cây trồng trong ựiều kiện in vitro
Trong kỹ thuật vi nhân giống, nhiều chỉ số về ựặc tắnh tăng trưởng và sự phát sinh hình thái của cây in vitro và ex vitro bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố môi trường như ánh sáng (chất lượng, cường ựộ, thời gian và hướng chiếu sáng), nhiệt ựộ, thành phần các khắ (CO2, O2, H2O, C2H4) và thành phần môi trường nuôi cấy (Kozai et al., 1993).
Trong tự nhiên, thành phần khắ CO2 trong không khắ rất quan trọng, nó cung cấp cho cây nguồn carbon ựể quang hợp. Sự giảm khắ CO2 trong môi trường nuôi cấy có ựường dần dần làm cho cây quang hợp kém và dẫn tới tỷ lệ sống sót thấp khi cây chuyển ra vườn ươm (Nhut et al., 2004).
Khả năng quang hợp và sinh trưởng của cây in vitro bị hạn chế bởi nồng ựộ khắ CO2 cung cấp cho cây trong bình nuôi cấy không ựủ trong suốt thời gian chiếu sáng (Desjardins et al., 1988; Kozai et al., 1991).
Nồng ựộ khắ CO2 trong bình thấp hơn nồng ựộ khắ CO2 bên ngoài thì có thể cung cấp khắ CO2 cho cây nuôi cấy bằng cách sử dụng màng Milliseal thoáng khắ. Sự trao ựổi khắ có thể ựược gia tăng nhiều lần bằng màng thoáng khắ ựặt trên nắp hay bên thân bình nuôi cấy. Khối lượng tươi, khối lượng khô, chiều cao, diện tắch lá bị ảnh hưởng bởi tương tác giữa nồng ựộ khắ CO2 và tốc ựộ trao ựổi khắ ở bình nuôi cấy (Kozai et al.,1988). Khi trao ựổi khắ tăng thì khối lượng tươi, khối lượng khô, chiều cao, diện tắch lá và nồng ựộ chlorophyll cũng gia tăng (Jeong et al., 1996).
Tác ựộng của ựộ thoáng khắ của các loại bình nuôi cấy tới cây trồng trong ựiều kiện in vitroựã ựược nghiên cứu nhiều ở nước ngoài. Theo Tanaka et al., (1988), ở 25oC, 1 atm, trong thời gian 1 giây trên cm2, túi nilon có khả năng khuếch tán 2,2 x 10-8.cm3.O2, 9,6 x 10-8 cm3.CO2. điều nãy chứng tỏ, túi nilon thoáng khắ hơn bình thủy tinh. Ở các hệ thống nuôi cấy thoáng khắ, nồng ựộ ethylene và ựộ ẩm trong hệ
thống giảm, do ựó khả năng hấp thụ khoáng chất cũng như các ựặc ựiểm sinh lý của các mẫu in vitro ựều tốt hơn so với các hệ thống bình nuôi cấy truyền thống (Kirdmanee et al., 1995). Các mẫu cấy phát triển trong ựiều kiện quang tự dưỡng (thoáng khắ tự nhiên và thoáng khắ bắt buộc) cũng cho thấy tạo nhiều chồi và rễ hơn những mẫu phát triển trong hệ thống quang dị dưỡng (Zobayed et al., 1999).
Majada J.P. et al., (2000), khi nuôi cấy Dianthus caryophyllus cv. Nelken trong ống nghiệm với các khoảng thoáng khắ khác nhau (ở 0,11, 0,21, 0,68 và 0,86 h-1). Kết quả cho thấy sự thoáng khắ làm cho cây có lớp biểu bì dày hơn, làm giảm kắch thước tế bào và gian bào so với cây trong túi không thoáng khắ, giúp cứng chồi nhân nhanh in vitro và cứng cây khi ựưa ra vườn ươm hơn, giúp cây thắch nghi với ựiều kiện tự nhiên hơn.
Fal M.A. et al., (2002) bằng thực nghiệm nghiên cứu sự sinh trưởng, hình thái của Dianthus caryophyllus L. ựược nuôi cấy trong cùng ựiều kiện ánh sáng, ựộ ẩm ở trong những bình nuôi cấy tốc ựộ thoáng khắ khác nhau. Kết quả cho thấy khối lượng khô của cây tăng dần với ựộ thoáng khắ từ 0,02h-1 ựến 1,1h-1.
Winarto B. et al., (2004) nghiên cứu tác ựộng ựộ thoáng khắ của túi nuôi cấy và chất tạo gel trong môi trường nuôi cấy. Kết quả cho thấy cây bị thủy tinh ựã giảm ựáng kể khi sử dụng loại nút bông và nắp nhựa.
Ở trong nước, một số nghiên cứu cũng cho biết ựiều kiện nuôi cấy thoáng khắ có ảnh hưởng rõ rệt lên quá trình tăng trưởng của cụm chồi cây in vitro: trong ựiều kiện thoáng khắ, cây in vitro có biểu hiện tăng về các chỉ tiêu như số lá, số rễ, trọng lượng tươi và hàm lượng một số chất bên trong.
Dương Tấn Nhựt và cs (2004a) tiến hành nghiên cứu cải tiến hệ thống nhân giống cây dâu tây bằng nuôi cấy trong túi nilon có màng thoáng khắ. Bình thủy tinh ựược sử dụng làm ựối chứng. Kết quả cho thấy, khả năng tái sinh mô sẹo từ lá, số lượng chồi hình thành từ một cụm mô sẹo có nguồn gốc từ nuôi cấy lá trong hệ thống túi nilon ựều cao hơn so với hệ thống nuôi cấy bằng bình thủy tinh. điều ựó chứng tỏ, sự thoáng khắ của hệ thống bình nuôi cấy có vai trò quang trong trong nuôi cấy. Ngoài ra, sự thoáng khắ của bình giúp cho việc thải bớt lượng khắ ethylene
sinh ra trong quá trình nuôi cấy và duy trì chúng ở mức ựộ vừa phải không gây ựộc cho mẫu nuôi cấy (Nhut et al., 2004b).
Trong nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cs (2004b) trên hoa Lily cho thấy: sự sinh trưởng và phát triển của các cây trong hệ thống thoáng khắ trong ựiều kiện in vitro và ex vitro tốt hơn rất nhiều so với những cây ựược nuôi cấy trong hệ thống không thoáng khắ.
Nguyễn Trắ Minh và cs (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của cường ựộ ánh sáng và hàm lượng CO2 lên khả năng sinh trưởng in vitro và ex vitro cây dâu tây. Thắ nghiệm bao gồm hai mức thay ựổi nồng ựộ CO2 (400 và 1000 mol/mol) và cường ựộ ánh sáng (100 và 200 ộmol/m2/s). Kết quả cho thấy khối lượng tươi của chồi, rễ và tỷ số khối lượng tươi của rễ/chồi vào các ngày 14,21 và 28 ựều gia tăng một cách có ý nghĩa ở các công thức có nồng ựộ CO2 cao so với công thức có nồng ựộ CO2 thấp.
điều kiện thoáng khắ kết hợp với sự gia tăng cường ựộ chiếu sáng sẽ tạo ựiều kiện thuận lợi ựể mẫu cấy có thể quang hợp, dẫn ựến hạn chế hay loại bỏ việc bổ sung nguồn carbon hữu cơ vào môi trường dinh dưỡng (Vũ Ngọc Lan, 2012). Nhờ ựó, có thể giảm lượng ựường bổ sung vào môi trường, từ ựó giảm tỉ lệ nhiễm và tăng chất lượng cây in vitro.
Tương tự nghiên cứu của Lê Thị Xuân (2012) có chỉ ra rằng sử dụng nút nilon có màng thoáng khắ cho hiệu quả tốt nhất trên cả hai giống Hồng Ngọc và Hồng Hạc khi nuôi cây trong bình trụ trên môi trường MS + 0,5mg/l BA + 0,4mg/l IBA.
Vũ Ngọc Lan và cs (2013), nghiên cứu nhân nhanh quy mô công nghiệp cây giống Dendrobium nobile Lindl. ựã so sánh giữa nuôi cấy mô hệ thống truyền thống (môi trường ựặc sử dụng nút bông) với hệ thống cải tiến (sử dụng nút màng thoáng khắ). Kết quả cho thấy: nuôi cấy ựặc thoáng khắ giúp tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy truyền thống.
Như vậy, sự thoáng khắ ảnh hưởng lớn tới sự sinh trưởng, phát triển của cây nuôi cấy in vitro.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP