Ánh sáng nhân tạo trong nuôi cấy mô có tác dụng trong việc quang hợp ựể tổng hợp các chất dinh dưỡng nuôi sống cây. Sự phân phối phổ ánh sáng, quang kỳ và hướng chiếu sáng cũng ựóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật nuôi cấy mô. Hiện nay, ánh sáng trắng (phổ ánh sáng từ khoảng 200 nm ựến 800 nm) của ựèn huỳnh quang ựược sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thắ nghiệm nuôi cấy mô. Ánh sáng ựơn sắc từ ựèn LED (light Ờ emitting diodes) cũng ựã và ựang ựược nghiên cứu làm nguồn sáng trong nhân giống thực vật. Sử dụng ánh sáng ựơn sắc ựỏ (600 - 700 nm) hoặc ựỏ xa (700 - 800 nm) hoặc kết hợp với xanh lam của ựèn LED làm cây tăng trưởng rất tốt và tiết kiệm ựiện
năng hơn so với dùng ựèn huỳnh quang.
Một trong những yếu tố của môi trường ảnh hưởng lên quá trình tạo rễ của mẫu cấy là ánh sáng. Ánh sáng góp phần vào việc tạo rễ và chồi bất ựịnh của ựoạn cắt. Ánh sáng có cường ựộ thấp thuận lợi cho quá trình tạo rễ. Ánh sáng ựỏ cam thắch hợp cho sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời.
Hughes (1981) ựã chỉ ra sự phát sinh hình thái thực vật và sự tăng trưởng chồi bị ảnh hưởng bởi các nhân tố của môi trường như nhiệt ựộ, CO2, chất dinh dưỡng, chất lượng ánh sáng, thời gian và cường ựộ chiếu sáng.
Công trình nghiên cứu của Ziv (1991) và Debergh et al.,(1992) ựã cho thấy cường ựộ chiếu sáng có tác dụng ựiều hòa kắch thước lá và thân cũng như con ựường phát sinh hình thái ựồng thời ảnh hưởng ựến sự hình thành sắc tố và thủy tinh thể của cây con. Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng quan trọng trên một số ựặc tắnh hình thái như sự kéo dài ở cây cúc và cây cà chua (Mortensen and Stromme, 1987), sự hình thành chồi bất ựịnh ở cây nho (Chee, 1986; Chee and Pool, 1989), hình thái giải phẫu lá và kắch thước lá ở cây Phong (Soebo and et al.,1995) và sự phát sinh rễ giả ở cây lê (Bertazza and et al.,1995).
Thời gian chiếu sáng
Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Với ựa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thắch hợp là 8 - 12 h/ngày. Tuy nhiên, một số loài cần thời gian chiếu sáng tới 16 h/ngày như loài ựu ựủ Carica papapaya L. (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs, 2013), khoai môn sọ (Nguyễn Quang Thạch và cs.,2010).
Cường ựộ ánh sáng
Cường ựộ ánh sáng từ 1000 - 2500 lux ựược dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô. Cường ựộ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng ựến khả năng nuôi cấy in vitro ở những cây có diệp lục tố, mức cường ựộ ánh sáng ựiển hình cho vi nhân giống là từ 40 - 80 ộmol/m2/giây. Với cường ựộ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng thúc ựẩy quá trình tạo rễ. Theo Ammirato (1987), ánh sáng ở cường ựộ cao tạo ựiều kiện cho sự sinh trưởng của mô sẹo, ở cường ựộ trung bình kắch thắch tạo chồi; ngoài ra, ở cường ựộ thấp sẽ gia tăng chiều cao và có màu xanh ựậm.
Quang phổ ánh sáng
Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường ựộ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng có bước sóng quang trọng nhất cho quang hợp và sự phát sinh quang hình thái là từ 400 - 800 nm. Chất lượng ánh sáng cũng làm thay ựổi phản ứng sinh trưởng của chồi in vitro. Nuôi cấy cây phong lữ (Pelargonium) trong ánh sáng ựỏ làm tăng chiều dài chồi hơn so với ánh sáng trắng, trong khi ựó ánh sáng xanh làm giảm sự kéo dài chồi. Ánh sáng ựỏ có hiệu quả quang hợp rất cao. Ở cùng một cường ựộ chiếu sáng, nếu là ánh sáng ựỏ thì hiệu quả quang hợp có thể tăng gấp ựôi so với ánh sáng xanh (blue).Tuy nhiên khả năng quang hợp cao nhất khi chồi cây bulo (Betula) ựặt trong ánh sáng xanh so với ánh sáng trắng hoặc ựỏ, ánh sáng xanh cũng kắch thắch phát sinh diệp lục và gia tăng kắch thước lá.
Chất lượng ánh sáng cũng có thể tác ựộng gián tiếp lên sự phát triển chồi và trong môi trường ánh sáng yếu sẽ thuận lợi cho rễ phát triển (Hartmann et al.,, 1997).