3.4.1.Phương pháp quan sát
Trực tiếp tới các trang trại, cơ sở chăn nuôi lợn, quan sát triệu chứng lâm sàng, quay phim, chụp ảnh, ghi chép số liệu của từng cá thể và toàn ựàn.
3.4.2 Phương pháp mổ khám
Lợn bệnh ựược cố ựịnh trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dưới, bộc lộ tất cả các khắ quan ựể quan sát, tìm ra những biến ựổi bệnh tắch ựại thể.
3.4.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản
Các mẫu ựược lấy theo quy ựịnh của ngành.
Mẫu máu ựược lấy tại vịnh tĩnh mạch cổ, tĩnh mạnh tai sau ựó cho vào ống ựựng máu ựã có chất chống ựông.
Mẫu cơ quan tổ chức cần lấy ựúng (lấy ựúng cơ quan, ựúng vùng tổn thương ựiển hình); lấy ựủ (ựủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và ựủ lượng cần thiết).
Bệnh phẩm sau khi lấy cần cố ựịnh ngay trong dung dịch formol 10%.
3.4.4. Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm ựúc bằng parafin theo Robert (1969) và Burn (1974). Phương pháp làm tiêu bản vi thể ựược thực hiện theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Hematoxilin Ờ Eosin (HE). Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh.
- Khử formol
+ Mục ựắch ựể rửa sạch formol.
+ Sau khi cố ựịnh bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 2 Ờ 3 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có kắch thước 4 - 5mm, cho vào các cassette, ghi tên bệnh phẩm. Sau ựó, các cassette ựược rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
+ đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng. Hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian (giờ) 1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00 đúc tiêu bản
đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin.
Cắt dán mảnh và cố ựịnh tiêu bản
Cắt mảnh: cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với ựộ dày 2 - 3ộm. Dán mảnh: miếng tổ chức sau khi cắt ra sẽ ựược tãi phẳng trên phiến kắnh nhờ cho vào bình nước ấm 500C.
Sau ựó, miếng tổ chức khô ựược cho vào tủ ấm 370C trong 12 - 24 giờ.
Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxilin-Eosin. Các bước nhuộm như sau:
Các bước tiến hành:
+ Khử parafin : Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I : 10 phút
Xylen II : 10 phút Xylen III : 10 phút
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút) Cồn 950 : 1 lần
Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + Nhuộm Hematoxilin (nhuộm nhân):
Sau khi ựã rửa tiêu bản qua nước chảy trong vòng 15 phút ta ựem lau khô nước xung quanh tiêu bản, ựặt tiêu bản lên trên giá ựể rồi nhỏ Hematoxilin ngập tiêu bản, ựể trong vòng 5 phút. Sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, cho rửa nước chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxilin thừa. đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tắm là ựược. Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 600 + HCl, tỷ lệ HCl là 1%) trong 30 giây.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương):
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản 5-10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Sau ựó rửa nước chảy 10 phút cho hết Eosin thừa. Sau khi rửa nước ta lau sạch phần nước xung quanh bệnh phẩm rồi vào quy trình tẩy nước.
+ Tẩy nước: Ta cho tiêu bản qua hệ thống Cồn 900I : 15 giây.
Cồn 1000I : 15 giây. Cồn 1000II : 15 giây.
+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua Xylen I. Rồi sang Xylen II, ta lau sạch cồn ở xung quanh lam kắnh rồi chuyển sang Xylen III rồi sang Xylen IV, sau ựó cho vào Xylen ựã làm nóng trong tủ ấm 370C trong vòng 2 phút.
Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada, Xylen ấm lên trên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen ấm lên trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoài.
đánh giá kết quả
đem soi kắnh hiển vi quang học với vật kắnh 10X. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.
3.4.5. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction): Các nghiên cứu chỉ ra rằng phương pháp PCR là phương pháp nhạy nhất ựể phát hiện PCV2. Tuy nhiên, giá thành của phương pháp này còn cao.
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân bản một ựoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao, ựược Kary mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Kỹ thuật này tiếp tục ựược hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành công các máy chu kỳ nhiệt cho phép thay ựổi nhanh chóng và chắnh xác nhiệt ựộ cho từng giai ựoạn phản ứng. Cho ựến nay, kỹ thuật PCR ựược xem như một trong những phương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện ựại.
a, Nguyên lý của phản ứng PCR
Theo Lê Thanh Hòa (2002), sự tổng hợp DNA ngoài cơ thể của phản ứng PCR cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của quá trình tổng hợp DNA trong cơ thể như:
đoạn DNA cần nhân lên ựược mở xoắn chuyển thành 2 sợi ựơn làm khuôn, cần có các ựoạn mồi gắn (mồi xuôi và mồi ngược) làm cơ sở cho sự kéo dài sợi mới, trong quá trình tổng hợp cần có nguyên liệu là các dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), cần có enzyme DNA polymerase và một số ựiều kiện cần thiết cho sự tổng hợp như Mg2+.
Tuy nhiên khác với sự tổng hợp trong cơ thể, việc mở xoắn kép vốn ựược thực hiện nhờ enzyme helicase nay ựược thay thế bằng xử lý nhiệt ựộ cao kết hợp với sử dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống ựiều nhiệt thắch hợp cho từng giai ựoạn phản ứng với những ựoạn mồi ựược thiết kế hoàn toàn chủ ựộng, dẫn ựến sự tạo thành số lượng sản phẩm (ựoạn DNA ựược nhân) rất lớn trong khoảng thời gian ngắn và phục vụ hiệu quả mục ựắch của con người.
b, Các bước tiến hành phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ ựược lặp ựi lặp lại từ 20-40 lần với mỗi chu kỳ gồm 3 giai ựoạn:
Giai ựoạn biến tắnh (denaturation): Phân tử DNA ựược biến tắnh ở 940C Ờ 950C trong khoảng thời gian từ 30 giây ựến 1 phút, trong quá trình biến tắnh DNA sợi kép ựược dãn xoắn thành 2 ựoạn DNA mạch ựơn.
Giai ựoạn bắt cặp (annealing): Là giai ựoạn mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn hay còn gọi là giai ựoạn lai. Nhiệt ựộ ựể mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn thường từ 400C Ờ 700C, giai ựoạn này kéo dài từ 30 giây ựến 1 phút tùy thuộc vào mồi và DNA sợi khuôn tương ứng.
Giai ựoạn kéo dài (extension): Giai ựoạn tổng hợp nên ựoạn DNA mới. Ở giai ựoạn này nhiệt ựộ ựược nâng lên 720C ựây là nhiệt ựộ thắch hợp nhất cho DNA polymerase hoạt ựộng ựể tổng hợp sợi DNA mới trên cơ sở mồi ựã ựược bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn. Lê Thanh Hòa (2002) chỉ ra rằng thời gian cho bước này có thể kéo dài từ 30 giây cho tới nhiều phút tùy thuộc vào ựộ dài của trình tự DNA cần khuyếch ựại. Các ựoạn DNA mới ựược hình thành lại ựược sử dụng làm khuôn ựể tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo.
Hình 2.2. Mô hình các bước của phản ứng PCR 3.4.5.1. Phương pháp tách chiết DNA
Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu và bệnh phẩm theo bộ kắt DNeasy Blood & Tissue của QIAGEN (đức).
Các mẫu gồm máu và bệnh phẩm trước khi tiến hành tách chiết DNA ựược giải ựông ở nhiệt ựộ phòng.
- Với mẫu máu:
Bước 1: Dùng pipet hút 20 ộl Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml, thêm 100 ộl máu và cho thêm PBS cho ựủ 220 ộl. để bất hoạt RNA trong phản ứng thì bổ sung thêm 4 ộl RNase A (100 mg/ml), ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 2 phút.
Bước 2: Cho 200 ộl ựệm Buffer AL và trộn ựều bằng vortex trong 15 giây. Ủ ở 560C trong 10 phút.
Bước 3: Thêm 200 ộl ethanol (100%), trộn bằng máy vortex trong 15 giây.
Bước 4: Chuyển phần dịch pha trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy Mini spin, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phắa dưới.
Bước 5: đặt cột vào ống 2 ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500 ộl Buffer AW1 không ựể rơi lên thành, miệng, ựóng nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phắa dưới.
Bước 6: đặt cột vào ống 2 ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500 ộl Buffer AW2 và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phắa dưới.
Bước 7: đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ phần dung dịch ở phắa dưới. Thêm 200 ộl ựệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 1 phút và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới.
Dịch lỏng bên dưới chắnh là dung dịch chứa DNA tổng số. Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C.
- Tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm là các cơ quan, tổ chức theo quy trình sau:
Bước 1: Cân khoảng 25 mg mô bào và cắt thành những mảnh nhỏ ựựng trong ống siêu ly tâm 1,5 ml, cho thêm 180 ộl dung dịch ựệm ALT.
Bước 2: Thêm 20 ộl proteinase K, trộn bằng máy vortex và ủ ở 560C tới khi tế bào tan hoàn toàn (khoảng 2 giờ). Trong quá trình ủ mẫu thường xuyên lắc mẫu ựể mẫu phân tán hoàn toàn. Trộn bằng máy vortex trong 15 giây. Thêm 200 ộl Buffer AL vào mẫu, trộn ựều bằng máy vortex.
Các bước tiếp theo ựược tiến hành theo quy trình từ bước 3 ựến bước 7 của phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu.
3.4.5.2. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR
a, Thiết kế thắ nghiệm: Chuẩn bị thành phần của phản ứng như sau:
Bảng 3.2. Thành phần và thể tắch cho phản ứng PCR Hoá chất Thể tắch (ộl) PCR Buffer, Minus Mg 5 dNTP mixture 1 MgCl2 1,5 Forward Primer 0,5 Reverse Primer 0,5
Platinum Taq DNA Polymerase 0,5
Mẫu DNA 5
DW 11
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kì nhiệt:
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với gen ORF1 của PCV2
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (0C) Thời gian Số chu kì
1 Duỗi mạch 95 5 phút 1 Duỗi mạch 94 1 phút Gắn mồi 56 1 phút 2 Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 35 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 Vô thời
hạn 1
b, Phương pháp ựiện di ựể kiểm tra sản phẩm PCR * Chuẩn bị thạch
- Chuẩn bị bình thủy tinh nấu thạch - Bổ sung 100 ml ựệm TBE 1X - Thêm 1,5 g thạch Agarose - Hấp thạch 1000C/5 phút - để nguội ựến 600C Ờ 700C
- Bổ sung 1ộl Ethidium bromide (10 mg/ml), trộn ựều - đổ thạch ra khay gắn lược
- Chờ 30 phút cho thạch ựông lại
- Rút lược, cắt thành miếng thạch mong muốn
* Chạy ựiện di
- đặt thạch vào bể ựiện di
- đổ dung dịch TBE 1X ngập bản gel khoảng 3-5 mm - Dùng pipet hút bỏ hết không khắ tại các giếng thạch
- Dùng pipet hút 8 ộl sản phẩm của PCR vào các giếng - Nhỏ 6 ộl DNA Marker/1 giếng riêng biệt ựể làm thang ựo - đậy nắp, nối cực dòng ựiện (màu ựen là cực -, màu ựỏ là cực +) - Cắm ựiện, bật nguồn
- điều chỉnh máy ựiện di chạy ở hiệu ựiện thế 100V cường ựộ 100mA trong 30 phút
- Bản gel ựược chuyển vào máy phát tia UV ựể quan sát kết quả ựiện di. Vị trắ các ựoạn DNA ựược phát hiện bằng các vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.6. Xử lý số liệu
Các số liệu thu ựược trong quá trình thực tập ựược xử lý bằng phương pháp thống kê trên máy tắnh (Chương trình Excel).
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ XÁC đỊNH MỘT SỐ TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG CHỦ YẾU CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2 YẾU CỦA LỢN NGHI MẮC PCV2
Trong quá trình thực hiện ựề tài chúng tôi ựã ựọc tài liệu kết hợp ựiều tra tình hình chăn nuôi, ghi chép các thông tin liên quan qua các cán bộ thú y cơ sở và chủ các gia trại nơi có lợn nghi mắc PCV2 quan sát triệu chứng lâm sàng ựặc trưng, từ ựó xác ựịnh những con lợn nghi mắc PCV2. Một số thông tin của các nhóm lợn ựược chọn trong nghiên cứu này ựược trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Nguồn gốc các lợn sau cai sữa trong nghiên cứu
STT Lợn sau cai sữa Số lượng (con) Tiêm Vacxin phòng địa phương lấy mẫu Triệu chứng lâm sàng 1 Nhóm HN 2 4 bệnh ựỏ của lợn, PRRS Hà Nội Còi cọc, hoàng ựản, tiêu chảy, viêm khớp 2 Nhóm TB 2 Dịch tả lợn, PRRS Thái Bình Chậm lớn, tiêu chảy, hạch bẹn nông sưng 3 Nhóm BG 2 4 bệnh ựỏ của
lợn, giả dại Bắc Giang
Còi cọc, da nhợt nhạt, co giật, què quặt 4 Nhóm HY 2 4 bệnh ựỏ của lợn Hưng Yên Còi cọc, da nhợt nhạt, viêm khớp 5 Nhóm HD 2 4 bệnh ựỏ của lợn Hải Dương Còi cọc, thở khó, suy hô hấp Tổng số 10
Trên cơ sở theo dõi, kết hợp thu thập các thông tin, chúng tôi ựã tiến hành xác ựịnh một số triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn con sau cai sữa nghi mắc PCV2. Kết quả triệu chứng lâm sàng của lợn trên thực tế ựã ựược quan sát và tổng hợp lại ở bảng 4.2
Bảng 4.2. Triệu chứng lâm sàng của lợn sau cai sữa nghi mắc PCV2
STT Triệu chứng lâm sàng Số con quan sát Số con có biểu hiện Tỷ lệ (%)
1 Còi cọc 10 10 100 2 Chậm lớn 10 9 90 3 Tiêu chảy 10 7 70 4 Khó thở 10 8 80 5 Ho 10 6 60 6 Hạch bẹn nông sưng 10 5 50 7 Da nhợt nhạt 10 4 40 8 Hoàng ựản 10 1 10 9 Co giật 10 1 10
10 Viêm khớp, què quặt 10 1 10
Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của các lợn con sau cai sữa nghi mắc PCV2, chúng tôi thấy rằng: triệu chứng lâm sàng của lợn rất thay ựổi, không giống nhau ở các con, phụ thuộc vào chăm sóc nuôi dưỡng, trạng thái miễn dịch của cơ thể, và các yếu tố ựồng nhiễm, vi khuẩn, virus kế phát.
Từ kết quả ở trên, chúng tôi thấy triệu chứng chủ yếu lợn sau cai sữa nghi mắc PCV2 bao gồm: giảm cân (90%), còi cọc (100%), ỉa chảy (70%), khó thở (80%) và hạch bẹn nông sưng là 50% (hình 4.1, 4.2, 4.4, 4.6).
Kết quả này tương ứng với kết quả của Gillespie và cs (2009) với các triệu chứng lâm sàng của lợn sau cai sữa mắc PCV2 là còi cọc (98,1%), ỉa chảy (77,2%), khó thở (75,1%), sưng hạch bẹn nông (44,8%).
Các biểu hiện khác như hoàng ựản, nhợt nhạt, thiếu máu không phục hồi là do virus tác ựộng ựến tủy xương hoặc do suy dinh dưỡng theo John A.Ellis (2003), co giật, viêm khớp, què quặt theo John A.Ellis (2003); Taner KARAO (2011) xuất hiện ắt, rải rác trên lợn sau cai sữa ở các tỉnh khác nhau. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với kết quả của nhiều tác giả như Harding và Clark (1998).
Theo John C.S. Harding và cs (1998) các nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất là còi cọc, giảm cân và khó thở.
Virus xâm nhập vào cơ thể, trong những ngày ựầu virus có thể sinh sản không kiểm soát trong tế bào miễn dịch, sự sinh sản nhanh của virus làm phá