Trước khi lấy mẫu cần cố định lợn chắc chắn. Lợn con thì bắt giữ, còn lợn lớn lấy dây móc vào răng nanh hàm trên của lợn kéo lên sao cho đầu lợn ngửa về sau để cố định.
Vị trí lấy máu: vịnh tĩnh mạch cổ của lợn, sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn 70° hoặc cồn iod trước khi lấy máu. Dùng xylanh loại 10ml và kim lấy máu vô trùng đâm vào vịnh tĩnh mạch cổ lợn, khi thấy máu chảy ra đốc kim thì hút lượng máu 3 - 5ml rồi bơm ngay vào ống nghiệm, lắc nhẹ và để ống nghiệm nghiêng 45°, chắt huyết thanh.
Mẫu được bảo quản trong bình lạnh và gửi về Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương để xét nghiệm bằng phương pháp RRT-PCR.
Tỷ lệ mẫu (+) tính (%) = Số mẫu (+) tính x 100 Số mẫu xét nghiệm
* Phương pháp RRT-PCR chẩn đoán virus PRRS ở lợn: theo Nguyễn Ngọc Hải và cs (2007) [6] phương pháp này gồm các công đoạn sau
+ Tách chiết ARN virus:
Sử dụng TRIzol: cho 100µl huyết thanh (dịch nuôi cấy tế bào, tinh dịch) vào ống eppendorf, sau đó cho thêm 1ml chất phản ứng TRIzol vào ống. Cho vào máy quay (vortex) để trộn đều rồi để yên trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Thêm 0,2ml Chloroform và vortex để trộn đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm với 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở 4°C để phân tách các phần khác nhau. Thu lấy phần dịch không màu bên trên và cho vào 1 ống eppendorf mới.
Thêm 0,5ml Isopropanol và 1µl glycerol vào ống eppendorf có chứa dịch thu được. Vortex để trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Loại bỏ phần dịch bên trên, cố gắng loại bỏ hết ethanol. Làm khô khối ARN trong không khí 5-10
phút, sao cho bốc hơi hết ethanol. Hoà tan khối ARN trong 10 µl nước không chứa ARNse, giữ ở -20°C đến khi sử dụng.
Sử dụng bộ kit tách ARN của công ty QUIAGEN: QIAamp Viral ARN Mini kit.
+ Điện di ARN trên gel biến tính:
Cân 0,3g agarose, cho thêm 16 ml nước cất 2 lần khử ion đã được xử lý với DEPC, đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội khoảng 60°C, cho thêm 4ml FA (Formaldehyde agarose) gel buffer và 360µl formaldehyde 37- 40%, lắc đều, đổ gel.
Điện di mẫu ARN trong dung dịch điện di [dung dịch MOPS 1M (FA gal buffer 1X, formaldehyde 2,5M, nước không có ARNse, pH=7). Dung dịch đặt mẫu 2X gồm: Bromophenol blue 0,1%, EDTA 1,6mM, formaldehyde 0,36M, glycerol 8%, formanid 12,04%, FA gel buffer 1,6M. Quá trình điện di được thực hiện ở hiệu điện thế 30V cho đến khi buffer đặt mẫu di chuyển được khoảng 3/4 gel. Nhuộm với ethidium bromid 10mg/ml và quan sát mẫu dưới tia UV.
+ Quy trình phản ứng RRT-PCR: ARN virus PRRS chuẩn do trung tâm chẩn đoán xét nghiệm Ploufragan (Pháp) cung cấp.
Chế độ nhiệt trong quy trình phản ứng RRT-PCR
Bước Hoạt động Nhiệt độ Thời gian 1 Phiên mã ngược 48°C 30 phút 2 Tiền biến tính 95°C 10 phút 3 Biến tính 95°C 15 giây 4 Bắt cặp và kéo dài 60°C 2 phút 5 Lặp lại bước 3 và 4 trong 40 chu kỳ 6 Hoàn thành 72°C 7 phút 7 Giữ sản phẩm 4°C