270 14 30 3.3 0.16 0.078 0.25 0.29 1.8 0.34 2.2 0.73 2.1 180 16 17 1.0 0.23 0.24 0.44 0.71 1.7 0.13 3.3 0.56 0.92 Mỡ lợn 230270 1615 6681 1.51.6 0.250.26 0.430.44 0.630.7 0.67 1.70.65 2.8 0.160.12 3.1 0.78 1.23.3 1.1 1.1
Từ bạng tređn ta thây raỉng lượng PAHs ở sạn phaơm chieđn baỉng mỡ thì nhieău hơn so với chieđn baỉng daău cại daău và nhỏ nhât là chieđn baỉng daău nành.
4.6. Phương pháp kieơm tra, phađn tích:
Quá trình phađn tích PAHs goăm các bước sau: quá trình xà phòng hóa, có theơ kêt hợp hoaịc thay thê baỉng quá trình trích ly baỉng dung mođi hòa tan, sau đó là quá trình tinh sách baỉng coơt với chât mang raĩn SPE hoaịc coơt saĩc ký áp suât thâp (chât nhoăi coơt là alumina, silicagel, Sephadex LH – 20) hoaịc quá trình phađn lớp lỏng - lỏng, cuôi cùng là phương pháp phađn tách và định lượng baỉng phương pháp saĩc ký lỏng hoaịc saĩc ký khí.
Quá trình phađn tích PAHs gaịp những khó khaín chụ yêu sau: khó khaín trong quá trình tách PAHs vì PAHs toăn tái lượng rât nhỏ trong thực phaơm và kêt quạ thường bị nhieêu do lipid và các táp chât cũng hòa tan trong các dung mođi dùng trích ly PAHs, khó khaín trong quá trifnh định lượng vì PAHs khođng toăn tái dáng đơn chât mà là moơt hoên hợp nhieău chât phức táp có câu táo tương tự nhau phú thuoơc vào từng lối thực phaơm. Do đó quá trình phađn tích PAHs đòi hỏi thiêt bị có đoơ nháy và đoơ chĩn lĩc cao [19].
Đeơ kieơm soát hieơu suât thu hoăi mău và lượng mău thât thoát trong suôt quá trình xử lý mău người ta boơ sung chât noơi chuaơn sau quá trình đoăng hóa mău. Moơt sô chât noơi chuaơn thường được sử dúng như: [13C3-pyrene (m/z 205), 13C6-fluoranthene (m/z 208), fluoranthene and pyrene (m/z 202, 101). Yeđu caău đôi với chât noơi chuaơn là có tính chât hóa, lý hĩc giông như cụa hợp chât PAHs chuaơn [10].
4.6.1. Quá trình trích ly – tinh sách:
Có nhieău phương pháp đeơ trích ly và tinh sách PAHs khỏi mău như:
Phương pháp Soxhlet goăm những bước như: trích ly PAHs và xà phòng hóa chât béo baỉng dung dịch methanol trong dung mođi là potassium hydroxide (KOH), cuôi cùng tinh sách baỉng coơt với chât mang raĩn Sep – Pak Florisil. Mău sau khi tinh sách được dùng đeơ cháy saĩc ký khí (GC) hoaịc saĩc ký lỏng cao áp (HPLC) [19].
Hoaịc ta cũng có theơ trích ly PAHs baỉng phương pháp trích ly lỏng cao áp với thiêt bị trích ly gia tôc ASE 300 (Accelerated Solvent Extractor), (Dionex Corp) có câu táo goăm moơt lớp lĩc baỉng cellulose dày 60 ml ở dưới đáy cụa dúng cú ASE, tiêp theo đên lớp celite dày 1.0 g và cuôi cùng là lớp florisil dày 15.0 g (đóng vai trò là pha tĩnh cụa quá trình trích ly).
Hình 4.11: Câu táo cụa thiêt bị trích ly gia tôc ASE 300
Quá trình trích ly như sau: Nghieăn mịn và sây khođ mău roăi pha loãng với chât noơi chuaơn. Mău (1.0g) đã sây khođ được đaịt vào tređn đưnh cụa dúng cú ASE (như hình vẽ). Quá trình trích ly được thực hieơn với pha đoơng là hoên hợp dung dịch hexane/acetone (50/50, v/v). Sự kêt hợp pha tĩnh (celite/florisil) được laĩp tređn coơt và pha đoơng hexane/acetone làm taíng hieơu quạ trích ly, tuy nhieđn florisil có theơ hâp phú moơt lượng nhỏ PAHs neđn trước khi sử dúng caăn có quá trình giại hâp phú baỉng dichloromethane [10].
Sau quá trình trích ly mău được tinh sách baỉng coơt với chât mang raĩn SPE (Envi Chrom-P). Ban đaău mău được rửa với hoên hợp cyclohexane/ethanol (70/30, v/v), sau đó mău được phađn tách baỉng pha đoơng là cyclohexane/ethyl acetate (40/60, v/v). Dịch trích ly sau quá trình tinh sách được cho vào dung mođi toluene và đem phađn tích baỉng phương pháp GC/MS/MS.
Trong sô các phương pháp tinh sách như saĩc ký gel thaơm thâm, dùng silica gel ...thì phương pháp tinh sách sử dúng florisil là phoơ biên nhât. Ngoài ra người ta còn sử dúng coơt SPE với chât nhoăi là polystyrene-divinylbenzene (PS-DVB) đeơ tinh sách PAHs. Quá trình vaơn hành tôi ưu cho coơt này là rửa coơt với ethyl acetate đeơ lối hêt PAHs còn sót trong coơt (thường chứa khoạng 1ng các chât như pyrene, fluoranthene và benzo [g,h,i]perylene), roăi mới tiên hành tinh sách. Và đeơ taíng theđm hieơu quạ cụa quá trình tinh sách ta tiên hành bôc hơi mău sau khi kêt thúc tinh sách, tuy nhieđn quá trình bôc hơi này lái làm toơn thât khoạng 20 – 70% các hợp chât PAHs có 3 vòng. Đeơ giạm toơn thât này caăn thực hieơn quá trình bôc hơi dưới đieău kieơn khí trơ (nitơ) ở nhieơt
Trang 115
Mău
Lĩc Pin
đoơ khoạng 400C và ngừng câp khí nitơ ngay khi mău được cođ cán [10].
4.6.2. Phương pháp phađn tích định tính và định lượng:
Cho đên nay hai phương pháp được sử dúng nhieău nhât trong phađn tích định tính và định lượng PAHs trong thực phaơm là phương pháp saĩc ký lỏng cao áp (HPLC) và saĩc ký khí (GC).
Đôi với heơ thông saĩc ký lỏng cao áp (HPLC) lối đaău dò thường được dùng nhieău nhât là đaău dò fluorescence và đaău dò UV. Với đaău dò UV ở bước sóng 254 nm có theơ phađn tích được cạ 16 lối PAHs trong khi đó thì đaău dò fluorescence phại tiên hành phađn tích ở 7 bước sóng khác nhau mới phađn tích được 16 lối PAHs, tuy nhieđn so với đaău dò UV thì đaău dò fluorescence có khạ naíng phađn tích PAHs ở noăng đoơ thâp hơn neđn nó văn được sử dúng roơng rãi hơn.
Ở heơ thông saĩc ký khí (GC) đeơ đát hieơu suât phađn tích cao thường sử dúng các coơt mao dăn và các lối đaău dò thường được dùng nhieău nhât là đaău dò ion hóa baỉng ngĩn lửa (FID), đaău dò ion hóa baỉng ánh sáng (PID), đaău dò ITD (ion – trap mass detector) hoaịc kêt hợp saĩc ký khí với khôi phoơ (GC – MS). Trong đó phương pháp GC – MS được sử dúng nhieău nhât vì khạ naíng phađn tích và đoơ nháy cao, và có theơ theđm phaăn định danh các PAHs ở trong mău [56].
4.6.3. Cách tính kêt quạ:
Đôi với heơ thông saĩc ký lỏng cao áp: PAHs trong mău được định tính baỉng cách so sánh thời gian lưu trong coơt và phoơ hâp thu cụa hợp chât chưa biêt với thời gian lưu trong coơt và phoơ hâp thu cụa hợp chât PAHs tieđu chuaơn, và baỉng phương pháp theđm mău đôi chứng (hợp chât PAHs tieđu chuaơn). Vieơc định lượng PAHs được thực hieơn baỉng phương pháp noơi chuaơn (hoaịc ngối chuaơn).
Đôi với heơ thông saĩc ký khí: PAHs trong mău được định tính baỉng cách so sánh thời gian lưu trong coơt cụa hợp chât chưa biêt với thời gian lưu trong coơt cụa hợp chât PAHs tieđu chuaơn tređn saĩc phoơ ion ghi được, và baỉng cách so sánh khôi phoơ cụa hợp chât chưa biêt với hợp chât PAHs tieđu chuaơn. Vieơc định lượng PAHs được thực hieơn baỉng phương pháp định lượng tương đôi. 4 noăng đoơ cụa 16 hợp chât PAHs tieđu chuaơn từ 0.5 ppb đên 20 ppm được trích vào heơ thông GC. Moêi đieơm cong tređn đoă thị cụa từng hợp chât PAHs tieđu chuaơn thu được baỉng phương pháp đánh dâu noăng đoơ tương ứng với dieơn tích cụa từng ion base, từ đó tính ra phương trình hoăi quy và heơ sô tương quan (r2) cụa phương trình. Đôi với phương pháp saĩc ký khí noăng đoơ moêi chât PAHs trong mău được xác định dựa vào cođng thức sau:
Với:
Ws: là noăng đoơ cụa PAHs trong mău
As: noăng đoơ cụa PAHs tieđu chuaơn có lieđn quan đên dieơn tích peak khi bơm theơ tích mău.
a: đoơ dôc cụa đường hoăi quy.
R: hieơu suât thu hoăi mău cụa quá trình xử lý mău
Xác định hieơu suât thu hoăi mău R: Các hieơu suât thu hoăi ở các mău khác nhau thì khác nhau do đó caăn làm thí nghieơm đôi với moêi laăn phađn tích. Nguyeđn taĩc là hieơu
suât thu hoăi được tính baỉng tư leơ giữa noăng đoơ chât noơi chuaơn thu được sau quá trình phađn tích với noăng đoơ chât chuaơn cho vào mău trước quá trình xử lý.
Thời gian phađn tích baỉng phương pháp GC – MS thì dài hơn so với phương pháp HPLC. Từ saĩc ký đoă ta thây raỉng phương pháp HPLC có kêt quạ phađn tách rõ ràng hơn, trong khi moơt sô peak cụa phương pháp GC bị choăng leđn nhau, tuy nhieđn khi phađn tử PAHs có khôi lượng phađn tụ nhỏ thì các peak tách nhau rõ ràng. Ngoài ra phương pháp HPLC còn có đoơ nháy cao hơn và giới hán phađn tích thâp hơn (ngối trừ khi dùng đaău dò fluorescence đeơ phađn tích acenaphthylene). Giới hán phađn tích cụa moêi phương pháp được cho ở bạng sau:
Bạng 4.15: Tóm taĩt moơt sô phương pháp phađn tích PAHs trong thực phaơm Teđn thực
phaơm
Phương pháp trích ly – tinh sách
Phương pháp saĩc ký và thođng sô kỹ thuaơt Kêt quạ phađn tích Thịt xođng khói, thịt nướng (đùi gà xođng khói) Phương pháp trích ly Soxhlet: xà phòng hóa chât béo baỉng dung dịch methanol trong dung mođi là potassium hydroxide (KOH).
Tinh sách baỉng coơt với chât mang raĩn Sep – Pak Florisil.
GC – MS sử dúng đaău dò ITD
Heơ thông GC Varian Model 3400 với coơt mao dăn DB – 5 (30m x 0.32 mm) với đoơ dày tâm phim là 0.25 µm và máy khôi phoơ baĩt ion Saturn III (Palo Alto, CA, USA). Khí mang: He với tôc đoơ khí 1ml/phút. Chương trình nhieơt đoơ: nhieơt đoơ dúng cú trích mău: 2800C, coơt saĩc ký: 700C trong 1 phút, nađng leđn 1500C tôc đoơ 10 0C/phút và 2800C tôc đoơ 40C/phút, giữ 14 phút.
MS: chê đoơ baĩt ion, khoạng scan 50-350 amu, 1 s/scan, hieơu đieơn thê xoay chieău là 1350V, hieơu đieơn thê múc tieđu là 2000V, Perfluorotributylamine được dùng làm mău xác định khôi lượng ở các giá trị m/z 69, 131, 264, 414, 502 và 614.
Phát hieơn 16 PAHs. LOD: 5 – 50 pg. Hieơu suât thu hoăi: 72.6% (Indeno [1,2,3- c,d]pyre), đên 96.8% (Chrysene), thời gian lưu cụa peak: 7.1 - 48.1 phút. [19]
HPLC: đaău dò Jasco UV – VIS 970/975, đaău dò fluorescence Jasco 821 – FP (Tokyo, Japan), coơt saĩc ký ODE-3029-ED, 125 x 4.6 mm, 5µm (Bedford,MA, USA). Pha đoơng acetonitrile:nước (55/45, v/v) cháy qua coơt trong 2 phút, sau đó đaịt chương trình taíng tuyên tính noăng đoơ acetonitrile đên khi đát 100% trong 23 phút, giữ 15 phút, lưu lượng 1.2 ml/phút. Bước sóng đaău dò UV: 254 nm.
Chương trình bước sóng cho đaău dò fluorescence: = 270/340 nm (naphthalene, acenaphthene, fluorene), 320/533 nm (acenaphthylene), 254/375 nm (phenanthene), 260/420 nm (anthacene, fluoranthene), 254/390 nm (pyrene, Phát hieơn 16 PAHs, hieơu suât thu hoăi: 72.8% (Naphthalene , đên 98.5% (Chrysene). Đaău dò UV: LOD: 0.03 – 1.54 ng, thời gian lưu cụa peak: 6.9 – 33.3 phút. Đaău dò fluorescence: LOD (trừ Trang 117
benzo(a) anthracene, chrysene), 260/420
nm (benzo(a)pyrene,
benzo(b)fluoranthene,
benzo(k)fluoranthene, dibenzo [a,h] anthracene, benzo(ghi)perylene) và 293/498 nm (indenol [123 – cd]pyrene).
acenaphthyle ne là 20 µg): 0.5 – 6 pg, thời gian lưu cụa peak: 7- 34 phút. [19] Thực phaơm chê biên dáng raĩn Trích ly: xà phòng hóa baỉng methanol 10M/potassium hydroxide (9:1, v/v), ly tađm ở 3500 rpm trong 10 phút, nhieơt đoơ phòng. Pha nhé beđn tređn được rửa baỉng n – hexane 3 laăn (laĩc 30 phút, ly tađm ở 3000 rpm trong 10 phút), bôc hơi còn 5 ml. Tiêp túc ly tađm và thu lây phaăn noơi tređn beă maịt đem cođ cán dưới đieău kieơn khí trơ, tái hòa tan caịn vào acetonitrile đem đi phađn tích.
HPLC: đaău dò fluorescence LS-40 fluoro- meter (Perkin-Elmer, Buckingham, UK), coơt Supelcosil LC-PAH, 4.5x25 cm (Supelco, Oakville, On- Canada).
Pha đoơng acetonitrile–water (90:10, v/v) trong 6 phút, sau đó taíng đên tư leơ (96:4, v/v) giữ trong 12.5 phút, roăi quay lái như ban đaău. Lưu lượng pha đoơng 1.6 ml/phút. Bước sóng đaău dò: 333/390 và 296/405 nm dùng đeơ phađn tích pyrene và BaP.
Thời gian lưu cụa pyrene và BaP là 4.2 và 9.7 phút. LOD: 1 – 14nmol/l (pyrene) và 4 – 14 nmol/l (BaP).
Hieơu suât thu hoăi: 83±20% (pyrene) và 75±13% (BaP). [14] Thực phaơm dáng lỏng như daău, mỡ ... Trích ly: xà phòng hóa baỉng methanol 10M/potassium hydroxide (9:1, v/v), ly tađm ở 3500 rpm trong 10 phút, nhieơt đoơ phòng. Pha nhé beđn tređn được rửa baỉng n – hexane 3 laăn (laĩc 30 phút, ly tađm ở 3000 rpm trong 10 phút), bôc hơi còn 5 ml. Tiêp túc ly tađm và thu lây phaăn noơi tređn beă maịt đem cođ cán dưới đieău kieơn khí trơ, tái hòa tan caịn vào acetonitrile đem đi
Heơ thông saĩc ký cho – nhaơn đieơn tử phức táp (DACC: donor – acceptor complex chromatography).
HPLC: đaău dò fluorescence LS-40 fluoro- meter (Perkin-Elmer, Buckingham, UK), coơt Supelcosil LC-PAH, 4.5x25 cm (Supelco, Oakville, On- Canada).
Pha đoơng acetonitrile–water (90:10, v/v) giữ trong 6 phút, sau đó taíng đên tư leơ (96:4, v/v) giữ trong 12.5 phút, roăi quay lái như ban đaău. Lưu lượng pha đoơng 1.6 ml/phút.
Bước sóng đaău dò: 333/390 và 296/405 nm dùng đeơ phađn tích pyrene và BaP.
Thời gian lưu cụa pyrene và BaP là 4.2 và 9.7 phút. LOD: 1 – 14nmol/l (pyrene) và 4 – 14 nmol/l (BaP).
Hieơu suât thu hoăi: 83±20% (pyrene) và 75±13% (BaP). [14]
phađn tích.
Tóm lái thì thời gian phađn tích baỉng phương pháp GC – MS thì dài hơn so với phương pháp HPLC nhưng saĩc ký đoă có kêt quạ phađn tách khođng cao vì moơt sô peak cụa phương pháp GC bị choăng leđn nhau, tuy nhieđn khi phađn tử PAHs có khôi lượng phađn tụ nhỏ thì các peak tách nhau rõ ràng. Ngoài ra phương pháp HPLC còn có đoơ nháy cao hơn vì nó có giới hán phađn tích thâp hơn (ngối trừ khi dùng đaău dò fluorescence đeơ phađn tích acenaphthylene) cú theơ là giới hán phát hieơn (LOD) cụa 16 hợp chât PAHs đôi với phương pháp HPLC khi sử dúng đaău dò UV là 0.03 – 1.54 ng, khi sử dúng đaău dò fluorescence (ngối trừ acenaphthylene là 20µg) là 0.5 – 6 pg. Đôi với phương pháp GC khi sử dúng các lối đaău dò khác nhau LOD là 5 – 50 ppb.
Như vaơy thì ngối trừ acenaphthylene thì giới hán phát hieơn (LOD) khi sử dúng đaău dò fluorescence nhỏ hơn từ 20 – 320 laăn so với khi sử dúng đaău dò UV, và nhỏ hơn gaăn 10 laăn so với phương pháp GC với các lối đaău dò ITD. Do vaơy cho đên nay saĩc ký lỏng cao áp (HPLC) với đaău dò fluorescence văn là phương pháp phađn tích được sử dúng nhieău nhât đeơ phađn tích hàm lượng PAHs trong các lối thực phaơm khác nhau [19].
Tuy nhieđn cho đên nay các phương pháp phađn tích tređn chư phađn tích được 16 chât trong nhóm PAHs và chưa theơ phađn tích được nhóm các dibenzopyrenes và 5 – methylchrysene [83].
Hieơn nay ngoài những phương pháp phađn tích neđu tređn người ta đã nghieđn cứu nhieău phương pháp khác đeơ rút ngaĩn thời gian phađn tích và tiêt kieơm hóa chât như: phương pháp tinh sách PAHs baỉng màng membrane, với sự kêt hợp cụa dung mođi trích ly và phương pháp phađn tích baỉng saĩc ký khí kêt hợp với khôi phoơ sử dúng dúng cú trích mău có theơ tích lớn (LVI - GC – MS) [92].
Rieđng đôi với thực phaơm dáng lỏng như daău, mỡ... (sự xađm nhaơp PAHs do bao bì nhieêm táp chât hoaịc do còn lái hoaịc bị nhieêm trong quá trình chê biên): ta có theơ thực hieơn quá trình phađn tích PAHs goăm các bước tương tự như với mău raĩn. Tuy nhieđn các phương pháp đeă caơp tređn thì mât nhieău thời gian và tôn nhieău dung mođi do đó ít thích hợp cho các phép phađn tích caăn kêt quạ nhanh chóng. Do đó hieơn nay có nhieău nghieđn cứu veă phương pháp phađn tích PAHs ở thực phaơm dáng lỏng baỉng heơ thông saĩc ký cho – nhaơn đieơn tử phức táp (DACC: donor – acceptor complex chromatography).
Nguyeđn taĩc: PAHs là chât cho đieơn tử (- electrons) neđn chúng có tương tác mánh với pha tĩnh là chât nhaơn đieơn tử do đó có khạ naíng phađn tách các hợp chât PAHs cũng như là phaăn lớn các thành phaăn khác có trong daău.
Dúng cú: Heơ thông saĩc ký cho – nhaơn đieơn tử phức táp (DACC) goăm moơt caịp saĩc ký lỏng LC – LC đóng vai trò coơt tinh sách DACC và moơt coơt phađn tách dùng đaău dò fluorescence đeơ định tính và định lượng.
So với phương pháp phađn tích truyeăn thông (saĩc ký lỏng cao áp hoaịc saĩc ký khí) thì phương pháp DACC tiêt kieơm dung mođi đáng keơ và thời gian cháy saĩc ký cũng được rút ngaĩn đáng keơ (toơng thời gian phađn tích moơt mău là 80 phút so với 8 – 10 giờ ở phương pháp truyeăn thông). Hơn nữa heơ thông DACC có theơ cháy saĩc ký lieđn túc suôt 24 giờ cho phép nađng cao naíng suât phađn tích. Giới hán định lượng đôi với moêi chât trong nhóm PAHs là 0.1 µg/kg. Và đieău đaịc bieơt là