KHẢO sát KHẢ NĂNG THAY THẾ CHẤT điều hòa SINH TRƯỞNG của OLIGOCHITOSAN TRÊN HAI môi TRƯỞNG MURASHIGE SKOOG và KNUDSON c TRONG NUÔI cấy INVITRO LAN DENDROBIUM THONGCHAI GOLD

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ************ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THAY THẾ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG CỦA OLIGOCHITOSAN TRÊN HAI MÔI TRƯỞNG MURASHIGE & SKOOG VÀ KNUDSON C TRONG NUÔI CẤY INVITRO LAN DENDROBIUM THONGCHAI GOLD Giảng viên hướng dẫn: Th.S LÊ THỊ MỸ PHƯỚC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 Luận văn tốt nghiệp Mục lục MỤC LỤC MỤC LỤC TRANG Trang tựa Lời cảm ơn Mục lục i Danh sách chữ viết tắt v Danh sách hình vi Danh sách bảng vii Danh sách biểu đồ viii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH 1.3 YÊU CẦU CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 SƠ LƯỢC VỀ CHITIN, CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN 2.1.1 Giới thiệu chung Chitin, Chitosan Oligochitosan 2.1.1.1 Chitin 2.1.1.2 Chitosan 2.1.1.3 Oligochitosan 2.1.2 Nguồn Chitin, Chitosan, Oligochitosan 2.1.3 Phương pháp chế tạo Chitin, Chitosan, Oligochitosan 10 2.1.3.1 Phương pháp chế tạo Chitin 10 2.1.3.2 Phương pháp chế tạo Chitosan 11 2.1.3.3 Phương pháp chế tạo Oligochitosan 12 2.1.4 Ứng dụng Chitin, Chitosan, Oligochitosan 17 2.1.4.1 Ứng dụng lĩnh vực nông nghiệp công nghệ sinh học .17 2.1.4.2 Tác nhân cationic xử lý nước 19 2.1.4.3 Chitosan dùng y học 19 2.2 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ LAN DENDROBIUM THONGCHAI GOLD 21 2.2.1 Giới thiệu họ lan 21 2.2.1.1 Đặc điểm chung 21 2.2.1.2 Đặc điểm phân loại 23 2.2.2 Giới thiệu Dendrobium thongchai gold 25 2.2.2.1 Vị trí phân loại 25 i Luận văn tốt nghiệp Mục lục 2.2.2.2 Nguồn gốc phân bố 2.2.2.3 2.2.2.4 2.2.2.5 2.2.2.6 2.2.2.7 Giới thiệu lan Dendrobium thongchai gold 2.3 SƠ LƯỢC VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO 2.3.1 Sơ lược phương pháp nhân giống truyền thống 2.3.2 Lịch sử thành tựu đạt đư 2.3.3 Mục đích ứng dụng thực tiễn 2.3.3.1 2.3.3.2 Ứng dụng thực tiễn 2.3.4 Tầm quan trọng nuôi cấy mô t 2.3.4.1 Ý nghĩa sinh học 2.3.4.2 2.3.5 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thự 2.3.5.1 2.3.5.2 2.3.5.3 2.3.5.4 2.3.5.5 2.3.5.6 Các chất điều hòa sinh trưởng 2.3.5.7 2.3.5.8 2.3.5.9 2.3.6 Những vấn đề nhân giống in CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 3.1.1 Địa điểm 3.1.2 Thời gian 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 3.3.1 Mẫu cấy mô thực vật 3.3.2 Mẫu Oligochitosan 3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm 3.3.4 Môi trường nuôi cấy mô thực vật 3.4 ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM ii Luận văn tốt nghiệp Mục lục 3.5 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 47 3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả tạo chồi môi trường MS bổ sung OligoChitosan có Mw ~ 3,5 kDa nồng độ khác nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 47 3.5.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả tạo chồi môi trường KC bổ sung OligoChitosan có Mw ~ 3,5 kDa nồng độ khác nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 48 3.5.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả tạo chồi môi trường MS bổ sung OligoChitosan có Mw ~ 7,5 nồng độ khác nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 49 3.5.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả tạo chồi môi trường KC bổ sung OligoChitosan có Mw ~ 7,5 kDa nồng độ khác nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 50 3.6 XỬ LÝ THỐNG KÊ 52 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng Oligochitosan có khối lượng phân tử 3,5 KDa bổ sung vào môi trường MS lên khả tạo chồi nồng độ khác nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 53 4.2 Ảnh hưởng Oligochitosan có khối lượng phân tử 3,5 KDa bổ sung vào môi trường KC lên khả tạo chồi nồng độ khác nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 59 4.3 So sánh hiệu ứng kích Oligochitosan có khối lượng phân tử Mw ~3,5 KDa lên khả tạo chồi hai môi trường khác 64 4.4 So sánh hiệu ứng kích thích chiều cao chồi hai loại mơi trường MS KC bổ sung Oligochitosan (Mw~3,5) vào môi trường nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 65 4.5 Ảnh hưởng Oligochitosan có khối lượng phân tử 7,5 KDa bổ sung vào môi trường MS lên khả tạo chồi nồng độ khác nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 67 4.6 Ảnh hưởng Oligochitosan có khối lượng phân tử 7,5 KDa bổ sung vào môi trường KC lên khả tạo chồi nồng độ khác nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 72 4.7 So sánh hiệu ứng kích Oligochitosan có khối lượng phân tử Mw ~7,5 KDa lên khả tạo chồi hai môi trường khác 77 4.8 So sánh hiệu ứng kích thích chiều cao chồi hai loại mơi trường MS KC bổ sung Oligochitosan (Mw~7,5) vào môi trường nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 78 iii Luận văn tốt nghiệp Mục lục Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 79 5.2 KIẾN NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC 84 iv Luận văn tốt nghiệp Danh mục bảng biểu DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Mw KDa ĐC SVĐC EDTA : Molecular weight : Kilo Dalton : Đối chứng : So với đối chứng : Ethylene diamin-tetra-acetic acid Chất điều hoà tăng trưởng BA : 6-benzyl adenin GA3 : Gibberellin IAA : Indole-3-acetic acid NAA : Naptalen Acetic Acid 2,4 D : Acid 2,4 – Dichlorophenoxy Acetic Môi trường MS : Murashige Skoog (1962) KC : Knudson C v Luận văn tốt nghiệp Danh mục bảng biểu DANH MỤC HÌNH HÌNH Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 2.6 Hình 2.7 Hình 3.1 Hình 4.1 Hình 4.2 Hình 4.3 Hình 4.4 TRANG Cấu trúc phân tử chitin Chitin vỏ tôm Cấu trúc phân tử chitosan Một số giống hoa đẹp họ Orchidaceae 24 Lan Dendrobium thongchaigold 24 Một số dạng hoa đẹp Dendrobium 33 Tổng quan lan Dendrobium 33 Chồi Lan Dendrobium sử dụng thí nghiệm 45 Một số hình ảnh thu từ nghiệm thức Oligochitosan(Mw~3,5 KDa) , mơi trường MS 58 Một số hình ảnh thu từ nghiệm thức Oligochitosan(Mw~3,5 KDa) , môi trường KC 63 Một số hình ảnh thu từ nghiệm thức Oligochitosan(Mw~7,5 KDa) , môi trường MS 71 Một số hình ảnh thu từ nghiệm thức Oligochitosan (Mw~7,5 KDa) , môi trường KC 76 vi Luận văn tốt nghiệp Danh mục bảng biểu DANH MỤC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu Đồ 2.1 Ảnh hưởng liều xạ khối lượng phân tử chitosan chiếu xạ tình trạng rắn 16 Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử 3,5 KDa lên khả tạo chồi (a) chiều cao chồi (b) nuôi cấy in vitro lan Dendrobium môi trường MS 54 Biểu Đồ 4.2 Ảnh hưởng nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử 3,5 KDa lên khả tạo chồi (a) chiều cao chồi (b) nuôi cấy in vitro lan Dendrobium môi trường KC 60 Biểu đồ 4.3 Sự gia tăng chồi hai loại môi trường MS KC bổ sung Oligochitosan ( Mw~3,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy in vitro lan Dendrobium nồng độ khác 64 Biểu đồ 4.4 Sự gia tăng chiều cao chồi hai loại môi trường MS KC bổ sung Oligochitosan ( Mw~3,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy in vitro lan Dendrobium nồng độ khác 66 Biểu Đồ 4.5 Ảnh hưởng nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử 7,5 KDa lên khả tạo chồi (a) chiều cao chồi (b) nuôi cấy in vitro lan Dendrobium môi trường MS 68 Biểu Đồ 4.6 Ảnh hưởng nồng độ Oligochitosan có khối lượng phân tử 7,5 KDa lên khả tạo chồi (a) chiều cao chồi (b) nuôi cấy in vitro lan Dendrobium môi trường KC 73 Biểu đồ 4.7 Sự gia tăng chồi hai loại môi trường MS KC bổ sung Oligochitosan ( Mw~7,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy in vitro lan Dendrobium nồng độ khác 77 Biểu đồ 4.8 Sự gia tăng chiều cao chồi hai loại môi trường MS KC bổ sung Oligochitosan (Mw~7,5 KDa) vào môi trường vào môi trường nuôi cấy in vitro lan Dendrobium nồng độ khác 78 vii Luận văn tốt nghiệp Danh mục bảng biểu DANH MỤC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Enzyme thủy phân polysaccharide tương ứng 13 Bảng 3.1 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng Oligochitosan có Mw ~ 3,5 KDa bổ sung vào môi trường nồng đồ khác lên khả tạo chồi nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 48 Bảng 3.2 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng Oligochitosan có Mw ~ 3,5 KDa bổ sung vào môi trường nồng đồ khác lên khả tạo chồi nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 49 Bảng 3.3 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng Oligochitosan có Mw ~ 7,5 KDa bổ sung vào môi trường nồng đồ khác lên khả tạo chồi nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 50 Bảng 3.4 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng Oligochitosan có Mw ~ 7,5 KDa bổ sung vào môi trường nồng đồ khác lên khả tạo chồi nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 51 Bảng 4.1 Ảnh hưởng Oligochitosan có Mw ~ 3,5 kDa bổ sung vào môi trường MS nồng đồ khác lên khả tạo chồi nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 53 Bảng 4.2 Ảnh hưởng Oligochitosan có Mw ~ 3,5 KDa bổ sung vào môi trường KC nồng đồ khác lên khả tạo chồi nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 59 Bảng 4.3 Ảnh hưởng Oligochitosan có Mw ~ 7,5 KDa bổ sung vào môi trường MS nồng đồ khác lên khả tạo chồi nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 67 Bảng 4.4 Ảnh hưởng Oligochitosan có Mw ~7,5 KDa bổ sung vào môi trường KC nồng đồ khác lên khả tạo chồi nuôi cấy in vitro lan Dendrobium 72 viii Luận văn tốt nghiệp Giới thiệu CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ: Trong năm gần với sách mở rộng đầu tư mặt Nhà nước, đời sống vật chất tinh thần người dân ngày cải thiện nâng cao Song song với nhu cầu vật chất nhu cầu tinh thần đặc biệt thiếu Từ lâu người thích trồng hoa, cảnh vừa để trang trí cho đẹp, vừa để giải trí tinh thần Mỗi người thích trồng lồi hoa khác nhau, việc lựa chọn loài hoa thường tuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu vùng đó, vẻ đẹp hoa, hoa trồng chăm sóc hay khơng Hoa lan nhiều người ưa thích, lẽ hoa lan có cấu trúc kiêu kì phức tạp, phận mơi có nét chạm trổ tinh vi, lại phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam, dễ chăm sóc người chọn loại hoa lan thích tuỳ theo túi tiền mà thoả mãn thú vui tao nhã Phong lan nước ta phong phú đa dạng, có nhiều giống khác như: Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Mokara, Vanda, Dendrobium… chúng cho hoa đẹp mang nhiều màu sắc khác Nó dùng để trang trí, trưng bày, làm đẹp, dùng buổi lễ… hay người ta bán hoa cắt cành - kinh doanh Trong số có lẽ Dendrobium giống đặc sắc từ màu sắc, dạng hoa giống loài Mặt khác, Dendrobium dễ trồng, siêng hoa lâu tàn Do ưa chuộng trồng phổ biến nước ta nhằm phục vụ cho nhu cầu sống Ngày nay, việc nhân giống trồng in vitro khơng cịn xa lạ Với đóng góp vào nhiều thành tựu to lớn lĩnh vực nhân giống trồng, nói phương pháp tốt hiệu để nhân giống thực vật Bằng phương pháp tạo nhiều giống với thời gian ngắn, đa phần giống lan thương phẩm nhân giống phương pháp nuôi cấy mô Trước đây, người ta thường dùng mơi trường dinh dưỡng có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng để ni cấy in vitro tế bào thực vật Tuy nhiên, chất điều hòa sinh trưởng đắt Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu thu chất dinh dưỡng, chúng bao lớp mô hút ẩm dày, bao gồm lớp tế bào chết chứa đầy khơng khí, ánh lên màu xám bạc Ngồi ra, cịn có nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ khỏi bị gió Hệ rễ phát triển nhiều hay phụ thuộc vào hình dạng chung thể (Trần hợp, 2000; Nguyễn Cơng Nghiệp, 2000) - Ở lồi sống hoại rễ có dạng búi nhỏ dày đặc vòi hút ngắn hút chất dinh dưỡng từ đám xác thực vật (sau nấm phân hủy) Nhiều loài lại có hệ rễ đan thẳng thành búi chằng chịt, nơi thu gom mùn vỏ để làm nguồn dự trữ chất dinh dưỡng (Trần hợp, 2000; Nguyễn Công Nghiệp, 2000)  Thân : Dendrobium thuộc nhóm đa thân (sympodial) Đây nhóm gồm tăng trưởng liên tục mà có chu kỳ nghỉ sau mùa tăng trưởng Dendrobium vừa có thân thật vừa có giả hành Giả hành thân lại chứa diệp lục, dự trữ nước nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển giả hành Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngồi có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh nước mặt trời hun nóng Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên với lá, làm nhiệm vụ quang hợp Thường lồi thuộc giống Dendrobium dùng cho mục đích kinh doanh lan đa thân với nhiều giả hành (Trần Hợp, 2000)  Lá: Phong lan tự dưỡng, phát triển đầy đủ hệ thống lá, có nhiều kiểu khác nhau, có mỏng mềm, có dai cứng có mọng nước , có dẹt, dài hình trụ Về màu sắc, phiến thường có màu xanh bóng, đơi hai mặt có màu sắc khác (thường mặt có màu xanh đậm hay tía), mặt lại khảm thêm nhiều màu sặc sỡ (Trần Hợp, 2000)  Hoa: Hoa mọc từ thân thành chùm hay hoa cô độc Các chồi hoa mọc giả hành mà mọc giả hành củ Bên hoa có cột nhị nhụy nằm hoa, mang phần đực phía 27 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu phần (đầu nhụy) mặt trước Cột thường dài, thẳng hay cong phía trước Nhị đực gồm hai phần, bao phấn hốc phấn Bao phấn nằm cột nhị nhụy Cịn hốc phấn lõm lại, mang khối phấn thường song song với bao phấn Khối phấn gồm toàn hạt phấn dính lại với nhau, cứng có tinh bột, sáp hay chất sừng Vì giống Dendrobium hoa cho số lượng cành hoa nhiều loài lan khác Chính ngày chiếm ưu thị trường hoa cắt cành Hầu dòng họ giống Dendrobium loài hoa lâu tàn, trung bình từ 1÷2 tháng (Trần Hợp, 2000; Nguyễn Cơng Nghiệp, 1998)  Quả: Quả phong lan thuộc loại nang, nở theo - đường nứt dọc Khi chín mở mảnh vỏ cịn dính lại với phía đỉnh phía gốc Ở số lồi mở theo - khía dọc, chí khơng nứt ra, hạt khỏi vỏ vỏ mục nát  Hạt: Hạt cấu tạo phơi chưa phân hố, máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy khơng khí Hạt nhiều nhỏ bé, trọng lượng toàn hạt nặng phần mười đến phần ngàn milligam (Trần Hợp, 2000) 2.2.2.5 Các điều kiện để nuôi trồng lan Dendrobium sp.:  Nhiệt độ Nhiệt độ tác động lan qua đường quang tổng hợp, cường độ quang hợp gia tăng theo nhiệt độ, thường nhiệt độ tăng 10% tốc độ quang hợp tăng lên gấp đơi Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoa số lồi lan lan Bạch câu Dendrobium crumenatum địi hỏi giảm nhiệt độ khoảng 5-6 oC vài o giây ngày sau chúng nở hoa đồng loạt Ở 18,5 Dendrobium nobile tăng trưởng mà không hoa chúng hoa nhiệt độ hạ xuống 13 oC hay thấp Căn vào nhu cầu nhiệt độ, tạm chia Dendrobium thành hai nhóm chính: 28 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu o - Nhóm ưa lạnh sinh trưởng phát triển tốt nhiệt độ lý tưởng 15 C, gồm giống lấy từ vùng cao nguyên độ cao 1.000m loài trồng nhiệt độ cao 25 oC, sống, sống hoa o - Nhóm ưa nóng, nhiệt độ thích hợp cho lồi nhóm 25 C, gồm đa số giống Dendrobium vùng nhiệt đới, loài giống Dendrobium lai trồng thành phố Hồ Chí Minh tỉnh phía Nam… - Ngồi ra, cịn có nhóm Dendrobium trung gian sống vùng lạnh vùng nóng, vùng lạnh sinh trưởng hoa nhiều Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhiệt độ lý tưởng loài o 20 C  Ẩm độ Các lan, phong lan, sống bám cao, chúng lấy nước từ trận mưa, từ nước không khí Chính ẩm độ định diện lồi phong lan Thơng thường ẩm độ tương đối tối thiểu 70% thích hợp cho tăng trưởng nhiều loài Tuy nhiên ẩm độ lý tưởng ẩm độ vùng xứ mà loài lan tìm thấy Dendrobium đa số giống lan khác phát triển tốt khơng khí ẩm thoáng Ẩm độ tương đối cần thiết 40 - 70% Cấu tạo giá thể ẩm úng rễ bị thối biểu keiki mọc từ phần thân  Ánh sáng Ánh sáng điều kiện cần thiết cho sinh trưởng phát triển lan thơng qua q trình quang hợp Đây yếu tố định trổ hoa lan Dendrobium giống ưa sáng, trồng điều kiện ánh sáng trực tiếp hay khuếch tán Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium 70% Nếu thừa ánh sáng, bị vàng lá, giả hành bị teo lại, xấu thích nghi dần, 29 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu hoa nhiều đẹp Nếu thiếu ánh sáng, bị thối hóa rõ rệt, èo uột số lượng hoa  Nhu cầu phân bón Dendrobium thân đứng đòi hỏi dinh dưỡng cao, chúng cần nhiều phân bón dùng nhiều dạng phân bón khác Cịn loại Dendrobium thân thịng hấp thu phân chậm nên phải dùng nồng độ thật loãng Các loại phân hữu như: phân heo, bánh dầu khơ, phân tơm cá, phân trâu bị khơ… dùng tốt cách pha loãng với nước tưới, vò chặt viên đặt bề mặt giá thể, rễ lan hấp thụ dưỡng chất phóng thích qua q trình tưới nước Các loại phân vơ dùng thường có cơng thức 30-10-10 dùng lần/tuần với nồng độ muỗng cà phê/4lít Trong suốt mùa tăng trưởng, ta bón phân 10-20-30 làm lần/tuần để tạo sức chịu đựng cho trước bước vào mùa nghỉ Trong mùa tăng trưởng có nụ hoa, ta thay phân 30-10-10 phân 10-20-20 với chu kỳ bón hoa tàn Trong mùa nghỉ hoàn toàn khơng bón phân cho Dendrobium, hay giảm khơng bón phân cho Dendrobium hồn tất thời kì tăng trưởng năm Khơng nên dùng loại phân riêng rẽ, thường phân bón dùng dạng hỗn hợp bổ sung thêm chất phụ gia sinh tố nguyên tố vi lượng  Sâu bệnh vấn đề khác Vì lan Dendrobium cần bón nhiều loại phân hữu khác môi trường sơ dừa mục nát sau thời gian ngắn trồng Đây nguyên nhân gây nhiều sâu bệnh hại Một loại rệp dính màu vàng, kích thước bé thường xuất bề mặt Loại gây tác hại qua việc hút nhựa Đối với lồi trùng cắn phá Dendrobium loại trừ chúng tương đối dễ dàng Serpa, Bassa, nồng độ 1/500 Mặc dù Dendrobium kháng bệnh mạnh, nhiên bị nấm virus công điều kiện vệ sinh Nguy hiểm bệnh khô 30 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu thân gần gốc giả hành loài virus thâm nhập làm cho giả hành bị khô chết Có thể ngừa bệnh cách nửa tháng xịt Topsil, Zineb, Benomyl với nồng độ 1/400 (tài liệu internet:http://agriviet.com/dd/86-nhan-giong-lan-bang-phuongphap-gieo-hat-invitro/) 2.2.2.6  Giá trị kinh tế Nhu cầu hoa tươi nói chung hoa lan nói riêng tồn giới Việt Nam ngày tăng Do mà nuôi trồng lan trở thành ngành kinh tế nhiều nước vùng lãnh thổ giới phát triển mạnh mẽ khu vực Đông Nam Á  - Từ lâu, lan sử dụng y học thực phẩm: Được liệt kê dược cổ điển Hy Lạp, Trung Quốc vùng Tiểu Á, chúng phơi khô, xắt nhỏ làm thuốc giảm đau thuốc kích thích - Zao C cộng (2002) tách chiết copacamphane, picrotoxane, alloarmadendrane sesquiterpene, glycoside, phenolic glycoside từ thân Dendrobium moniliforme Bên cạnh đó, cịn ly trích nhóm hóa chất dendromoliside đánh dấu từ A – D Bước đầu thử nghiệm cho thấy chất làm tăng số lượng tế bào B ức chế tăng sinh tế bào I invitro - Gao J cộng (2003) quan sát mô tuyến ức ni mơi trường có chứa dịch chiết từ protocom Dendrobium thấy trọng lượng mô tăng, làm tăng khả phagocyte tốc độ biến đổi lymphocyte - Một tộc Indonesia dùng Dendrobium sallacense nấu với cơm người Việt Nam Đồng song Cửu Long nấu cơm với dứa Ngoài ra, giả hành dùng làm trà lấy sợi thân phơi khô để làm kiềng đeo tay (Dương Công Kiên, 2006) 2.2.2.7 Giới thiệu lan Dendrobium thongchai gold Rễ Dendrobium phù hợp với nhiều điều kiện sống: rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn sống đất Rễ chúng không chịu lạnh, bị lạnh thời gian dài, rễ bị mục nát bị chết Thân có hệ thống nhánh nằm ngang bị dài giá nằm sâu đất gọi thân rễ Thân nhẵn hay có nhiều vảy thái hóa phần thẳng đứng mang Các bao hợp thành thân giả hay gọi giả hành 31 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu Củ lan (giả hành) đoạn phình to, bên có mơ mềm chứa dịch nhầy làm giảm nước dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy điều kiện khô hạn sống bám cao Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng Dạng mềm mại, mọng nước, nạc, dài, có màu xanh bóng Phiến trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung quạt hay gấp lại theo gân hình chữ V Hoa mọc thành chum đơn, kép hay hoa riêng lẻ, có hoa lâu tàn, trung bình – tháng Bao hoa có hai vịng ba mảnh bao gồm ba nhánh đài cánh tràng 32 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu Hình 2.6 Một số dạng hoa đẹp Dendrobium Hình 2.7 Tổng quan lan Dendrobium 33 Luận văn tốt nghiệp 2.3 Tổng quan tài liệu SƠ LƯỢC VỀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO 2.3.1 Sơ lược phương pháp nhân giống truyền thống Trong nhân giống người ta thường áp dụng hai kỹ thuật truyền thống nhân giống hữu tính nhân giống vơ tính - Nhân giống hữu tính nhờ hạt: Thu hạt từ phép lai khác sau gieo lên mơi trường đất Tuy nhiên, nhân giống phương pháp tốn nhiều thời gian tạo không đồng mặt di truyền - Nhân giống vơ tính: Trong vườn ươm người ta tiến hành nhân giống vơ tính cách giâm cành, chiết cành, ghép cành, ghép chồi, phải khoảng thời gian dài để thu kết Phương pháp nhân giống vơ tính có ưu điểm trì đặc tính bố mẹ, đồng thời phương pháp sử dụng để tạo ngân hàng gen trồng Tuy nhiên, phương pháp nhân giống vơ tính có trở ngại như: Chậm, khó thực hiện, đắt tiền 2.3.2 Lịch sử thành tựu đạt nuôi cấy mô thực vật Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là: Schleident va Schwann đưa thuyết tế bào nêu rõ thể sinh vật cho dù phức tạp đến đâu tạo nên bỡi kết hợp nhiều đơn vị nhỏ, tế bào Các tế bào phân hóa mang thơng tin di truyền giống hệt tế bào đầu tiên, trứng sau thụ tinh, đơn vị độc lập, xây dựng lại tồn thể từ thơng tin di truyền mà mang Haberlandt người thực nuôi cấy tế bào thực vật vào năm 1902 ông nhận thấy có ảnh hưởng khống chất điều kiện mơi trường chuyển hóa tế bào cô lập môi trường nuôi cấy Ông gặp thất bại cố gắng ni cấy tế bào chuyển hóa tách từ số mầm như: Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia Ngày nay, người ta biết rõ thất bại trên, ông nuôi cấy tế bào khả tái sinh (cây mầm đối tượng khó ni cấy invitro) Năm 1934 White nuôi cấy thành công thời gian dài đầu rễ cà chua mơi trường lỏng có chứa mi khoáng, glucose dịch chiết nấm men thời gian dài 34 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu Năm 1939, Gautheret Nobercout thành công việc trì sinh trưởng thời gian vơ hạn mô sẹo cà rốt môi trường thạch Năm 1941, Overbeek Mỹ chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng nước dừa ni cấy phôi họ Cà (Datura) nước dừa trình ni cấy Sau đó, năm 1948 Steward xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng nước dừa nuôi cấy mô sẹo cà rốt Thời gian nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin nghiên cứu tổng hợp thành công phương pháp hóa học Năm 1954, Skoog Mỹ, tình cờ nhận thấy bổ sung thêm chế phẩm để lâu acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy mảnh mơ thân thuốc mảnh mơ kích thích tăng trưởng rõ rệt Việc phát vai trò IAA, NAA, 2,4- D kinetin với vitamin nước dừa có ý nghĩa quan trọng lịch sử nuôi cấy mô thực vật Những phát giúp cho việc xây dựng môi trường nuôi cấy mô thực vật có thành phần hóa học xác định rõ ràng ổn định làm sở cho bước phát triển lĩnh vực khoa học Năm 1957, Skoog Miller ghi nhận hình thành quan từ mô sẹo thuốc chịu ảnh hưởng tỷ lệ kinetin/auxin môi trường nuôi cấy Sự tạo rễ từ mô sẹo xảy giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin ngược lại tỷ lệ kinetin/auxin tăng tạo chồi mơ sẹo tăng Hiện tượng sau xác định nhiều loại khác (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Khả ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy lĩnh vực nhân giống phục tráng trồng Năm 1960, Morel nhận thấy đỉnh sinh trưởng loài địa lan (Cymbidium) đem ni cấy hình thành protocorm Cắt protocorm đem nuôi cấy tiếp thu đươc protocorm Khi để điều kiện định protocorm phát triển thành lan 35 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu Trong giai đoạn nay, nuôi cấy mô thực vật ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất chất thứ cấp có hoạt tính sinh học vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật cao Nuôi cấy mô thực vật sử dụng chương trình chọn giống đại Ở Việt Nam, năm gần đây, nuôi cấy mô trở thành lĩnh vực quan tâm nhiều nhiều ngành trồng trọt Nuôi cấy mô có đóng góp to lớn việc phục tráng chọn giống trồng, góp phần vào phát triển ngành khoa học nông, lâm nghiệp (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) 2.3.3 Mục đích ứng dụng thực tiễn Tế bào xem đơn vị sinh lý hệ thống hồn chỉnh mang đầy đủ đặc tính sống, có khả tự điều chỉnh tự tái sinh, tế bào có tính tồn Tính tồn có lý thuyết, thực tế, tế bào khó biểu lộ tính chất thực vật loại đa bào, phát triển từ loại tế bào hợp tử, hợp tử phân cắt để tạo mơ quan khác hình dạng chức vụ Do đó, tế bào trường hợp khơng biểu tính tồn phải chịu ảnh hưởng tế bào khác Nếu ảnh hưởng bị vơ hiệu hóa, tế bào phản phân hóa tức non trẻ lại, phân chia, tăng trưởng, phân hóa tạo quan thành hồn chỉnh Do nhà sinh vật học tách tế bào mô đem nuôi cấy môi trường dinh dưỡng nhân tạo để quan sát phát triển chúng phương pháp nuôi cấy mơ tế bào 2.3.3.1 Mục đích Trước dùng phương pháp ni cấy tế bào mơ thực vật để nghiên cứu đặc tính tế bào phân chia, di truyền tác dụng hóa chất tế bào mô môi trường nuôi cấy Nhưng nuôi cấy mô thực vật hướng ứng dụng thực tiễn, liên hệ mật thiết với giống trồng (cây cảnh, lương thực, ăn quả, thuốc v.v…) nhà thực vật học áp dụng phương pháp với mục đích sau: 36 Luận văn tốt nghiệp - Tổng quan tài liệu Tạo quần thể lớn đồng thời gian tương đối ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện lý hóa kiểm sốt - Tạo nhiều từ mơ quan (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, chồi phát hoa v.v…), mà ngồi thiên nhiên khơng thể thực - Làm mầm virus cho mô phân sinh - Cải tiến giống trồng bằng: + Đa bội hóa mơ cấy + Gây đột biến nhân tạo + Lai giống: Tạo nhị bội đồng hợp tử từ cấy hạt phấn Cấy tế bào trần 2.3.3.2 Ứng dụng thực tiễn  Nhân giống vơ tính Cịn gọi nhân giống sinh dưỡng hay vi nhân giống (micro-propagation) - Mẫu cấy chồi ngọn, chồi bên hay chồi bất định - Mẫu cấy đoạn quan sinh dưỡng lóng thân, lá, rễ, biểu bì v.v… quan sinh dục đài, cành hoa, nhị đực v.v… Mô mẫu cấy phản phân hóa, với tỉ lệ điều hịa tăng trưởng thích hợp để trở thành trạng thái non trẻ, tế bào sinh mơ, tế bào phân cắt tạo thành khối khơng định hình gồm tế bào gồm giống nhau, chưa biệt hóa, cấu tạo khơng hồn tồn đồng mơ sẹo (callus) Mơ sẹo phân cắt phân hóa tạo chồi rễ Mơ sẹo cấy chuyền nhiều lần có khả tạo biến dị, tức tần số biến dị tăng theo số lần cấy chuyền, mô sẹo phải tăng sinh nên có vài tế bào lệch lạc phân cắt, giai đoạn anaphase tạo lệch bội hay đa bội, nên khơng cịn giữ ngun giống ban đầu  Nhân giống hữu tính Trong thiên nhiên có mà hạt khó nảy nầm hạt Lan (Orchidaceae) Hạt lan nhỏ vài trăm tế bào, khơng phơi nhũ, khơng có thân mầm, rễ mầm chồi mầm nên phải nhờ nấm cộng sinh để cung cấp chất 37 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu hữu cho phôi lan nảy nầm, nuôi cấy người ta thay nấm đường Hạt lan nảy mầm nhanh tạo 2.3.4 Tầm quan trọng nuôi cấy mô thực vật 2.3.4.1 Ý nghĩa sinh học Nuôi cấy mô mở khả to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc chất sống Thực tế cho phép tách nuôi cấy trước hết mô phân sinh cho mô sẹo, từ kích thích để tái sinh hồn chỉnh Trong q trình tạo hồn chỉnh từ mơ sẹo, gây thay đổi định hướng mức độ tế bào Đây ưu mà nhà sinh lý, hóa sinh di truyền học dễ dàng sử dụng công tác Trong thể, giai đoạn chu kỳ phát triển khó phân biệt cách cụ thể xác Tuy nhiên, khắc phục khó khăn dễ dàng tạo bước phát sinh hình thái phương pháp nuôi cấy mô Điều tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu quy luật sinh trưởng, phát triển mối quan hệ chúng với mơi trường bên ngồi Từ ta tìm mấu chốt thúc đẩy phát triển trồng theo chiều hướng mong muốn Ngoài ra, phương pháp ni cấy mơ tế bào cịn giải cách vấn đề bệnh lý Từ người ta tìm chế miễn dịch thực vật (Dương Tấn Nhựt, 2002) 2.3.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phương pháp nuôi cấy mô dùng để phục tráng nhân nhanh giống trồng q, có giá trị kinh tế cao Hiện phương pháp nhân giống vơ tính thực vật ống nghiệm trở thành kỹ thuật phổ biến Người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào công tác chọn giống trồng Những lợi ích sản xuất nơng nghiệp cơng nghiệp: - Kiểm sốt bệnh dịch trồng - Kiểm sốt chất lượng giống thơng qua kiểm soát kiểu gen giống khâu sản xuất - Kiểm sốt tồn kế hoạch từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch 38 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu - Tạo đồng loạt giống, từ tạo đồng loạt sản phẩm cuối Tóm lại, ni cấy mơ tế bào đem lại hiệu to lớn sản xuất nông nghiệp lâm nghiệp Đây thực cách mạng xanh trồng trọt 2.3.5 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy yếu tố quan trọng tăng trưởng phát sinh hình thái tế bào mô thực vật Môi trường nuôi cấy phải đáp ứng đầy tất ion vơ cần thiết cho q trình tăng trưởng Trong nhiều trường hợp, phải đáp ứng chất hữu bổ sung acid amin vitamin Nuôi cấy tế bào thực vật khơng có quan hợp địi hỏi thêm vào nguồn carbon cố định có agar (thường sucrose) Những chất hợp thành khác cần cho sống phải cần đáp ứng nước, dung mơi hịa tan chủ yếu Yếu tố vật lý nhiệt độ, pH, khơng khí, ánh sáng áp suất trì khoảng giới hạn chấp nhận (Bùi Trang Việt, 2002) 2.3.5.1 Nước Lưu ý chất lượng nước 95% mơi trường dinh dưỡng nước Nước cất bảo quản tốt chai polythene, thuỷ tinh thường chứa chì, natri, arsenic phóng thích vào nước Chai đựng nước phải rửa Không nên sử dụng nước máy có chứa cations (ammonium, calcium, magesium, sodium, iron…), anions (bicarbonate, chlorite, fluoride, phosphate…), vi sinh vật (tảo, nấm,vi khuẩn), chất khí (O 2, CO2, N) phần tử khác (bùn, dầu,chất hữu cơ…) 2.3.5.2 Agar Tải FULL (93 trang): https://bit.ly/3p3VEt1 Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net Xuất phát từ rong biển, sử dụng chất keo hầu hết môi trường dinh dưỡng Agar polysaccharide, trọng lượng phân tử cao có khả làm đơng mơi trường Agar hồ tan hình thành chất keo kết dính với nước hấp thụ hóa chất Nồng độ agar sử dụng nuôi cấy mô thường 0.6-0.8% Trong năm gần sử dụng môi trường hai pha (pha rắn pha lỏng) trở nên phổ biến tốc độ nhân giống cao giảm tượng thủy tinh thể Đầu tiên mẫu cấy đặt mơi trường rắn, sau thêm vào lớp 39 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu môi trường lỏng Một phần mẫu cấy môi trường lỏng, phần môi trường rắn, phần khơng khí Nếu ni cấy mơi trường lỏng cần phải cung cấp oxy tạo thống khí cách sử dụng máy lắc Tế bào, mô nuôi cấy bị tổn hại thường sinh trưởng phát triển tốt mẫu cấy hấp thu chất dinh dưỡng dễ dàng toàn mẫu cấy Ngoài ra, số tác nhân hóa đơng khác sử dụng tinh bột BC 2.3.5.2 Nguồn Carbon Các nguồn carbon (sucrose; glucose fructose) thành phần quan trọng môi trường nuôi cấy mô Các lĩnh vực vi nhân giống cho diện đường môi trường cấy quan trọng vừa cho phát triển rễ nhân chồi, vừa làm tăng chiều cao Nồng độ sucrose (20g/l 30g/l) thường sử dụng phổ biến lĩnh vực nuôi cấy mô lan Sucrose thông thường thêm vào môi trường để đẩy mạnh tăng nhanh protocorm phát triển Theo Debergh (1991) vắng mặt đường làm giảm vấn đề nhiễm môi trường cấy cho phép tăng trưởng cách tự dưỡng điều kiện invitro nồng độ CO2 mật Tải FULL (93 trang): https://bit.ly/3p3VEt1 Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net độ ánh sáng tăng lên 2.3.5.3 Chất khoáng Sau đường, chất khoáng yếu tố quan trọng cho sinh trưởng invitro Các khống cung cấp cho ni cấy mơ dạng muối vơ cơ, lan thích nghi phổ rộng hỗn hợp muối vơ Đạm thành phần acid nucleic đóng vai trị quan trọng trao đổi chất, thành phần chủ yếu chất nguyên sinh tế bào (Moxolov, 1987), có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển Đạm sử dụng nuôi cấy mô thường dạng + - ammonium (NH4 ) nitrate (NO3 ) Lân tham gia vào việc vận chuyển lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic tham gia vào cấu trúc màng Lân thường sử dụng hai - 2- dạng ion H2PO4 H2 PO4 Nồng độ khoáng đa lượng vi lượng môi trường rễ thường giảm xuống cịn so với bình thường (tuỳ theo loài 40 Luận văn tốt nghiệp Tổng quan tài liệu cây) Nguyên nhân có lẽ nhu cầu đạm giai đoạn giảm xuống (Nguyễn Đức Lương Lê Thị Thủy Tiên, 2002) 2.3.5.5 Vitamin Nồng độ vitamine thấp Chỉ có vitamine B1 (Thiamine) cần thiết cho biến dưỡng carbohydrate sinh tổng hợp amino acid cho hầu hết trồng nuôi cấy Vitamine B6 vitamine PP thêm vào môi trường MS số môi trường khác Các vitamine khác Biotin (vitamine H), Folic acid, acid ascorbic (vitamine C) vitamine E thêm vào Vitamine C sử dụng nồng độ cao chất chống oxy hóa Myo-inositol có ý nghĩa cải thiện phản ứng invitro tăng trưởng trồng, đặc biệt đơn tử diệp 2.3.5.6  Các chất điều hòa sinh trưởng Auxins (IAA, IBA, NAA hay 2.4 D) - Nồng độ: IAA (auxin tự nhiên): 0.01- 10 mg/l IBA, NAA 2.4 D (auxin tổng hợp): 0.001-10 mg/l Tác dụng: Kéo dài tế bào làm mô sưng phù Phân chia tế bào (hình thành callus) hình thành rễ bất định Ức chế hình thành chồi nách chồi bất định Tạo phôi nuôi cấy huyền phù - Nồng độ auxin thấp: hình thành rễ bất định - Nồng độ auxin cao: hình thành callus  Cytokinin (kinetin, BA, 2iP) Nồng độ: 0.1-10mg/l Tác dụng: Thúc đẩy phân chia tế bào, đặc biệt bổ sung thêm auxin Ở nồng độ cao (1-10 mg/l) cytokinin cảm ứng hình thành chồi bất định ức chế hình thành rễ Thúc đẩy hình thành chồi nách ức chế ưu Làm chậm lão hoá 3483681 41 ... th? ?c thử nghiệm đề tài: ? ?Khảo sát khả thay chất điều hịa sinh trưởng Oligochitosan hai mơi trường Murashige & Skoog (MS) Knudson C (KC) nuôi c? ??y in vitro lan Dendrobium thongchai gold? ?? 1.2 M? ?C. .. kh? ?c 1.3 YÊU C? ??U X? ?c định nồng độ thích hợp Oligochitosan bổ sung vào môi trường nuôi c? ??y c? ? t? ?c dụng kích thích sinh trưởng phát triển lan Dendrobium thongchai gold hai môi trường Murashige Skoog. .. M? ?C ĐÍCH Ni c? ??y mô lan Dendrobium thongchai gold để tạo nguồn nguyên liệu ph? ?c vụ cho nghiên c? ??u sản xuất X? ?c định ảnh hưởng Oligochitosan nuôi c? ??y in vitro lan Dendrobium thongchai gold hai môi