a, Thiết kế thắ nghiệm: Chuẩn bị thành phần của phản ứng như sau:
Bảng 3.2. Thành phần và thể tắch cho phản ứng PCR Hoá chất Thể tắch (ộl) PCR Buffer, Minus Mg 5 dNTP mixture 1 MgCl2 1,5 Forward Primer 0,5 Reverse Primer 0,5
Platinum Taq DNA Polymerase 0,5
Mẫu DNA 5
DW 11
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kì nhiệt:
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với gen ORF1 của PCV2
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (0C) Thời gian Số chu kì
1 Duỗi mạch 95 5 phút 1 Duỗi mạch 94 1 phút Gắn mồi 56 1 phút 2 Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 35 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 Vô thời
hạn 1
b, Phương pháp ựiện di ựể kiểm tra sản phẩm PCR * Chuẩn bị thạch
- Chuẩn bị bình thủy tinh nấu thạch - Bổ sung 100 ml ựệm TBE 1X - Thêm 1,5 g thạch Agarose - Hấp thạch 1000C/5 phút - để nguội ựến 600C Ờ 700C
- Bổ sung 1ộl Ethidium bromide (10 mg/ml), trộn ựều - đổ thạch ra khay gắn lược
- Chờ 30 phút cho thạch ựông lại
- Rút lược, cắt thành miếng thạch mong muốn
* Chạy ựiện di
- đặt thạch vào bể ựiện di
- đổ dung dịch TBE 1X ngập bản gel khoảng 3-5 mm - Dùng pipet hút bỏ hết không khắ tại các giếng thạch
- Dùng pipet hút 8 ộl sản phẩm của PCR vào các giếng - Nhỏ 6 ộl DNA Marker/1 giếng riêng biệt ựể làm thang ựo - đậy nắp, nối cực dòng ựiện (màu ựen là cực -, màu ựỏ là cực +) - Cắm ựiện, bật nguồn
- điều chỉnh máy ựiện di chạy ở hiệu ựiện thế 100V cường ựộ 100mA trong 30 phút
- Bản gel ựược chuyển vào máy phát tia UV ựể quan sát kết quả ựiện di. Vị trắ các ựoạn DNA ựược phát hiện bằng các vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.