O2 dư thừa trong bình đối chứng.
B: số ml KMnO4 0,1N đã dùng để chuẩn độ H2O2 dư thừa trong bình thí nghiệm.
V1: số ml dịch chiết enzym từ mẫu (= 10ml).
V2: số ml dịch chiết enzym dùng cho phản ứng (=10ml). a: khối lượng (g) mẫu (1g).
30 . 344 , 0 ) / (U g X C
Trong đó: 30: thời gian enzym tác dụng 0,034: 1 µmol đương lượng H2O2
2.3.1.2. Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp vi phân tích (theo mô tả của Phạm Thị Trân Châu) [2]
Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, đường khử kaliferixianua thành kaliferoxianua. Với sự có mặt của gelatin, kaliferoxianua kết hợp với sắt sunfat axit tạo thành phức chất xanh bền.
Hóa chất: Dịch chiết từ thân mầm ngô: cân 1g mẫu, nghiền kĩ trong 10ml nước cất, li tâm 7.000 vòng/15 phút. Thu dịch trong phía trên để phân tích. Dung dịch kaliferixianua: hòa tan 1,65g K3Fe(CN)6 và 10g Na2CO3 trong 1000ml nước cất. Bảo quản trong lọ thủy tinh màu nâu. Dung dịch sắt sunfat axit: hòa tan 1g Fe2(SO4)3 trong 10ml H2SO4 đặc. Đổ từ từ dung dịch vào nước cất có sẵn trong bình định mức, pha loãng đến mức 1000ml. Gelatin 10%: cân 10g gelatin với 100ml nước cất, để lên máy gia nhiệt ở nhiệt độ 500C để hòa tan gelatin. Dung dịch sắt sunfat axit gelatin: trộn lẫn dung dịch sắt sunfat axit với gelatin 10% theo tỉ lệ 20:1. Hỗn hợp chỉ sử dụng trong ngày.
Cách tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết đường và 2ml dung dịch kaliferixianua khuấy đều, đun sôi trong 15 phút, vừa đun vừa khuấy.
Sau đó để nguội, thêm vào ống 4ml dung dịch sắt sunfat axit gelatin, khuấy đều, dẫn nước đến mức 30ml.
Đo cường độ màu dung dịch trên máy UV-Vis 2450 Shimadzu (Nhật Bản) tại bước sóng 585nm.
Hàm lượng đường khử trong dung dịch đường suy ra từ đường chuẩn glucoz.
Cách dựng đường chuẩn glucoz: Lấy 5 ống nghiệm đánh số thứ tự từ 1 đến 5, cho vào từng ống khối lượng đường tương ứng như sau: 20, 40, 60, 80, 100mg trong 2ml dung dịch. Sau đó tiến hành tương tự như ống thí nghiệm, so màu, xác định OD585nm. Dựng đồ thị chuẩn. Kết quả đồ thị chuẩn:
Bảng 2.1. Nồng độ glucoz và giá trị OD585nm OD Nồng độ (µg/ml) 0,98 20 1,03 40 1,04 60 1,11 80 1,13 100
Phương trình đường chuẩn:
Y = 503,9 x X - 473,2 (R2 = 0,957)
Trong đó: Y là nồng độ glucoz (mg/ml), X là giá trị OD tương ứng Tính hàm lượng đường khử:
Hàm lượng đường khử
mg/g) =
Y(mg/ml).V(ml) w(g) Trong đó: V là thể tích mẫu (30ml), w là số gam mẫu (1g)