Theo nhieău nghieđn cứu thì sự có maịt cụa các cation kim lối có ạnh hưởng lớn đên hàm lượng acrylamide được táo thành. Khi tiên hành thí nghieơm với phạn ứng táo acrylamide từ glucose và asparagine ở 1500C trong 20 phút thì ạnh hưởng cụa các cation kim lối khác nhau đên hàm lượng acrylamide thu được như sau:
Hình 2.16: Ạnh hưởng cụa các cation hoá trị 1, 2, 3 đên hàm lượng acrylamide sau khi gia nhieơt với hoên hợp glucose và asparagine (moêi lối 10µL) ở 1500C trong 20 phút.
Từ đoă thị tređn ta thây raỉng các cation kim lối (ngối trừ Na+) có tác dúng làm giạm hàm lượng acrylamide khi noăng đoơ kim lối càng taíng. Tác dúng này càng rõ reơt đôi với kim lối có hóa trị càng cao: Fe3+có theơ giạm đên 97% lượng acrylamide. Rieđng đôi vời Na+ chư có tác dúng giạm 59% khi noăng đoơ cation Na+
taíng từ 0 đên 5 µmoles, khi taíng noăng đoơ Na+ hơn nữa thì lái làm taíng hàm lượng acrylamide.
Aûnh hưởng cụa các cation kim lối đên sự táo thành acrylamide là do các cation này có khạ naíng ngaín cạn sự táo thành các base Schiff, moơt phađn tử đóng vai trò quan trĩng trong sự hình thành acrylamide. Khạ naíng ngaín cạn sự táo thành các base Schiff cụa các cation kim lối khác nhau được cho ở bạng sau:
Bạng 2.14: Khạ naíng ngaín cạn cụa các cation hoá trị 1, 2, 3 leđn sự táo thành base Schiff cụa aspargine
Hàm lượng Hàm lượng base Schiff giạm (%)
Cation, µmol A cr yl am id e, n m ol e
cation µmole Na K Ca Mg Zn Fe 0 0 0 0 0 0 0 1 13 27 26 38 33 68 5 53 76 84 84 86 100 10 57 83 100 100 100 100 20 25 89 100 100 100 100
Maịc dù các cation kim lối có theơ giạm đáng keơ hàm lượng acrylamide sinh ra nhưng nó lái xúc tác cho phạn ứng táo ra các hợp chât khác như hydroxymethylfurfural và furfural, những chât cũng được cho là có theơ gađy đoơc đôi với con người, sự taíng cụa các hợp chât này dieên ra đoăng thời với sự giạm hàm lượng acrylamide:
Hình 2.17: Ạnh hưởng cụa các cation hoá trị 1, 2, 3 đên hàm lượng hydroxymethylfurfural sau khi gia nhieơt với hoên hợp glucose và asparagine (moêi lối 10µL) ở 1500C trong 20 phút. Trang 39 H yd ro xy m et hy fu fu ra l ( nm ol ) Cation, µmol
Hình 2.18: Ạnh hưởng cụa các cation hoá trị 1, 2, 3 đên hàm lượng furfural sau khi gia nhieơt với hoên hợp glucose và asparagine (moêi lối 10µL) ở 1500C trong 20 phút.
Cơ chê phạn ứng táo hydromethylfurfural và furfural khi có maịt các cation kim lối được minh hĩa baỉng hình vẽ sau [113]:
Fu fu ra l ( nm ol ) Cation, µmol
Hình 2.19: Cơ chê phạn ứng táo hydromethylfurfural và furfural khi có maịt các cation kim lối (II)
2.6. Phương pháp phađn tích acrylamide:
Quy trình phađn tích hàm lượng acrylamide ở các lối thực phaơm thường tuađn theo những bước sau: Trích ly acrylamide khỏi thực phaơm baỉng các dung mođi phađn cực, sau đó tiên hành brođm hóa mău, tinh sách, định tính và định lượng baỉng nhieău phương pháp (saĩc ký khí, saĩc ký lỏng ...). Trong các bước tređn thì quá trình brođm hóa mău và quá trình táo dăn xuât là mât rât nhieău thời gian [117].
Cho đên nay người ta đã phát trieơn nhieău phương pháp saĩc ký đeơ phađn tích hàm lượng acrylamide trong quá trình xử lý nhieơt thực phaơm trong đó thì phương pháp saĩc ký lỏng cao áp và phương pháp saĩc kí khí kêt hợp với phương pháp khôi phoơ là được sử dúng nhieău nhât [129]. Dưới đađy là moơt sô kiên thức toơng quan hai phương pháp saĩc ký lỏng cao áp và phương pháp saĩc kí khí kêt hợp với phương pháp khôi phoơ LC/MS/MS và GC – MS thường được dùng nhieău nhât đeơ phađn tích hàm lượng acrylamide trong thực phaơm:
2.6.1. Quá trình trích ly:
Dung mođi trích ly: Nước ở nhieơt đoơ phòng được sử dúng đeơ trích ly acrylamide từ nhieău lối thực phaơm khác nhau vì tính chât rât háo nước cụa acrylamide. Ngoài nước ta có theơ sử dúng methanol như là moơt chât trích ly vì thuaơn lợi trong quá trình bôc hơi dung mođi và cođ đaịc hoaịc cũng có theơ sử dúng dung dịch nước muôi NaCl noăng đoơ cao đeơ ngaín cạn quá trình nhũ hóa có theơ xạy ra trong quá trình xử lý mău nhaỉm nađng cao hieơu suât thu hoăi mău. Ngoài ra trong các phòng thí nghieơm đeơ taíng hieơu quạ trích ly người ta cũng sử dúng hoên hợp nước và acetone làm dung mođi trích ly [129] vì hoên hợp dung mođi (nước và dung mođi hữu xơ) thường cho kêt quạ trích ly cao hơn khi chư đơn lẹ sử dúng nước hoaịc dung mođi hữu cơ. Và tư leơ giữa dung mođi hữu cơ và nước là 4:1 thì sẽ cho kêt quạ trích ly cao nhât [117].
Trong quá trình xử lý mău caăn hán chê gia nhieơt hoaịc sử dúng sóng sieđu ađm bởi vì có theơ táo ra moơt lượng lớn các phađn tử nhỏ có theơ làm bão hòa coơt trích ly sử dúng chât mang raĩn (SPE), làm giạm hieơu quạ tinh sách và giạm tuoơi thĩ cụa coơt. Tuy nhieđn dung mođi trích ly có theơ được gia nhieơt trước đên nhieơt đoơ 800C nhaỉm taíng tôc quá trình trích ly vì acrylamide khá beăn ở nhieơt đoơ này.
Ngoài ra đeơ trích ly acrylamide người ta cũng có theơ sử dúng phương pháp trích ly lỏng cao áp (PLE – pressurized liquid extraction), đađy là phương pháp trích ly các chât raĩn và bán raĩn sử dúng các dung mođi lỏng ở nhieơt đoơ và áp suât cao đeơ taíng hieơu suât trích ly vì taíng nhieơt đoơ sẽ taíng đoơng hĩc cụa quá trình trích ly, đoăng thời áp suât cao sẽ giạm nhieơt đoơ sođi cụa dung mođi khiên quá trình trích ly dieên ra nhanh và an toàn. Do đó đađy cũng là moơt phương pháp trích ly nhanh và hieơu quạ acrylamide từ nhieău lối thực phaơm khác nhau.
Đeơ kieơm soát hieơu suât thu hoăi mău và lượng mău thât thoát trong suôt quá trình xử lý mău người ta boơ sung chât noơi chuaơn sau quá trình đoăng hóa mău. Moơt sô chât noơi chuaơn thường được sử dúng như: [13C3] acrylamide, [13C1] acrylamide, [2H3] acrylamide, N,N – dimethylacrylamide, methacrylamide. Yeđu caău đôi với chât noơi chuaơn là có tính chât hóa, lý hĩc giông như cụa hợp chât acrylamide
chuaơn [129].
Đôi với các thực phaơm giàu béo trước hoaịc trong quá trình chiêt tách caăn thực hieơn quá trình tách béo baỉng các dung mođi như hexane, cyclohexane hoaịc petroleum ether. Còn đôi với các lối thực phaơm giàu protein trước quá trình trích ly caăn đođng tú protein baỉng các dung dịch methanol, acetonitrile hoaịc nước muôi noăng đoơ cao. Ngoài ra cũng có theơ lối protein baỉng phương pháp Carrez I (theđm 1mL dung dịch 0.68M potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate) sau đó kêt hợp với Carrez II (1mL dung dịch 2M zinc sulfate heptahydrate) trong đieău kieơn khuây mánh lieđn túc. Đađy là moơt phương pháp lối protein rât nhanh, trong vòng <1 phút.
Sau quá trình trích ly dịch trích được ly tađm trước khi baĩt đaău quá trình tinh sách, moơt sô các chê đoơ ly tađm như: kêt hợp giữa ly tađm và lĩc baỉng máy li tađm Centricon plus – 20 và lưới lĩc PVDF (polyvinylidene fluoride) 0.45 µm hoaịc thực hieơn quá trình ly tađm hai giai đốn, giai đốn moơt ly tađm ở 4000 rpm trong 10 phút ở 100C, giai đốn hai ở 10.000 rpm trong 10 phút ở 100C.
Toàn boơ quá trình trích ly và tinh sách acrylamide trước quá trình cháy saĩc ký trong LC/MS/MS và GC – MS đieơn hình được bieơu dieên baỉng hình vẽ sau [129]:
Trích ly SPE
Thu phaăn dung dịch mău sau rửa giại Bỏ nước
rửa đaău
Brođm hóa baỉng 100-300 µl hoên hợp : KBr : 16,2g Hbr : 0,8 ml Bromine: 5ml Nước : 60ml Làm lánh 00C Theđm 10 µl dung dịch Na2S3O3 Theđm vào dịch chiêt 4 ml EtAc Pha EtAc Mău Nghieăn mịn Theđm chât noơi chuaơn, 300-400 ml nước Đoăng hóa Pha noơi Ly tađm Lánh đođng, rã đođng,ly tađm Trích ly SPE
Rửa baỉng MeOH (1ml) Bão hòa với nước (2 ml) Bơm dung dịch mău (0.5 – 2 ml) Rửa giại với nước
Bỏ nước rửa đaău
Thu phaăn dung dịch mău sau rửa
giại
Làm khođ
Bôc hơi đên khođ baỉng máy ly tađm
chađn khođng
Hòa tan vào 2µ lượng EtAc Ly tađm ở 15.000 rpm (10 phút)
Lĩc baỉng lưới lĩc membrance (0,22 µm) Lĩc ly tađm đeơ lối những phađn tử có phađn tử khôi > 3.000 (50 phút)
Rửa baỉng MeOH (1ml) Bão hòa với nước (2 ml) Bơm dung dịch mău (0.5 – 2 ml) Rửa giại với nước
Hình 2..20: Quá trình trích ly, tinh sách và xử lý mău trước quá trình cháy saĩc ký GC – MS, LC – MS/MS, EtAc: ethyl acetate, MeOH : methanol.
2.6.2. Quá trình tinh sách:
Quá trình tinh sách là sự kêt hợp cụa nhieău quá trình tinh sách sử dúng coơt có chât mang raĩn (SPE). Ta có theơ tinh sách baỉng cách kêt hợp giữa coơt Oasis HLB (Water, Milford, MA, USA) và coơt Bond Elut-Accucat (mixedmode: C8, SAX and SCX) (Varian, Palo Alto, CA, USA) hoaịc kêt hợp giữa hai coơt goăm: Oasis MAX (mixed-mode anion exchange: kieơu hoên hợp trao đoơi anion ) ( Water), coơt Oasis MCX (mixed-mode cation exchange: kieơu hoên hợp trao đoơi anion ) và coơt ENVI- Carb (nhoăi baỉng carbon hốt tính) (Supelco, Bellefonte, PA, USA) hoaịc cũng có theơ kêt hợp giữa coơt Bond Elut C18, coơt Bond Elut Jr-PSA (trao đoơi anion) và coơt Bond Elut Accucat (Varian).
Câu táo cụa coơt Oasis HLB: chât mang chính là heơ cađn baỉng heơ ưa nước – kị nước và chât nhoăi pha đạo thâm nước, còn coơt Oasis MCX có chât mang chính là chât nhoăi pha đạo trao đoơi cation hoên hợp. Đađy là hai coơt được ứng dúng trong haău hêt các quá trình tinh sách SPE trong phađn tích acrylamide.
Moơt quá trình tinh sách sử dúng coơt có chât mang raĩn SPE đieơn hình goăm hai bước: Bước A sử dúng moơt ông xạ chađn khođng đeơ cài đaịt mức chađn khođng, với tôc đoơ dòng 2 – 4 ml/phút đôi với coơt Oasis HLB. Còn đôi với coơt Oasis MCX khođng caăn ông xạ chađn khođng vì các phađn tử kích thước lớn (60 µm) được bơm xuyeđn qua coơt tinh sách. Toàn boơt quá trình tinh sách được bieơu dieên baỉng hình vẽ sau:
Trang 45 Rửa coơt baỉng 2ml methanol và
2ml NaCl
Giại hâp baỉng 3 ml methanol có chưa 1% acid formic
Bơm dung dịch đã giại hâp từ bước A
Rửa baỉng 0.5 ml methanol
Bôc hơi dung mođi, tái hòa tan vào 0.4 ml nước
Bước A: Tinh sách baỉng
coơt Oasis HLB Bước B: Tinh sách baỉng coơt Oasis MCX
Rửa coơt baỉng 2ml methanol dfdkfjdflds
Rửa coơt baỉng 0.8 ml nước vođ khuaơn
dfdkfjdflds
Bơm mău vào coơt (1.5ml) dfdkfjdflds
Hình 2.21: Quá trình tinh sách đieơn hình dùng coơt có chât mang raĩn SPE dùng trong phađn tích hàm lượng acrylamide
Với đieău kieơn tinh sách như tređn thì có theơ đát được hieơu suât thu hoăi mău leđn đên 98% và đoơ leơch chuaơn (RSD) là 9.5% (n = 15 mău).
Các yêu tô ạnh hưởng đên quá trình trích ly là: quá trình nghieăn mău (khođ hoaịc ướt), dung mođi trích ly (nước hoaịc hoên hợp với các dung dịch hữu cơ khác), nhieơt đoơ và thời gian trích ly, thành phaăn nguyeđn lieơu, các bước khác (tách béo, lối protein). Trong quá trình xử lý mău thì quá trình tinh sách sử dúng coơt có chât mang raĩn (SPE) đóng moơt vai trò rât quan trĩng thường được sử dúng roơng rãi trong quá trình phađn tích.
Bạng 2.15: Tóm taĩt moơt sô các phương pháp saĩc ký dùng trong phađn tích hàm lượng acrylamide ở các lối thực phaơm khác nhau Teđn thực
phaơm Phương pháp trích ly Phương pháp tinh sách Phương pháp saĩcký và chât noơi chuaơn Ngũ côc aín
sáng, crackers
Trích ly baỉng nước, đoăng hóa, ly tađm, theđm
acetonitrile đođng tú các protein và táp chât khác, làm bôc hơi acetonitrile.
Tinh sách baỉng nước và methanol, tinh sách baỉng coơt SPE, lĩc baỉng dúng cú lĩc syringe.
LC–ESI-MS/MS; [13C3]acrylamide [110]
Cà pheđ Pha loãng với chât noơi chuaơn, trích ly baỉng HPLC với pha đoơng là nước , ly tađm, laĩc (30 giađy), ly tađm lái và lĩc baỉng lưới lĩc 0.45µm.
Sử dúng coơt Oasis HLB 6cc, dung mođi là nước –
methanol (1:1), sau đó tinh sách baỉng coơt Bond Elut- Accucat, dung mođi là nước – methanol (1:1). LC–MS/MS; [13C3]acrylamide [22] Thực phaơm chieđn, nướng Nghieăn nhỏ, tách béo baỉng hexane, lối dung mođi dư, trích ly baỉng methanol (50 mL), khuây đeău 15 phút và laĩc 1 phút trong boăn sieđu ađm, ly tađm.
Cođ đaịc trong thiêt bị bôc hơi đên khi mău còn < 2ml, pha loãng baỉng nước đên theơ tích cô định 2 ml, lĩc nhanh.
GC–MS [39]
Thực phaơm
từ ngũ côc Nghieăn, pha loãng với chât noơi chuaơn, theđm nước, đoăng hóa (30 giađy), chưnh đên pH 4-5 baỉng acid acetic, lối protein baỉng phương pháp Carrez I và Carrez II, ly tađm (16,000×g, 15phút), brođm hóa mău.
Chuyeơn mău vào coơt saĩc ký chứa muôi sulfate và Florisil đã hốt hóa (5g moêi lối), táo dăn xuât
acrylamide baỉng acetone, bôc hơi mău đên 2 ml và sau đó cođ đên khođ, hòa tan vào EtAcd (400µL) theđm 40 µL triethylamine sau đó lĩc baỉng lưới lĩc 0.2 µm. GC–MS; [13C3]acrylamide [130] Boơt socola, cacao, cà pheđ
Pha loãng với 5µL chât noơi chuaơn, lối protein baỉng phương pháp Carrez I và Carrez II, theđm 5 ml
Sử dúng coơt Isolute Multimode, dung mođi là nước – methanol (2:1), rửa lái baỉng nước, cođ mău còn
LC–MS/MS; [2H3]acrylamide [52]
dichloromethane, ly tađm, chuyeơn vào ông nghieơm chứa 1.8 g NaCl, trích ly baỉng EtAc (13 mL), sau đó cođ mău đên khođ.
90 µL, theđm 90 µL methanol vào mău.
Các thực
phaơm chieđn Trích ly baỉng nước, lytađm, pha loãng với chât noơi chuaơn,
Tinh sách baỉng coơt strata-X- C, dung mođi là nước – methanol (1:1), cođ cán dưới đieău kieơn chađn khođng, tái hòa tan vào 1ml nước.
HPLC–UV; LC– MS; [2H3]acrylamide [31] Khoai tađy chieđn
Pha loãng với chât noơi chuaơn, ụ ở nhieơt đoơ phòng (30 phút), trích ly baỉng nước, laĩc 10 phút trong boăn sieđu ađm, ly tađm.
Lĩc baỉng lưới lĩc nylon kích thước 0.45 µm. LC–ESI-MS; [13C3]acrylamide [42] Bánh mì giòn, bánh cookies
Đoăng hóa mău, pha loãng với chât noơi chuaơn, đeơ hở trong vòng 30 phút, trích ly baỉng nước, laĩc (30 phút, 600C) trong boăn sieđu ađm, ly tađm.
Tinh sách baỉng acetonitrile, lối protein baỉng phương pháp Carrez I và Carrez II, ly tađm và lĩc baỉng màng lĩc membrane. LC–MS/MS; [2H3]acrylamide [66] Nhieău lối thực phaơm: cá, bánh mì, pizza ...
Đoăng hóa mău, bạo quạn ở nhieơt đoơ 200C trước quá trình phađn tích, pha loãng với chât noơi chuaơn, trích ly baỉng nước, ly tađm.
Tinh sách baỉng coơt SPE, lĩc ly tađm đên khi đát được theơ tích mău caăn. LC–MS/MS; [13C3]acrylamide [129] Thực phaơm trẹ em
Đoăng hóa mău, pha loãng với chât noơi chuaơn, trích ly baỉng nước, laĩc (30 phút, 600C) trong boăn sieđu ađm.
Lối protein baỉng phương pháp Carrez I và Carrez II, tách béo baỉng n - hexane, bão hòa baỉng dung dịch NaCl, trích ly hai laăn baỉng 50mL EtAc, cođ cán đên 1ml. GC–MS/MS; [13C3]acrylamide [118] Snack, bánh mì đen, vịt quay và rođti
Đoăng hóa mău, pha loãng với chât noơi chuaơn, trích ly baỉng dung dịch methanol 5%, đaịt ở nhieơt đoơ phòng trong 1giờ, ly tađm (136,000×g, 5phút).
Khođng caăn theđm moơt bước tinh sách nào, bơm trực tiêp vào boơ phaơn trích mău.
LC–MS/MS; [13C3]acrylamide [30]
Nhieău lối
thực phaơm Nghieăn, tách béo baỉng iso– hexane, pha loãng với chât noơi chuaơn, ụ ở nhieơt đoơ phòng trong vòng 30 phút.
Tinh sách baỉng acetonitrile, lối protein baỉng phương pháp Carrez I và Carrez II, ly tađm (4500×g, 10 phút) và lĩc baỉng màng lĩc membrane. HPLC–MS/MS; GC–MS/MS; [2H3]acrylamide [114]
Cà pheđ Pha loãng với chât noơi Tinh sách baỉng coơt Isolute LC–MS/MS; Trang 47
chuaơn, trích ly baỉng nước, ly tađm (3500×g, 10 phút)
Multimode, dung mođi là nước – acetonitrile (4:1), lối dung mođi với tôc đoơ 6ml/phút đên khi còn 2ml mău. [ H3]acrylamide [96] Chú thích: PVDF: polyvinylidene fluoride.
Phương pháp Carrez I và Carrez II goăm dung dịch potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate và zinc sulfate heptahydrate (1:1).
EtAc: ethyl acetate.
SPE (solid-phase extraction): Tinh sách baỉng coơt với chât mang raĩn. PTFE: polytetrafluoroethylene.
ESI: electrospray ionization.
2.6.3. Quá trình phađn tích :
Quá trình phađn tích baỉng phương pháp saĩc ký khí kêt hợp với phương pháp khôi phoơ (GC – MS): goăm hai phương pháp nhỏ là saĩc ký khí kêt hợp với phương pháp khôi phoơ (GC – MS) có táo dăn xuât và khođng táo dăn xuât [129].
Phương pháp saĩc ký khí kêt hợp với phương pháp khôi phoơ (GC – MS) có táo dăn xuât:
Trong quá trình phađn tích acrylamide baỉng phương pháp saĩc ký khí kêt hợp với phương pháp khôi phoơ (GC – MS) có táo dăn xuât và khođng táo dăn xuât đeău thực hieơn phạn ứng táo dăn xuât cụa acrylamide với brođm (brođm hóa) trước quá trình tinh sách mău. Múc đích cụa quá trình brođm hóa là nhaỉm táo ra hợp chât deê bay hơi hơn làm taíng hieơu quạ cụa phương pháp saĩc ký (ít phađn cực hơn deê hòa tan vào các dung mođi hữu cơ khođng phađn cực như ethyl acetate và hexane, taíng