TổngQuan độc tố alflatoxin

GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN TỔNG QUAN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Hình thái: Lồi Aspergillus flavus dễ nhận biết màu vàng lục dạng nhiều vón cục tán Ở đỉnh cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình thành đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thn dài Các thể chai đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình lớp) qua lớp thể bình trung gian (thể bình lớp); đơi hai kiểu đồng thời tồn [3] Hình 1.1: Hình thái nấm mốc A flavus Các bào tử có kích thước lớn (đường kính từ 5-7μm) hình cầu, màu vàng nâu đến lục, sần sùi Đôi người ta coi thuộc loài A flavus loài nấm có cuống bào tử đính xù xì hai lớp thể bình, cịn lồi A parasiticus cuống bào tử đính nhẵn thể bình lớp [3] 1.1.2 Sinh thái A flavus xem loài phân bố khắp nơi: đất, chất hữu cơ, loại hạt hạt có dầu Từ lâu, người ta phát có mặt đất, dù rừng, vùng than bùn, vùng đất hoang sa mạc Sahara, đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hệ rễ lúa mì Người ta cịn coi nhanh chóng xâm nhập lại đất khử trùng nước Đất đai vùng nhiệt đới chứa nhiều loài nhiều so với đất đai vùng ơn đới Nó thường gặp lúa mì, bột, chế phẩm bột sống, bánh mì HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN TỔNG QUAN Ngô gạo sản phẩm từ ngô gạo thường chứa lồi Nó có nhiều sợi bơng hạt bơng, xâm nhập vào hạt qua điểm hợp nhờ chỗ hủy hoại trùng gây Ngồi người ta cịn thấy trên: hạt khơ dầu tương, củi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, cà phê, hồ đào Brazin, thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải đường, lê, giăm bông, dồi thịt nhiều thức ăn khác Sự có mặt lồi thức ăn phức hợp gia súc, ni khơng có ngơ lạc, cỏ khơ gia súc Nếu có điều kiện thuận lợi, sinh sơi nở nhiều; lúa mì tồn trữ kho kín có độ ẩm 15,2 % đến 17% bào tử chiếm từ 50-100% tổng số bào tử có mặt, nhiều mặt kho đóng vón lại thành lớp vỏ cứng sâu tới 0.6m Nó thường có mặt ngơ bẹ độ ẩm vượt 15,5% [3] Nấm mốc độc Aspergillus flavus gặp nhiều loại lương thực, thực phẩm khác nhau, loại hạt có dầu (đặc biệt lạc) thích hợp cho phát triển nó, lạc độc tố Aflatoxin hình thành mạnh Người ta ngiên cứu 1.000 mẫu lạc thí nghiệm thấy lạc hạt có 3,3% số củ độc - 1kg chứa 0,25mg Aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu Aspergillus flavus) 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ khơng độc Cịn khô lạc: 42% số mẫu độc, 49,3% độc vừa có 8,7% khơng độc Như chất độc tích lũy lại khơ lạc chế biến, Aspergillus flavus phát triển mạnh lên [3] Bào tử nấm A flavus có khả phát tán khơng khí, nước, đất Đặc biệt gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển lương thực, thực phẩm, hoa chí cịn gây hại số lồi trồng Vì phạm vi ký chủ rộng, khả phát tán lớn nên phòng trừ nấm hại thường khó khăn Nấm A flavus ký sinh, gây hại loại lương thực như: lúa, ngô, sắn, số loại hạt làm thực phẩm như: lạc, đậu, vừng , thực phẩm như: sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ,…và chí hoa tươi bị dập như: long, nhãn, xồi, vải,… Trong q trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển, chúng tiết độc tố Aflatoxin [3] HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN Hình 1.2: Nấm mốc A flavus TỔNG QUAN Hình 1.3: Nấm mốc A flavus lạc hạt đậu Gạo lạc nguồn lương thực, thực phẩm cần thiết quan người Song gạo lạc không đảm bảo an tồn lại nguồn lây nhiễm cho người bệnh hiểm nghèo, đặc biệt ung thư gan Đứng góc độ an toàn thực phẩm nhà khoa học cho tác nhân gây ngộ độc thực phẩm lớn gạo lạc nấm mốc [4], [6], [7] Lạc sản phẩm từ lạc chắn nơi phát triển ưa thích A flavus Khơng phải có lồi này, nhiều lồi nấm khác thường kèm với nó, số số lớn loài xem độc với súc vật : số lồi Fusarium có F monoliforme, loài Rhizopus, loài Penicillium citrinum, P purpurogenum [4], [6], [7] Lạc loại hạt có nước:7,4%, protein:28%, lipid: 44,5%, glucid: 15% Các nhà khoa học phân lập lạc có lồi nấm độc Aspergillus flavus thấy trường hợp ngộ độc trước liên quan đến nấm mốc độc Nấm mốc độc có gặp số ngũ cốc khác với lạc mơi trường thuận lợi cho phát triển Nấm mốc xâm nhập vào lạc chúng phát triển làm cho lạc bị mốc xanh mốc vàng Đặc biệt nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin [4], [6], [7] Trong gạo có chứa thành phần hoá học gạo tám glucid: 82,2%, protein: 6,6%, nước:10%, lipid: 1,0%, chất khống: 0,4%, vitaminB1: 0,08% Do HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN TỔNG QUAN môi trường thuận lợi cho nấm mốc xâm nhập phát triển biện pháp bảo quản không hiệu So với thóc, gạo khơng cịn lớp vỏ trấu để bảo vệ, chất dinh dưỡng lớp gạo lại nhiều nên dễ bị nấm mốc phá hoại Đặc biệt nước có khí hậu nóng ẩm, điều kiện tốt nấm mốc sinh trưởng gây ảnh hưởng đến chất lượng gạo Các nhà khoa học phân lập nhiều lồi nấm mốc gạo, lồi có nhiều chủng, có hai lồi hay gặp Aspergillus Penicilium [4], [6], [7] 1.1.3 Độc tố aflatoxin Aspergillus flavus sản sinh Tên Aflatoxin dùng để gọi hỗn hợp độc tố Aspergillus flavus sinh trước chất phức tạp hợp chất biết rõ Thực ra, Apergillus flavus chủ yếu sản sinh Aflatoxin B1 Aflatoxin khác có chất hóa học tương tự gọi Aflatoxin G1, B2, G2 Trong hầu hết chủng Aspergillus parasiticus sinh độc tố Aspergillus flavus sản sinh độc tố Aflatoxin thay đổi theo chủng Mặt khác, cịn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sản sinh Aflatoxin kết tác động qua lại genotype chủng điều kiện phát triển [3] 1.1.3.1 Các chủng sinh độc tố : Đã có số lớn quan sát tính chất nhiều sinh độc tố nhiều chủng nấm khác nhau: quan sát tiến hành chất tự nhiên điều kiện nuôi cấy định Một số tác giả ghi nhận nhiều biến đổi quan trọng mặt sinh độc tố tùy theo chất, từ phân lập chủng Aspergillus flavus tùy theo nguồn gốc địa lý: số 284 mẫu phân lập từ gạo Mỹ có 94% số chủng sinh độc tố, 86% mẫu phân lập từ lạc, 71% phân lập từ lạc Ixraen Các chủng gốc vùng nhiệt đới có nhiều lồi sinh độc tố vùng ôn đới [3] HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN TỔNG QUAN Ngoài ra, số lượng Aflatoxin sản sinh thay đổi nhiều tùy theo chủng, người ta tìm thấy điều ni cấy chúng để so sánh chất điều kiện Người ta ghi lại mức sản sinh từ vài mg/kg đến 100, 200, 500, 1000 chí gần 2000 mg/kg chất Gần hơn, việc định lượng tổng số Aflatoxin, người ta quan tâm xác định tỷ lệ riêng phần Aflatoxin biết Nói chung, Aflatoxin B1 tạo nhiều thiên nhiên lẫn nuôi cấy, đến Aflatoxin G1, sau Aflatoxin B2, cịn G2 chất khác tỷ lệ thấy thấp [3] Người ta thử nhận dạng chủng sinh độc tố chủng không sinh độc tố qua đặc điểm hình thái Một số người cho chủng sinh độc tố có đầu bào tử đính màu xanh lục, giống nuôi cấy lâu ngày, thể bình hai lớp, cuống bào tử đính có vách có gai, chủng sinh độc tố có phình to số phần sợi nấm tạo thành cục nhỏ, dị thường đặc trưng cho dịng sản sinh Aflatoxin Tuy nhiên thường có lẻ khó thăm dị biết cách chắn chủng có sinh Aflatoxin chủng khơng sinh Aflatoxin ngồi cách dùng đường sinh học hóa học [3] 1.1.3.2 Cơ chất điều kiện xung quanh để chủng A flavus sản sinh aflatoxin : Các chủng phát triển hạt có dầu lạc sản phẩm từ lạc ghi nhận sinh đôc tố nhiều chủng phân lập từ sản phẩm ngũ cốc nước thuộc địa Các chủng phân lập từ thịt ơi, bánh mì, thực phẩm bột sống mát ô nhiễm tự nhiên thường khơng sinh độc tố Ngược lại, gần phần ba số chủng phân lập từ gia vị có sản sinh Aflatoxin [3] Tính độc số chủng giảm độc tính sau chất độc chúng vi sinh vật khác chuyển hóa thành chất dẫn xuất khơng hoạt động Chính Texas, người ta ngạc nhiên thấy lạc có vỏ nhiễm Aspergillus flavus nặng lại có độ độc thấp Nghiên cứu củ lạc đó, phát có lồi vi khuẩn nấm có khả ức chế hình thành Aflatoxin biến đổi Aflatoxin sản sinh thành chất độc HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 10 TỔNG QUAN Người ta dựa tượng để tìm tịi biện pháp sinh học nhằm tẩy độc sản vật bị hư hỏng [3] Sản lượng Aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành nuôi cấy: số lượng hệ sợi nấm đạt trị số tối ưu sản lượng lớn nhất, giảm sút nhanh chóng lúc hệ sợi nấm tự phân giải: phân giải tương ứng với phân hủy Aflatoxin, đẩy mạnh thơng khí tốt lắc mạnh bình ni cấy [3] Nhìn chung, sản xuất Aflatoxin, điều kiện ni cấy thơng thường, lúc hình thành quan mang bào tử đính Aspergillus flavus, tăng dần giai đoạn sinh bào tử mạnh mẻ, tức khoảng ngày thứ giảm sút [3] Nhiều yếu tố vật lý dinh dưỡng khác ảnh hưởng đến hàm lượng Aflatoxin sinh điều kiện nuôi cấy điều kiện tư nhiên Những biến thiên nhiệt độ thấy thiên nhiên, với nhiêt độ đỉnh cao 45o 50 C cho thấy không thuận lợi cho việc sản sinh Aflatoxin nhiệt độ ổn định o 25 C [3] Hàm lượng nước chất có vai trị việc sản sinh Aflatoxin, gắn o liền với phát triển tương đối A flavus, 32 C lạc có hàm lượng nước khoảng 15 30% Aflatoxin hình thành sau ngày Như vậy, điều kiện nhiệt đới, A flavus phát triển lạc khơng có Aflatoxin 48h sau phát Aflatoxin Trên gạo có hàm lượng nước 24-26% ngô 19-24%, Aflatoxin hình thành nhanh chóng nhiệt độ ấm [3] Giá trị pH ban đầu có ảnh hưởng đến hình thành Aflatoxin Giá trị pH thích hợp để A flavus sinh độc tố aflatoxin giá trị pH 4-5 Hàm lượng khí cacbonic tăng lên khí làm hạn chế sinh trưởng A flavus giảm lượng Aflatoxin sinh ra, giảm hàm lượng oxi tăng hàm lượng nitơ khí hàm lượng Aflatoxin giảm [3] Các Aflatoxin xem nhạy cảm với ánh sáng, thực tế chúng nhạy cảm với tia tử ngoại [3] HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 11 TỔNG QUAN Người ta tiến hành nhiều cơng trình nghiên cứu tầm quan trọng yếu tố dinh dưỡng khác lên sản lượng Aflatoxin thể qua điều kiện nuôi cấy khác [3]: Bảng 1.1 Ảnh hưởng chủng A flavus điều kiện nuôi cấy để sản sinh Aflatoxin Chủng ATCC 15517 Chưa xác định Chưa xác định NRRL 2999 NRRL 2999 NRRL 2999 NRRL 3000 NRRL 3000 Ghi chú: ATCC, NRRL : ký hiệu sưu tập chủng chuẩn HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 12 TỔNG QUAN Nguồn Cacbon : Nhiều tác giả nghiên cứu ảnh hưởng việc thêm đường hexose vào mơi trường ni cấy chất khống lên hàm lượng Aflatoxin A flavus sinh ghi nhận đường glucose, fructose, manose thuận lợi cho tổng hợp Aflatoxin [3] Bảng 1.2 Ảnh hưởng đường hexose khác lên lượng Aflatoxin sinh Glucid D glucose D manose D fructose D galactose D gulose D arabinose D xylose D ribose D eritrose D glyceraldehyde Ghi chú: Số dấu + lượng aflatoxin nhiều hay ít, dấu – khơng có, số O khơng thí nghiệm HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 13 TỔNG QUAN Nguồn đạm [3]: Sản lượng Aflatoxin cao thu môi trường có tính chất nấm men có peptone hoăc tốt có acid amin glycin glutamat, alanin acid aspartic Tiamin vitamin nhóm B kích thích tổng hợp Aflatoxin Các ion kim loại [3]: Sự có mặt kẽm, catmi, magie sắt kích thích sản sinh Aflatoxin, coban, crom, canxi, mangan có hiệu lực Thêm 3,9 μmol Bari acetate tạo thành Aflatoxin bị ức chế 1.1.4 Biện pháp phòng ngừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm: Nước ta có khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, điều kiện thuận lợi nấm mốc xâm nhập phát triển gây hại nông sản thực phẩm nói chung gây hại đến gạo, lạc nói riêng Chúng có khả phát triển tốt thực phẩm có độ ẩm 10%, đồng thời có khả sản sinh độc tố gây bệnh Cũng từ chúng lây nhiễm sang người ăn gây cho người bệnh hiểm nghèo Để hạn chế loại trừ nấm mốc khỏi gạo, lạc cần phải có biện pháp kiểm sốt, bảo quản hữu hiệu từ giống, phân bón, đồng ruộng, thu hoạch, vận chuyển, bảo quản, chế biến…[4], [6], [7] Chúng ta biết nấm mốc diện nhiều nơi, lương thực thực phẩm, thức ăn gia súc bào tử nấm mốc tư sẵn sàng chờ "cơ hội", chúng phát triển mạnh có độ ẩm, nhiệt độ mơi trường thích hợp HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 14 TỔNG QUAN • Những giải pháp phòng chống độc tố nấm mốc: [2] 9Kiểm tra, khống chế độ ẩm nhiệt độ thích hợp q trình dự trữ ngun liệu: Phải sấy khơ nguyên liệu trước đưa vào kho dự trữ Muốn nguyên liệu tốt, cần có qui định tình trạng loại hạt điều kiện dự trữ cụ thể Ln ln có cân độ ẩm khơng khí độ ẩm ngun liệu, cân thay đổi nhiệt độ môi trường thay đổi Mức phổ biến cho hạt dự trữ an tồn 13% ẩm độ 9Kiểm sốt trừ khử côn trùng, sâu mọt kho: Người ta nhận thấy có mối liên hệ phá hại sâu mọt, côn trùng nguyên liệu phát triển nấm mốc Điều giải thích lý do: ¾ Hoạt động trao đổi chất trùng, sử dụng chất hữu nguyên liệu, hô hấp sinh nước làm cho môi trường trữ thức ăn ngày ẩm thêm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển ¾ Cơn trùng sâu mọt đục khoét hạt, di chuyển nguyên liệu mang bào tử nấm phát tán nhanh ngun liệu Theo tài liệu FAO (1979) trùng sâu mọt làm tăng phát triển nấm mốc lên từ 10 - 30% 9Sử dụng hóa chất để phòng chống nấm mốc xâm nhập vào thức ăn: Có nhiều chất hóa học khác khống chế nhiễm nấm mốc thức ăn Hợp chất tương đối an tồn khơng độc hại có hiệu lực ngăn chặn phát triển nấm mốc thức ăn acid propionic muối Theo tài liệu FAO Rome (1979) hợp chất ngăn chặn nấm mốc cho kết đầy hứa hẹn HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 23 TỔNG QUAN Sự mẫn cảm Aflatoxin loài khác chia làm ba nhóm sau: • Mẫn cảm nhất: vịt, gà tây Hàm lượng Aflatoxin nhỏ 1ppm (phần triệu) thức ăn hàng ngày gây ngộ độc • Mẫn cảm vừa: bị, lợn gia cầm khác Hàm lượng Aflatoxin xấp xỉ 10ppm thức ăn hàng ngày gây ngộ độc • Mẫn cảm ít: cừu Hàm lượng Aflatoxin lớn 10ppm thức ăn hàng ngày gây ngộ độc Đáng ý có bê, cần hàm lượng 2ppm gây ngộ độc Đặc biệt, gia súc non dễ bị ngộ độc bú sữa Ngộ độc Aflatoxin chia làm hai thể sau: • Thể cấp tính: Gan biến đổi, màu nhạt, hoại tử, xuất huyết, … viêm cầu thận nặng • Thể mạn tính: Con vật bỏ ăn, chậm lớn, gầy yếu, lông xơ xác Mổ khám thấy gan biến đổi nặng như: xơ gan, có khối u gan nhiễm mỡ, thối hóa, xuất huyết, hoại tử Khơng có phương pháp điều trị đặc biệt cho gia súc, gia cầm bị ngộ độc độc tố loại nấm sinh ra, điều quan trọng cần ý loại bỏ thức ăn bị mốc có chứa Aflatoxin HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 24 TỔNG QUAN 1.2.5 Mức cho phép tối đa loại độc tố thức ăn chăn nuôi [2]: 9Những qui định Việt nam: Qui định độc tố Aflatoxin B1 Aflatoxin tổng số Việt Nam Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn ký ngày 31/10/2001, Số 104/2001/QĐ/BNN sau: Bảng 1.3 Qui định hàm lượng tối đa độc tô nấm mốc Aflatoxin B1 tổng hàm lượng Aflatoxin (B1+B2+G1+G2) tính mg kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc gia cầm (ppb): Loại vật nuôi Gà từ 1-28 ngày tuổi Nhóm gà cịn lại Vịt từ 1-28 ngày tuổi Nhóm vịt cịn lại Heo theo mẹ 1-20 ngày tuổi Nhóm heo cịn lại Bị ni lấy sữa - Đối với loại vật ni cịn nhỏ độ tuỗi từ 1-28 ngày mẫn cảm với Aflatoxin, hàm lượng tối đa độc tố Aflatoxin B1 thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh phải nhỏ 20 ppb; đặc biệt vịt con, thức ăn không chứa Aflatoxin B1 HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 25 TỔNG QUAN 9Những quy định Mỹ độc tố aflatoxin thức ăn thực phẩm: Bảng 1.4 Những quy định mức cho phép Aflatoxin thức ăn Mỹ (FAO, 1995): Loại thực liệu Mọi thức ăn (người), trừ sữa Sữa (làm thực phẩm cho người) Thực liệu thức ăn gia súc khác Hạt bơng vải làm ngun liệu thức ăn cho bị thịt, heo, gia cầm Bắp khơ dầu phộng (cho bị, heo, gia cầm trưởng thành vỗ béo) Bắp cho thú non bò sữa Bắp cho thú, bò thịt, heo, gà giống Bắp cho bò thịt vỗ béo Bắp cho heo vỗ béo - Trong loại thức ăn trên, sữa sản phẩm có mức cho phép Aflatoxin thấp: 0,5ppb; tiếp đến thức ăn cho người, thức ăn gia súc, bắp cho thú non bò sữa có mức cho phép Aflatoxin: 20 ppb; loại thức ăn khác mức cho phép 100 - 300ppb HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 26 TỔNG QUAN 9Những quy định châu Âu độc tố aflatoxin: Bảng 1.5 Những quy định hàm lượng Aflatoxin B1 tối đa thức ăn gia súc, gia cầm nước thuộc EU: Các loại nguyên liệu, thức ăn động vật Các loại thức ăn đơn chất: Thức ăn hỗn hợp cho bò, cừu (ngoại trừ bò sữa, bê cừu con): Thức ăn hỗn hợp cho heo gia cầm (ngoại trừ heo gia cầm non) Các loại thức ăn hỗn hợp khác lại Thức ăn bổ sung cho bò, cừu, dê (ngoại trừ cho bò sữa, bê cừu non) Thức ăn bổ sung cho heo, gia cầm (ngoại trừ thú non) Những thức ăn khác lại đặc biệt bò sữa Nguyên liệu thức ăn đơn khác như: (đậu phộng, B/d phộng, B/d dừa, B/d cọ, B/d vải sản phẩm chế biến khác) Ghi chú: B/d: Bơ/dầu - Quy định hàm lượng Aflatoxin B1 tối đa thức ăn gia súc đặc biệt bò sữa nghiêm ngặt: 10ppb; loại thức ăn dành cho heo gia cầm có quy định hàm lượng Aflatoxin B1 (20ppb) thấp thức ăn cho bò, cừu, dê 50ppb; thức ăn hỗn hợp cho heo gia cầm có quy định hàm lượng Aflatoxin B1 (20ppb) thấp thức ăn bổ sung (30ppb) HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 27 TỔNG QUAN 1.3 Phương pháp phát A flavus 1.3.1 Dựa vào đặc điểm hình thái [17], [18]: Việc phát nấm mốc A flavus thường dựa vào đặc điểm hình thái Nếu phân loại đến giống dễ nhận biết dựa vào cuống đính bào tử, để phân biệt đến lồi phức tạp, thường dựa vào đặc điểm sau: + Đặc điểm đại thể: bao gồm màu sắc bào tử sợi nấm, đường kính khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc thay đổi, tạo sắc tố giọt tiết + Đặc điểm vi thể: phần lớn dựa vào xếp, hình dạng kích thước bọng, bào tử hình thái cuống, diện tế bào Hülle, hình thái nang bào tử Hơn nữa, tất đặc điểm hình thái phải xác định điều kiện phịng thí nghiệm chuẩn thực chuyên gia phân tích nấm để nhận diện xác Thơng thường, người ta thường dựa vào số môi trường nuôi cấy chọn lọc cho nấm Czapek Dox agar, Potato Dextrose Agar, Malt Extract Agar để nhận diện nấm mốc sử dụng số môi trường khác như: để nhận diện nhóm A flavus dựa đặc tính chuyển hóa màu mơi trường mặt sau đĩa thạch sang vàng cam môi trường Aspergillus flavus and Aspergilus parasiticus agar (AFPA) Coconut cream agar (CCA) dùng để phát chủng sinh Aflatoxin, tạo Aflatoxin phát cách quan sát huỳnh quang màu xanh lam đèn UV HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 28 TỔNG QUAN Hình 1.5 (a) A flavus mơi trường AFPA (Aspergillus flavus and Aspergilus parasiticus agar), sau ngày ni cấy ủ 25ºC, với đặc tính chuyển màu mặt sau môi trường thành màu cam (b) A flavus sinh độc tố Aflatoxin phát triển đĩa CCA (Coconut cream agar) nhỏ quan sát đèn UV, sau ngày ủ; đĩa CCA lớn không cấy chủng nấm A flavus 1.3.2 Dựa phương pháp sinh học phân tử [18]: Phương pháp sinh học phân tử áp dụng rộng rãi để nhận diện loài A flavus Phần lớn thường sử dụng trình tự DNA mục tiêu phức rDNA, thường vùng ITS1 and ITS2 bên vùng phiên mã vùng thay đổi đầu 5’ vùng D1-D2 28S rRNA Tuy nhiên, lồi thuộc nhóm A flavus khó phân biệt dựa vào trình tự gen Các lồi A flavus, A parasiticus, A oryzae and A sojae có trình tự tương đồng cao kích thước tương tự nhau, trình tự DNA chúng tương đồng từ 91 đếm 100% Nhưng, kỹ thuật phân tích Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) phân biệt lồi A parasiticus and A sojae Do đó, để nghiên cứu A flavus, để so sánh A flavus với lồi Aspergillus khác chí nghiên cứu khác biệt đặc tính sinh Aflatoxin, HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 29 TỔNG QUAN nhiều vùng phức hợp rDNA gen liên quan đến trình sản sinh Aflatoxin thử nghiệm dùng làm markers với mức độ thành công khác Một số nghiên cứu dựa kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) dùng để phân tích khác biệt trình tự khuếch đại Nhưng khuếch đại trình tự mục tiêu PCR phải thực thêm kỹ thuật Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP), Single-Strand Conformation Polymorphisms (SSCP) dễ dàng phân biệt A flavus với loài khác dựa đoạn 600bp tương ứng với vùng khuếch đại ITS1/5.8S/ITS2 với cặp mồi ITS1-ITS4 Một số tác giả cho sử dụng trình tự khuếch đại lớn kết hợp với phân tích PCR-SSCP loại bỏ khó khăn lớn có thay đổi mặt chủng loại Tuy nhiên, phân tích khơng phân biệt chủng có sinh Aflatoxin khơng sinh Aflatoxin Chang cộng (1995) tìm thấy gen aflR để nhận biết chủng A flavus A parasiticus, Somashekar cơng (2004) phân biệt riêng biệt chủng A flavus A parasiticus dựa kỹ thuật RFLP cách dùng enzyme cắt giới hạn PvuII Multiplex PCR, sử dụng nhiều cặp mồi để nhận diện vùng mục tiêu bước tiến nhằm phân biệt lồi thành cơng sử dụng aflR, ver-1, omt-1 and nor-1 genes Nhưng phương pháp không phân biệt chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin Để phân biệt chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin phải sử dụng phương pháp reverse transcription PCR (RT-PCR) để xem biểu gen sản sinh Aflatoxin dựa vào gen liên quan đến trình điều hịa gen cấu trúc q trình sinh tổng hợp Aflatoxin Scherm cộng (2005) nghiên cứu 13 chủng loài A flavus A parasiticus tìm thấy gen (aflD, aflO [syn dmtA=omtB] and aflP [syn omtA]) sử dụng để phát khả sinh Aflatoxin sử dụng làm marker để nhận diện chúng Do đó, thật khó để phân biệt chủng A flavus với loài tương tự A nomius and A parasiticus Người ta thường phải kết hợp nhiều phương pháp khác nhận diện phân biệt xác lồi có khả sinh Aflatoxin HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 30 TỔNG QUAN 1.4 Đặc tính ứng dụng Cylodextrin [19] 1.4.1 Đặc tính Cyclodextrins biết nhiều thập niên qua, vào năm 1881, Villiers sản xuất cyclodextrin cách cho Bacillus amylobacter phân hủy tinh bột năm 1993, Schardinger chứng minh cấu trúc vòng hợp chất Sự thủy phân tinh bột enzyme tạo chuỗi đơn phân mạch thẳng nhánh glucose, maltose, maltotriose, v.v biết dextrins Đây trình thủy phân tinh bột thật sự, sản phẩm cắt từ nối glycosidic tương tác với phân tử nước Tuy nhiên tinh bột thủy phân enzyme cyd-glucosyltransferase (CGTase), sản phẩm chuỗi cắt trãi qua q trình phản ứng bên phân tử mà khơng có tham gia nước sản phẩm vịng có nối α-1,4 hình thành Các sản phẩm cyclodextrin (Szejtli, 1988) Các enzyme chuyển hóa glucose đối tạo thành cyclodextrin tạo nhiều vi sinh vật Bacillus macerans, B.circulans (Francis cộng sự, 2002) Cyclodextrin đại phân tử gồm đơn vị đường glucose Cyclodextrin thường tạo thành dịch đường nước Cyclodextrin thường chứa 6, 7, glucopyranose Như hoạt hóa tạo vịng trường hợp riêng hoạt tính khơng cân xứng Giả thuyết đặt enzyme có hai trung tâm: trung tâm chịu trách nhiệm gắn kết chất cho trung tâm chịu trách nhiệm gắn kết chất nhận nằm điểm khoảng cách đơn vị glucose Sự thủy phân xảy sau “chuyển glucose” đến tận gốc glucose không khử tận CGTase có khả xúc tác chuyển hóa mạch thẳng tinh bột thành phân tử mạch vòng, chủ yếu cyclodextrin α, β, γ chứa 6, 7, đơn vị glucose liên kết liên kết α1,4 Các chuỗi amilose dài chất tốt enzyme Người ta thấy lượng cyclodextrin thu cao phân tử amilose phân giải thành chuỗi có mức độ trùng hợp 100 có lẫn amilopectin Điều cho HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 31 TỔNG QUAN thấy đầu khử mạch bên phân tử amilopectin đóng vai trị chất tiếp nhận cho thủy phân amyloza Các oligozit mạch thẳng tinh bột chất tốt, gluxit có nhánh tham gia vào cyclodextrin để tạo phân tử vừa có vịng vừa có nhánh Hình 1.6: Cyclodextrin α, β, γ Các enzyme CGTase chia thành nhóm: nhóm tạo chủ yếu αcyclodextrin (Bacillus macerans) nhóm β-cyclodextrin (ví dụ B megaterium) Ngồi phân bố sản phẩm mạch vòng phụ thuộc vào thời gian phản ứng Enzyme CGTase từ Bacillus macerans ban đầu tạo β-cyclodextrin, sau α γ-cyclodextrin có tỷ lệ 42, 44, 14 enzyme có đặc tính thủy phân sản phẩm cyclodextrin Vì sinh vật chủ yếu sinh tổng hợp enzyme Bacillus macerans, B stearothermophilus, giống thuộc o Micrococcus Nhiệt độ tối ưu enzyme nằm khoảng 50-70 C, pH tối ưu nằm 5,0-7,0 khối lượng phân tử chúng dao động từ 67000 đến 88000 Da Còn pH tối ưu để tạo cyclodextrin nằm khoảng từ 4,5 – 9,0 HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 32 TỔNG QUAN 1.4.2 Cấu trúc tính chất cyclodextrin Cyclodextrin phân tử vòng lớn tạo nên từ đơn vị glucopyranozyl hình ghế C liên kết với liên kết α-1,4 cyclodextrin nghiên cứu nhiều thường chứa 6(α-cyclodextrin), 7(βcyclodextrin) 8(γ-cyclodextrin) gốc glucose đồng đẳng bậc cao chúng chứa tới 12 gốc glucose Các nghiên cứu tinh thể cho thấy α -, β-, γ-cyclodextrin có dạng hình xuyến giữ chặt liên kết hydro nhóm hydroxyl bậc gốc glucose kế Các nhóm hydroxyl bậc hướng ngồi mạch vịng Kích thước trung bình vịng xuyến 1,5nm x 0,7nm x 0,8 nm Điều lý thú cyclodextrin có bề mặt bên kỵ nước cịn bề mặt bên ngồi háo nước Cấu trúc cho phép tạo phức bao bền vững với chất hữu cơ, với muối với halogen Vì chất kỵ nước hịa tan Tùy theo kích thước tương đối chúng mà phân tử “khách thể” bao bọc toàn hay phần, cịn cyclodextrin đóng vai trị phân tử “chủ thể” hay chất tiếp nhận Phức hợp có tác dụng làm tăng độ bền phân tử “Khách thể” khơng nước mà cịn khơng khí sản phẩm khơ ; ngồi cịn làm tăng độ bền nhiệt độ với oxi hóa thủy phân Ở trạng thái rắn cyclodextrin khơng màu có vị nhẹ Độ hịa tan chúng nói chung thấp tăng lên với nhiệt độ Độ hịa tan tăng lên thay số nhóm hydroxyl methyl hóa, amin hóa, este hóa hay ete hóa Trong trường hợp này, kích thước đường kính cyclodextrin khơng bị thay đổi, song chiều sâu lỗ hang bị giảm xuống So với oligosaccharite mạch thẳng tương ứng cyclodextrin phân tử bền nhiên, chúng bị phân hủy acid mạnh tia gamma, bền vững môi trường kiềm Có thể nhận cyclodextrin phương pháp so màu với thuốc thử đặc hiệu Các α -, β-, γ-cyclodextrin có màu tím xanh, màu vàng nâu màu nâu HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 33 TỔNG QUAN Người ta tách phân đoạn cyclodextrin sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển propanol/nước/etyl acetate/ammoniac (6/3/1/1:V/V) sắc kí khí sắc kí lỏng cao áp 1.4.3 Đặc điểm phức bao cyclodextrin Một phức bao kết hợp phân tử : “ chất chủ thể” “ chất khách thể”, chất chủ thể bao chứa tồn hay phần phân tử chất khách thể kết tạo nên phức ổn định mà không cần liên kết đồng hóa trị tham gia Hình 1.7: Cấu trúc không gian phức bao cyclodextrin với phân tử khách thể Một tính chất quan trọng cyclodextrin chúng có khả tạo nên hợp chất bao với nhiều phân tử Các hợp chất bao tồn dung dịch trạng thái rắn Đặc tính bậc điểm khác biệt cyclodextrin với đa số phân tử chủ thể khác vốn đòi hỏi phải có kết tinh thành mạng lưới tạo lỗ hang thích ứng Q trình tạo thành phức hệ cyclodextrin phối trí theo dõi phương pháp khác nhau; đo phổ cực tím, hùynh quang, cộng hưởng từ hạt nhân, độ hòa tan Lúc đầu lỗ hang chứa đầy nước, hình thành phức bao, phân tử bị đẩy mà khơng làm thay đổi hình dạng cyclodextrin Nói chung tất phân tử bao độ nghiêng chắn theo cách có lợi cho liên kết Van HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 34 TỔNG QUAN der Waals Tương tác chủ yếu có chất kỵ nước, kết tổ hợp tương tác Van der Waals lỗ hang, tăng cường entropy phá hủy lớp nước bao quanh phân tử chất khách thể entropy việc giữ cố định phân tử chất khách thể lỗ hang Hiện người ta biết rõ cách giữ cố định phức bao thông thường, phân tử chất khách thể phải có kích thước tương hợp với kích thước lỗ hang cyclodextrin Tuy nhiên, phân tử tích lớn lỗ hang tạo phức bao qua số nhóm hay mạch bên chúng làm mơi giới Nhiều mơ hình khác đưa để mô tả tương hợp cần thiết cyclodextrin phân tử khách thể tạo thành phức bao phụ thuộc vào độ có cực phân tử chất khách thể Các phân tử bao bên phân tử cyclodextrin thường định hướng theo cách có lợi tối đa cho tiếp xúc phần kỵ nước chúng lỗ hang vốn có tính kỵ nước cyclodextrin Thường yếu tố hình học quan trọng yếu tố hóa học tạo thành phức bao bị chi phối yếu tố sau: - Khả phân tử chất khách thể khớp hoàn toàn hay phần vào lỗ hang - Sự nước bề mặt than hình nón cụt kéo theo lượng - Sự chuyển dịch phần lượng từ cyclodextrin sang phân tử chất khách thể môi trường kỵ nước Phức bao cyclodextrin methyl hóa bền nhất, lẽ lỗ hang phía nhóm hydroxyl bật bị bao vây một…kỵ nước, khử bỏ liên kết hydro phân tử nên vòng cyclodextrin trở nên mềm dẻo Độ bền phức bao phụ thuộc vào nhiệt độ chất dung môi Ta thường biết phức bao tạo nên dung mơi hỗn hợp nước – rượu, khơng tương tác hình thành cyclodextrin phân tử vịng thơm dung mơi phân cực HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 35 TỔNG QUAN Trong phức bao đơn giản nhất, phân tử chất khách thể cấm cung phân tử cyclodextrin theo tỉ lệ 1:1 Đa số chất bao tồn cyclodextrin thường có khối lượng phân tử xê dịch từ 80-250 Với phân tử có khối lượng lớn phần phân tử bao có nghĩa tỷ lượng tương hợp 1:1, 2:1 hay 1:2 1.4.4 Ứng dụng phức bao: Phức bao ứng dụng làm vỏ bọc cho phân tử có họat tính cao hay dễ bay để giảm độ nhạy q trình thủy phân, oxi hóa, hay quang phân Sử dụng cyclodextrin làm chất bao thường tác dụng sau: - Thay đối khả phản ứng hóa học phân tử chất khách thể - Tạo độ bền cho chất nhạy cảm với ánh sáng hay với oxi - Phối trộn phân tử họat động mạnh mà khơng có bất trắc - Lựa chọn phản ứng cách bao bọc nhóm định chức - Gắn cố định chất dễ bay hơi: + cải tiến trình tàn trữ bảo quản + giảm lượng chất thơm cần thiết nhờ giảm tổn thất + Thiết lập công thức liều lượng cần thiết - Thay đối tính chất lý hóa + tăng độ hòa tan khả tạo nhũ cho số chất + cải thiện độ phân tán + Che khuất cục bột số hợp chất quan trọng hỗn hợp phức tạp 1.4.5 Tương tác cyclodextrin với aflatoxin [12, 15] Người ta chương trình HINT (Hydropathic Interaction) để giải thích tương tác AfB1 cyclodextrin cách thiết kế đầu dò (chemosensor) để phát độc tố nồng độ thấp HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 36 TỔNG QUAN HINT dựa thí nghiệm xác định giá trị Log P octanol/ water xác định enthapy entropy việc góp phần tạo nên lượng tự HINT dùng o để dự đoán ΔG tương tác Protein – ligand, protein – protein, protein – DNA nhằm giải thích q trình tương tự tượng liên quan đến phức hợp chất hữu chủ thể - khách thể Tỷ lệ HINT cao tương tác chất phức tốt lúc o ΔG