Nghiên cứu chế tạo, xác định hình thái, cấu trúc, tính chất các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  HỒ THỊ OANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, XÁC ĐỊNH HÌNH THÁI, CẤU TRÚC, TÍNH CHẤT CÁC HỆ NANO CHỨA MỘT SỐ HỢP CHẤT LYCOPEN, RESVERATROL VÀ PYCNOGENOL Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số : 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2021 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Mai Hà TS Đặng Thị Tuyết Anh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ, họp Học viện Khoa học Công nghệ-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Ngày nay, theo xu hướng sử dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên, hợp chất có hoạt tính sinh học cao lycopen, resveratrol, pycnogenol, nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu, chiết tách ứng dụng cách rộng rãi Lycopen hợp chất thuộc nhóm carotenoid có hoạt tính chống oxy hóa cực mạnh, có tác dụng mạnh mẽ việc phòng chống ung thư, bệnh tim mạch, xơ hóa gan đóng vai trị quan trọng hệ miễn dịch Resveratrol stilbenoit kháng độc tố tự nhiên, tiềm ứng dụng hợp chất khả chống viêm, chống oxy hóa, chữa lành vết thương, chống vi khuẩn chống ung thư Pycnogenol biết đến hỗn hợp flavonoid quý có khả chống oxy hóa chống viêm tiếng Hợp chất giúp tăng cường sức khỏe tim mạch, bảo vệ tế bào thần kinh, kiểm soát đau chống lại gốc tự Mặc dù có nhiều hoạt tính sinh học q hầu hết hợp chất nêu xếp vào nhóm hợp chất có độ tan nước thấp khó hấp thu hiệu vào thể, sinh khả dụng bị hạn chế Để khắc phục nhược điểm độ hòa tan độ bền, việc nghiên cứu chế tạo hợp chất sinh học tự nhiên dạng hạt nano hứa hẹn tạo nguồn dược liệu quý ứng dụng cho ngành dược phẩm mỹ phẩm Mặt khác, kết hợp hợp chất cho sản phẩm tổ hợp có tác dụng hiệp đồng, mang lại hoạt tính sinh học cao so với việc sử dụng hợp chất riêng rẽ Hai hợp chất resveratrol pycnogenol biết đến hợp chất sinh học có tác dụng tăng độ bền tăng khả phân tán nước cho hợp chất thuộc nhóm carotenoit có nhiều liên kết đôi liên hợp lycopen Tuy nhiên nay, nghiên cứu dừng lại việc chế tạo hỗn hợp compozid hợp chất mà chưa có cơng trình cơng bố chế tạo hệ nano, đặc biệt hệ nano lycopen/resveratrol hệ nano lycopen/pycnogenol Chính vậy, nghiên cứu chế tạo hai hệ nano hướng nghiên cứu cần thiết Do đó, việc thực đề tài luận án: “Nghiên cứu chế tạo, xác định hình thái, cấu trúc, tính chất hệ nano chứa số hợp chất lycopen, resveratrol pycnogenol” có tính thời sự, có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao Mục tiêu nghiên cứu luận án - Chiết tách lycopen từ gấc, resveratrol từ cốt khí củ tổng hợp copolyme PLA-PEG làm nguyên liệu cho trình chế tạo dạng hạt nano; - Chế tạo dạng hạt nano hệ hạt nano như: nano lycopen, nano resveratrol hệ nano lycopen/resveratrol, hệ nano lycopen/pycnogenol Xác định hình thái cấu trúc vật liệu nano thu được; - Đánh giá độ bền vật liệu nano điều kiện bảo quản môi trường khác Các nội dung nghiên cứu luận án - Nghiên cứu chiết tách lycopen từ gấc resveratrol từ cốt khí củ Nghiên cứu điều kiện thích hợp phương pháp chiết tách hợp chất Xác định cấu trúc độ tinh khiết lycopen resveratrol sau trình chiết tách; - Nghiên cứu tổng hợp copolyme PLA-PEG sử dụng làm chất bao bọc vi nang cho hệ nano tổ hợp chứa lycopen; - Nghiên cứu chế tạo nano lycopen, nano resveratrol có khả phân tán tốt nước Xác định hình thái, cấu trúc, tính chất mẫu nano phương pháp phân tích đại Khảo sát độ bền bột nano điều kiện bảo quản môi trường khác nhau; - Nghiên cứu chế tạo hệ nano lycopen/resveratrol hệ nano lycopen/pycnogenol Xác định hình thái, cấu trúc tính chất mẫu nano phương pháp phân tích đại Nghiên cứu độ bền lycopen hệ nano theo thời gian bảo quản điều kiện khác CHƯƠNG TỔNG QUAN Tổng quan gồm phần chính: Phần tổng quan đối tượng nghiên cứu hợp chất sinh học tự nhiên lycopen từ trái gấc, resveratrol từ cốt khí củ pycnogenol từ thơng đỏ Q trình thu thập, tìm hiểu nghiên cứu hợp chất cho thấy sinh khả dụng chúng bị hạn chế tính chất tan bền Công nghệ nano đánh giá giải pháp hữu hiệu việc nâng cao khả phân tán, cải thiện hấp thu, tăng cường dược tính nâng cao độ bền cho hợp chất sinh học tự nhiên Do đó, phần tổng quan phương pháp nghiên cứu chế tạo dạng nano hợp chất tự nhiên Phần trình bày tình hình nghiên cứu nước giới dạng hạt nano hợp chất có hoạt tính sinh học, cụ thể nano lycopen, nano resveratrol hệ nano lycopen/resveratrol, hệ nano lycopen/pycnogenol CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên vật liệu hóa chất 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 2.2 Thực nghiệm 2.2.1 Chiết tách hợp chất tự nhiên lycopen resveratrol sử dụng làm nguyên liệu cho trình chế tạo dạng hạt nano chúng 2.2.2 Tổng hợp copolyme PLA-PEG 2.2.3 Nghiên cứu chế tạo hệ nano chứa số hợp chất lycopen, resveratrol pycnogenol 2.2.3.1 Chế tạo nano lycopen nano resveratrol Lycopen resveratrol với hàm lượng khác chất hoạt động bề mặt tween 80 cremophor RH40 hịa tan hồn tồn dung mơi hữu máy khuấy từ 30 phút Dung dịch sau nhỏ từ từ giọt vào 100 ml nước cất có chứa PEG 6000, đồng thời khuấy tốc độ 9000 vòng/phút vòng 15 phút để thu dung dịch hỗn hợp đồng Tiếp tục tạo bột nano phương pháp sấy phun Lắp đặt máy cài đặt chương trình chạy cho máy, sau sấy phun thu mẫu vệ sinh máy Các sản phẩm nano thu dạng bột mịn tơi Nano lycopen thu có màu đỏ tươi cịn nano resveratrol thu có màu trắng ngà 2.2.3.2 Chế tạo hệ nano tổ hợp chứa lycopen  Chế tạo hệ nano lycopen/resveratrol Lycopen resveratrol phối trộn với tỷ lệ khác 1:2, 1:1 2:1, sau thêm chất hoạt động bề mặt chất bao bọc vi nang copolyme tổng hợp trên, hịa tan thành phần dung mơi tetrahyđrofuran sử dụng máy đồng Ultra-Turrax với tốc độ 8400 vòng/phút 45 phút; hỗn hợp sau hòa tan hoàn toàn bổ sung từ từ vào dung dịch nước cất đồng thời khuấy tốc độ 900010000 vòng/phút khoảng thời gian 30 phút Dung dịch hệ nano lycopen/resveratrol nước sau đưa vào hệ thống máy sấy phun, thu bột nano lycopen/resveratrol có màu đỏ mận  Chế tạo hệ nano lycopen/pycnogenol Lycopen pycnogenol phối trộn với tỷ lệ khác nhau, sau thêm chất hoạt động bề mặt Tween 80, thành phần hịa tan hồn tồn dung môi tetrahydrofuran (THF) máy khuấy từ, thời gian 60 phút Dung dịch thu được nhỏ từ từ vào dung dịch nước cất có chứa copolyme PLA-PEG điều kiện khuấy 9000 vòng/phút, thời gian 30 phút Tiếp theo, hỗn hợp đồng đưa vào hệ thống cất quay chân không để loại dung môi THF Hệ nano lycopen/pycnogenol nước sau làm lạnh -54oC Sau thời gian 24 đóng đá, mẫu lycopen/pycnogenol chuyển vào hệ thống thiết bị đông khô Cuối cùng, thu bột nano lycopen/pycnogenol mịn, tơi có màu đỏ tươi 2.2.4 Nghiên cứu phương pháp tạo bột nano - Phương pháp sấy phun - Phương pháp đơng khơ 2.2.5 Các phương pháp phân tích định lượng Định lượng lycopen resveratrol phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC quang phổ hấp thụ UV-Vis 2.2.6 Đánh giá độ bền hạt nano - Khảo sát biến đổi hàm lượng hợp chất hạt nano - Nghiên cứu biến đổi hình thái hạt nano 2.2.7 Các phương pháp phân tích cấu trúc tính chất vật liệu - Xác định cấu trúc vật liệu phổ hồng ngoại (FT-IR) phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) - Xác định khối lượng phân tử copolyme PLA-PEG GPC - Nghiên cứu phân bố kích thước hạt sản phẩm bột nano phương pháp tán xạ ánh sáng động DLS - Đánh giá hình thái kích thước mẫu vật liệu nano kính hiển vi điện tử truyền qua TEM CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết chiết tách lycopen, resveratrol tổng hợp copolyme PLAPEG, sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho trình chế tạo hệ nano 3.1.1 Chiết tách hợp chất lycopen từ màng gấc 3.1.1.1 Xác định nhiệt độ, thời gian thích hợp cho q trình sấy màng gấc Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thời gian thích hợp cho việc sấy màng hạt gấc 60oC vịng 15 3.1.1.2 Xác định dung mơi hữu phù hợp để chiết lycopen từ màng gấc khô phương pháp soxhlet Hợp chất tan tốt dung mơi cloroform, sau giảm dần từ tetrahydrofuran, diclometan đến hexan Tuy nhiên, độc tính thấp nhất, diclometan lựa chọn dung mơi thích hợp để chiết lycopen 3.1.1.3 Đánh giá cấu trúc độ tinh khiết lycopen chiết tách a) Phân tích cấu trúc lycopen chiết tách phổ FT-IR Trên phổ FT-IR xuất băng sóng hấp thụ đặc trưng cho nhóm chức có mặt phân tử Băng sóng xuất 3038 cm−1 đặc trưng cho dao động hóa trị liên kết =CH (alkene), 2912 cm−1 2854 cm−1 đặc trưng cho dao động hóa trị liên kết =CH (alkane) Dao động hóa trị đặc trưng liên kết C=C (alkene) xuất 1626 cm−1 Các băng sóng xuất 1439 cm−1 1390 cm−1 băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động biến dạng nhóm –CH2 -CH3 Đặc biệt, băng sóng hấp thụ mạnh 959 cm−1 đặc trưng cho dao động biến dạng mặt phẳng =CH (trans-alkene) b) Phân tích cấu trúc lycopen chiết tách phổ NMR Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo lycopen Trên phổ H-NMR xuất tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho proton có mặt phân tử Tín hiệu cộng hưởng xuất trường yếu δ=6,66-6,60 ppm (m, 2H) quy kết cho proton H-7&H-11 Các proton khác alkene quy kết cụ thể sau: δ=6,49 ppm (dd, J=11,0; 15,0 Hz; 1H; H-12); 6,35 ppm (d; J=15,0 Hz, 1H; H-8); 6,26-6,19 ppm (m; 2H; H-15&H-14); 6,18 ppm (d; J=11,5 Hz; 1H; H-10); 5,95 ppm (d; J=11,0 Hz; 1H; H-6); 5,12-5,09 ppm (m; 1H; H-2) Các proton khác phần alkane quy kết cụ thể sau: 2,12 ppm (d; J=4,5 Hz; 4H; H4&H-3); 1,97 ppm (s; 6H; 2CH3); 1,82 ppm (s; 3H; CH3), 1,69 ppm (s; 3H; CH3), 1,61 ppm (s; 3H; CH3) Phổ 13C-NMR tín hiệu cộng hưởng đặc trưng nguyên tử carbon tương đươn g có mặt phân tử Tín hiệu cộng hưởng xuất trường yếu δ=139,5 ppm gán cho C-5 Các tín hiệu cộng hưởng nguyên tử carbon alkene quy kết sau: δppm: 137,4 (C13); 136,5 (C-9); 136,2 (C-1); 135,4 (C-12); 132,7 (C-15); 131,6 (C-8); 130,1 (C-14); 125,8 (C-7); 125,2 (C-6); 124,0 (C-2); 40,2 (C-4); 26,7 (C-3); 25,6 (CH3); 17,7 (CH3); 17,0 (CH3); 12,9 (CH3); 12,8 (CH3) So sánh liệu thu với phổ chuẩn lycopen cho thấy, tín hiệu xuất hồn tồn phù hợp, chứng tỏ sản phẩm sau tách chiết lycopen c) Định lượng lycopen quang phổ hấp thụ UV-Vis Phổ UV-Vis cho thấy, nồng độ, băng sóng hấp thụ 517 nm mẫu lycopen chiết tách cao mẫu lycopen chuẩn có độ tinh khiết 98% Sigma-Aldrich khoảng 1% Như vậy, kết luận độ tinh khiết mẫu lycopen chiết tách đạt độ tinh khiết 98% d) Định lượng lycopen phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 750 500 250 10 20 30 40 50 60 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu lycopen chiết tách khai triển hệ dung môi MeOH:ACN:DCM (10:50:40) Kết định lượng HPLC (Hình 3.10) cho thấy lycopen chiết tách đạt độ tinh khiết > 98%, kết phù hợp với kết định lượng phổ UV-Vis 3.1.1.4 Bảo quản lycopen Lycopen bị phân hủy nhanh chóng bảo quản nhiệt độ phịng Ở nhiệt độ 4oC, tương ứng với nhiệt độ ngăn mát tủ lạnh, lycopen bị phân hủy chậm Ở nhiệt độ -16oC, lycopen tương đối bền, hàm lượng lycopen lại 92% sau tháng bảo quản Do vậy, điều kiện bảo quản lycopen bao gói lycopen giấy bạc, hút chân khơng, sau lưu trữ -16oC 3.1.2 Nghiên cứu chiết tách hợp chất resveratrol từ rễ cốt khí củ 3.1.2.1 Phân tích cấu trúc resveratrol sau q trình chiết tách a) Phân tích cấu trúc resveratrol chiết tách phổ FT-IR Phổ FT-IR cho thấy tín hiệu đặc trưng resveratrol Băng sóng hấp thụ rõ nét xuất 3230 cm−1, đặc trưng cho dao động hóa trị liên kết O−H (phenol) Băng sóng hấp thụ 3021 cm−1 đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm vinyl (=C−H), 2890 cm−1 thể dao động hóa trị liên kết =C−H (alkane) Các dao động hóa trị ν(C=C) vòng benzen thể băng sóng hấp thụ 1609 cm−1, 1579 cm−1, 1510 cm−1 1447 cm−1 Dao động biến dạng mặt phẳng nhóm OH xuất băng sóng hấp thụ 1382 cm−1 Dao động hóa trị liên kết C-O (từ nhóm phenol) thể rõ phổ 1150 cm−1 Ngồi ra, băng sóng hấp thụ 968 cm−1 đặc trưng cho dao động biến dạng liên kết C-H thay C=C từ định hướng trans Đối với băng sóng 833 cm−1 đặc trưng cho dao động biến dạng liên kết C-H vòng benzene 673 cm−1 băng sóng thể dao động biến dạng ngồi mặt phẳng γ(OH) nhóm -OH b) Phân tích cấu trúc resveratrol chiết tách phổ NMR Hình 3.15 Cơng thức cấu tạo resveratrol Kết phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) cho thấy tín hiệu đặc trưng cho proton resveratrol Các tín hiệu cộng hưởng vùng δH 6,11-7,38 ppm đặc trưng cấu trúc dạng phenolic resveratrol Các tín hiệu proton xuất H 6,38 (d, J = 2,0; 2H) 6,11 (t, J = 2,0; 1H) cho thấy có mặt vịng thơm có cấu trúc đối xứng bị vị trí 1, Bên cạnh đó, xuất cặp tín hiệu thuộc hệ tương tác spin hệ AA'- BB' H 6,75 (d, J = - Tín hiệu δ=5,03 ppm proton nhóm CH PLA Tín hiệu δ=3,63 ppm proton nhóm CH2 PEG Phổ C-NMR tín hiệu đặc trưng nguyên tử C Quy kết 13 tín hiệu cộng hưởng cho nguyên tử cacbon copolyme PLAPEG cho kết sau: - Tín hiệu δ=169,5 cacbon nhóm C=O PLA - Tín hiệu δ=77,2 cacbon nhóm O-CH2 PEG - Tín hiệu δ=70,5 cacbon nhóm O-CH PLA - Tín hiệu δ=16,7 cacbon nhóm methyl CH3 PLA 3.2 Kết chế tạo hệ nano chứa số hợp chất lycopen, resveratrol pycnogenol 3.2.1 Kết chế tạo nano lycopen 3.2.1.1 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt tới trình chế tạo nano lycopen 12 Sự phân bố (%) 10 NLy21 NLy12 NLy1 0 50 100 150 200 250 Đường kính hạt (nm) Hình 3.23 Giản đồ phân bố kích thước hạt nano lycopen theo tỷ lệ khác lycopen chất hoạt động bề mặt tween 80 Các mẫu NLy1, NLy12, NLy21 tương ứng với tỷ lệ hàm lượng lycopen/tween 80 1/1, 1/2 2/1 cho kết đường kính hạt trung bình 55 nm, 65 nm 76 nm (Hình 3.23) Giản đồ phân bố kích thước 11 hạt cho thấy mẫu NLy1 có phân bố hẹp kích thước hạt trung bình 100 nm Do đó, tỷ lệ lycopen/tween 80 1/1 lựa chọn cho công thức nano lycopen Để đánh giá hiệu chất hoạt động bề mặt tới trình chế tạo hạt nano lycopen, chất hoạt động bề mặt Tween 80 công thức chế tạo nano thay cremophor RH40 Kết đo DLS mẫu nano lycopen cho thấy tiểu phân mẫu NLy1 (sử dụng chất hoạt động bề mặt tween 80) tiểu phân mẫu NLy11 (sử dụng chất hoạt động bề mặt cremophor RH40) có đường kính hạt trung bình 55 nm 51 nm (Hình 3.24) Khơng có khác biệt đáng kể mẫu Tuy nhiên, Polysorbate 80 chất hoạt động bề mặt có tính phổ biến giá thành rẻ so với cremophor RH40 Do đó, Tween 80 lựa chọn chất hoạt động bề mặt cho trình chế tạo hệ hạt nano 12 Sự phân bố (%) 10 NLy1 NLy11 0 50 100 150 200 250 300 350 Đường kính hạt (nm) Hình 3.24 Giản đồ phân bố kích thước hạt nano lycopen sử dụng chất hoạt động bề mặt cremophor RH40 Tween 80 3.2.1.2 Đánh giá khả phân tán nước mẫu bột nano lycopen 12 Bảng 3.10 Kết đánh giá khả phân tán nước lycopen Mẫu Lycopen NLy1 (4% lycopen) NLy3 (8% lycopen) NLy5 (12% lycopen) mẫu nano lycopen Khả phân tán Quan sát đáy lọ thủy tinh nước sau 01 ngày Rất Lắng Rất tốt Rất Rất tốt Rất Tốt Có tượng lắng 3.2.1.3 Phân tích cấu trúc mẫu bột nano lycopen Phổ FT-IR cho thấy băng sóng đặc trưng PEG: 3438 cm−1 (OH), 2886 cm−1 (CHstr(sp2)), hay 1111 cm−1 đặc trưng liên kết nhóm C–C–O C–C–H, thể rõ phổ hồng ngoại mẫu bột NLy1, NLy3 NLy5 Đối với băng sóng đặc trưng lycopen: băng sóng hấp thụ 2907 cm−1, 2850 cm−1 (CHstr(sp3)), 1670 cm−1, 1642 cm−1 (C=Cstr(trans)), 1443 cm−1 (CH2(dao động biến dạng)) 963 cm−1 (CH(trans OOP)) có xuất mẫu nano lycopen không rõ nét Điều lý giải hàm lượng lycopen chứa mẫu bột nano nhiều so với hàm lượng chất mang PEG nano lycopen 3.2.1.4 Hình thái phân bố kích thước hạt nano lycopen Giản đồ phân bố kích thước hạt (Hình 3.28 a) cho thấy, mẫu Nly1, NLy3 NLy5 (với hàm lượng lycopen từ 4-12%) có đường kính hạt trung bình 55 nm, 135 nm 289 nm, tương ứng với kết ảnh TEM (Hình 3.28 b, c d) Sự thay đổi kích thước hạt mẫu tỷ lệ thuận với hàm lượng lycopen có mẫu bột nano, có nghĩa hàm lượng lycopen tăng dẫn tới kích thước hạt lớn dần Ảnh TEM hạt nano lycopen có dạng hình cầu, phân bố đồng khơng có tượng kết đám với 13 Hình 3.28 Giản đồ phân bố kích thước hạt mẫu bột nano lycopen (a) ảnh TEM mẫu (b)-NLy1, (c)- NLy3, (d)- NLy5 3.2.1.5 Đánh giá độ bền nano lycopen Ở điều kiện nhiệt độ phịng, lycopen có mẫu bột nano bị phân hủy đáng kể (Bảng 3.11) Bảng 3.11 Độ bền lycopen mẫu bột nano theo thời gian bảo quản nhiệt độ phòng Độ bền (Hàm lượng lycopen lại (%)) Mẫu ngày 15 ngày 30 ngày 60 ngày 90 ngày NLy1 100 90,2 80,4 70,2 60,1 NLy3 100 91,3 82,7 73,6 64,5 NLy5 100 92,4 84,9 76,9 69,0 Sau thời gian 90 ngày bảo quản, hàm lượng lycopen lại mẫu NLy1, NLy3 NLy5 60,1%, 64,5% 69% Như vậy, phân hủy lycopen nhanh xảy mẫu NLy1 tương ứng với hàm lượng lycopen có mẫu 4%, sau đến mẫu NLy3 (hàm lượng lycopen 14 8%) cuối phân hủy lycopen xảy chậm mẫu NLy5 (hàm lượng lycopen 12%) 3.2.2 Kết chế tạo nano resveratrol 3.2.2.1 Đánh giá khả phân tán nước mẫu bột nano resveratrol Bảng 3.12 Khả phân tán nước resveratrol mẫu nano resveratrol Khả phân tán Quan sát đáy lọ thủy Mẫu nước tinh sau 01 ngày Resveratrol NR1 (10% resveratrol) NR2 (15% resveratrol) NR3 (20% resveratrol) Rất Lắng Rất tốt Rất Rất tốt Rất Rất Tốt Trong khơng có tượng bị lắng 3.2.2.2 Phân tích cấu trúc mẫu bột nano resveratrol Một số băng sóng đặc trưng PEG xuất rõ nét phổ FT-IR: 3438 cm−1 (-OH), 2886 cm−1 (CHstr(sp2)), hay 1111 cm−1 đặc trưng liên kết nhóm C–C–O C–C–H, thể rõ phổ hồng ngoại mẫu bột NR1, NR2 NR3 Một số băng sóng đặc trưng resveratrol như: băng sóng hấp thụ 3279 cm−1 (-OH), 964 cm−1 (transolefinic), 1584 cm−1 (C=C) 1145 cm−1 (C-O) có xuất mẫu nano resveratrol không rõ nét Điều lý giải hàm lượng resveratrol chứa mẫu bột nano nhiều so với hàm lượng chất mang PEG nano resveratrol 3.2.2.3 Hình thái hạt nano resveratrol Giản đồ phân bố kích thước hạt Hình 3.32a cho thấy hạt nano resveratrol NR1, NR2 NR3 có đường kính hạt trung bình 12 nm, 19 nm 38 nm, tương ứng với ảnh TEM (Hình 3.32 b, c d) Nhận thấy, hàm lượng resveratrol tăng dẫn tới kích thước hạt nano tăng dần Ảnh 15 TEM (Hình 3.32b) cho thấy, sản phẩm nano chứa hàm lượng resveratrol 10% (NR1) có dạng hình cầu, kích thước hạt nhỏ dải từ 10-18 nm Tương tự hình 3.32c d, kích thước hạt nano dải từ 14-21 nm (mẫu NR2), 35-42 nm với mẫu NR3 Hình thái hạt phân bố kích thước hạt mẫu bột nano hoàn toàn tương ứng với đánh giá cảm quan phân tán nước mẫu bột sản phẩm thu Hình 3.32 Giản đồ phân bố kích thước hạt mẫu bột nano resveratrol (a) ảnh TEM mẫu (b)-NR1, (c)- NR2, (d)- NR3 3.2.2.4 Khảo sát độ ổn định hình thái hạt nano resveratrol mơi trường có độ pH khác Kết nghiên cứu cho thấy nano resveratrol tương đối ổn định điều kiện môi trường axit, tốc độ phân hủy nano resveratrol tăng lên nhanh môi trường kiềm Cụ thể, pH 4,5 7, hàm lượng resveratrol lại 90% 62,8% sau ngày, nhiên pH hàm lượng resveratrol lại sau ngày 51,4% pH hàm lượng resveratrol lại sau 180 phút 20,5% Trong đó, theo nghiên cứu Š Zupančič, Z Lavrič, J Kristl pH 9, trans-resveratrol bị 16 phân hủy hoàn toàn vòng 10,1 phút Như vậy, việc bào chế resveratrol dạng hạt nano nâng cao độ ổn định resveratrol Điều giải thích vai trò chất hoạt động bề mặt tween 80 chất bao bọc PEG 6000 giúp bảo vệ resveratrol khỏi tác động môi trường kiềm 3.2.3 Kết chế tạo hệ nano lycopen/resveratrol 3.2.3.1 Phân tích cấu trúc hệ nano lycopen/resveratrol Nhận thấy rằng, băng sóng hấp thụ đặc trưng nhóm -OH phổ FT-IR resveratrol 3250 cm−1 Tuy nhiên, phổ FT-IR hệ S1, S4 S7 cho thấy nhóm -OH resveratrol kéo dài chuyển sang vị trí dao động 3365 cm−1, 3398 cm−1, 3375 cm−1, điều có tương tác liên kết hydro liên phân tử xảy resveratrol chất hoạt động bề mặt/copolyme PLA-PEG Bên cạnh đó, băng sóng hấp thụ lycopen hệ nano S1, S4 S7 phổ FT-IR dịch chuyển dao động so với băng sóng đặc trưng phổ FT-IR lycopen Ví dụ, dao động CHstr(sp2) lycopen hệ nano có xu hướng dịch gần bước sóng 2923 cm−1, 2924 cm−1, 2922 cm−1 dao động phổ FT-IR lycopen tinh khiết 3038 cm−1 Sự thay đổi vị trí băng sóng hấp thụ cho thấy tương hợp tốt lycopen copolyme PLA-PEG Một ví dụ khác cho thấy dao động C=Cstr(trans) lycopen hệ nano S1, S4 S7 bước sóng 1593 cm−1, 1604 cm−1, 1604 cm−1 dao động lycopen tinh khiết 1625 cm−1 Hiện tượng tương tác ngoại phân tử lycopen resveratrol Cấu trúc hệ nano phân tích phổ UV-Vis Các băng sóng hấp thụ đặc trưng resveratrol hệ nano xuất hai bước sóng 295 nm 310 nm Ba băng sóng pic hấp thụ đặc trưng lycopen hệ nano 450 nm, 479 nm, 510 nm Phổ UV-Vis cho thấy, cường độ hấp thụ pic resveratrol lycopen 17 mẫu tương ứng tỷ lệ với tỷ lệ hàm lượng hai hợp chất resveratrol lycopen có hệ nano lycopen/resveratrol 3.2.3.2 Đặc điểm hình thái phân bố kích thước hạt hệ nano lycopen/resveratrol Giản đồ phân bố kích thước hạt mẫu S1, S4 S7 nước Hình 3.39a rằng, đường kính hạt trung bình mẫu 66 nm, 79 nm 102 nm Ảnh TEM (Hình 3.39b, 3.39c 3.39d) cho thấy, hạt nano thu có dạng hình cầu Kích thước hạt tỷ lệ thuận với tỷ lệ lycopen/resveratrol Sự tương hợp tốt lycopen resveratrol trình chế tạo cho hệ hạt nano phân bố tương đối đồng đều, kích thước hạt nhỏ 100 nm tổng hàm lượng hai hợp chất lycopen resveratrol lên tới 12% Hình 3.39 Giản đồ phân bố kích thước hạt (a) ảnh TEM mẫu (b)- S1, (c)- S4, (d)- S7 Kết đánh giá hình thái phân bố kích thước hạt cho thấy kết hợp hợp chất tự nhiên cho sản phẩm tổ hợp có tác dụng hiệp đồng tối ưu Hệ nano lycopen/resveratrol chứa hàm lượng lycopen 4% resveratrol 8%, tức tổng hàm lượng hai hợp chất lên tới 12% kích 18 thước hạt trung bình hệ đạt 66 nm Trong đó, mẫu nano lycopen chế tạo Mục 3.2.1 hàm lượng lycopen 10% kích thước vật liệu nano tăng lên đáng kể 200 nm Đối với mẫu nano resveratrol (Mục 3.2.2) kích thước hạt trung bình sản phẩm đạt 100 nm hàm lượng resveratrol lên tới 20% Như vậy, hệ hạt nano lycopen/resveratrol cho thấy tương hợp tốt lycopen resveratrol Resveratrol thể vai trị giảm kích thước hạt tăng khả phân bố đồng hạt nano hệ 3.2.3.3 Đánh giá độ bền lycopen mẫu hệ nano lycopen/resveratrol Bảng 3.13 Độ bền lycopen mẫu bột hệ nano lycopen/resveratrol theo thời gian bảo quản nhiệt độ phòng Độ bền (Hàm lượng lycopen lại (%)) Mẫu ngày 15 ngày 30 ngày 60 ngày 90 ngày S1 100 97,3 94,6 91,8 88,8 S2 100 97,9 95,7 93,2 90,8 S3 100 97,5 95,0 93,0 90,5 S4 100 96,5 92,9 89,0 85,0 S5 100 97,2 94,2 90,2 86,8 S6 100 97,0 94,3 90,1 86,2 S7 100 96,0 91,9 87,6 83,2 S8 100 96,6 92,2 88,8 84,6 S9 100 96,8 92,5 90,0 84,8 Bảng 3.14 Độ bền lycopen mẫu bột nano lycopen/resveratrol theo thời gian bảo quản nhiệt độ -16oC Độ bền (Hàm lượng lycopen lại (%)) Mẫu S1 ngày 15 ngày 30 ngày 60 ngày 90 ngày 100 99,2 98,2 96,5 94,8 19 S2 100 99,5 98,8 97,2 95,6 S3 100 99,4 98,4 96,9 95,3 S4 100 98,8 97,4 95,3 93,1 S5 100 99,1 98,0 96,1 94,2 S6 100 99,2 98,1 96,2 94,1 S7 100 98 96 93,8 91,5 S8 100 98,3 96,5 94,7 92,8 S9 100 98,4 96,7 94,9 93,0 Kết cho thấy tốc độ phân hủy lycopen bảo quản mẫu nhiệt độ -16oC (Bảng 3.14) chậm gần nửa so với tốc độ phân hủy hợp chất nhiệt độ phòng (Bảng 3.13) Hàm lượng lycopen lại mẫu bột nano S1, S4 S7 94,8%; 93,1% 91,5% hàm lượng lycopen cịn lại mẫu nhiệt độ phòng 88,8%; 85,0%; 83,2% Như vậy, điều kiện bảo quản hệ nano lycopen/resveratrol thích hợp mơi trường lạnh -16oC 3.2.4 Kết chế tạo hệ nano lycopen/pycnogenol 3.2.4.1 Phân tích cấu trúc hệ nano lycopen/pycnogenol Phổ FT-IR thể rõ băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động lycopen, pycnogenol copolyme mẫu S1, S2 S3 Cụ thể: băng sóng hấp thụ vùng 3600-2500 cm−1 đặc trưng cho dao động hóa trị -OH pycnogenol phân tử PEG (trong copolyme PLA-PEG), băng sóng hấp thụ 1100 cm−1 (CH(trans)) lycopen, dao động hóa trị CHstr(sp2) lycopen 2912 cm−1 có dịch chuyển nhẹ phổ FT-IR mẫu sản phẩm (đối với mẫu S1 băng sóng 2913 cm−1, mẫu S2 2916 cm−1 mẫu S3 2915 cm−1) Băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị C=C (của vịng thơm) 1610 cm−1 pycnogenol thể rõ phổ mẫu S1, S2 S3 Ngồi ra, nhận thấy rằng, băng sóng đặc trưng chất bao bọc vi nang copolyme PLA-PEG như: 20 2875 cm−1 (dao động hóa trị CH2 phân tử PLA), 1759 cm−1 (dao động hóa trị nhóm C=O PLA) 1454 cm−1 (dao động biến dạng CH) thể rõ nét phổ hồng ngoại mẫu 3.2.4.2 Đánh giá khả phân tán mẫu bột nano lycopen/pycnogenol Sự tương hợp tốt lycopen pycnogenol với chất hoạt động bề mặt tween 80 chất mang copolyme PLA-PEG tạo thành sản phẩm bột nano lycopen/pycnogenol có khả phân tán tốt nước khơng có dấu hiệu cộng kết sau nhiều ngày bảo quản điều kiện thường Cụ thể thời gian tự phân tán hoàn toàn nước 150 mg mẫu bột S1, S2 S3 phút, phút 3,5 phút Mẫu nano lycopen/pycnogenol với tỷ lệ hàm lượng lycopen/pycnogenol 1/2 cho dung dịch màu đỏ độ giảm dần tỷ lệ hàm lượng lycopen/pycnogenol tăng 3.2.4.3 Hình thái mẫu bột nano lycopen/pycnogenol Hình 3.45 Giản đồ phân bố kích thước hạt ảnh TEM mẫu bột nano lycopen/pycnogenol Giản đồ phân bố kích thước hạt cho thấy, mẫu S1, S2 S3 có đường kính hạt trung bình 73 nm, 85 nm 114 nm, tương ứng 21 với kết ảnh TEM (Hình 3.45) Sự thay đổi kích thước hạt mẫu tỷ lệ thuận với tỷ lệ hàm lượng lycopen/pycnogenol, có nghĩa tỷ lệ lycopen/pycnogenol tăng dẫn tới kích thước hạt lớn dần Ảnh TEM hạt nano lycopen/pycnogenol có dạng hình cầu, phân bố đồng khơng có tượng kết đám với 3.2.4.4 Đánh giá hình thái nano lycopen/pycnogenol môi trường pH khác Kết nghiên cứu hình thái hạt mơi trường pH=5 cho thấy mơi trường pH có ảnh hưởng tới tính chất hệ hạt nano Nano lycopen/pycnogenol dễ bị kết tập với phân tán môi trường axit Ở mơi trường bazơ kích thước hạt hình thái hạt nano khơng có thay đổi nhiều KẾT LUẬN Đã chiết tách hợp chất quý lycopen, resveratrol từ nguồn thảo dược Việt nam tổng hợp thành công copolyme PLA-PEG sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho trình chế tạo hệ nano chứa số hợp chất lycopen, resveratrol pycnogenol: + Lycopen resveratrol chiết tách thành cơng từ màng gấc rễ cốt khí củ phương pháp đơn giản, an toàn dễ thực hiện: - Hợp chất lycopen chiết từ màng gấc khô phương pháp soxhlet sử dụng dung môi hữu dichlometan tinh chế lycopen ethanol Lượng lycopen chiết tách khoảng 3,2-4,4 g/kg màng gấc khơ Lycopen thu có độ tinh khiết cao ≥ 98% - Hợp chất resveratrol chiết tách thành cơng từ rễ cốt khí củ phương pháp lên men chủng penicillium Lượng resveratrol chiết tách khoảng 3,0-4,5 g/kg rễ cốt khí củ Resveratrol thu có độ tinh khiết cao 92% + Copolyme PLA-PEG tổng hợp thành công với khối lượng Mw 8400 số PDI 1,2 Copolyme sử dụng làm chất bao bọc 22 vi nang cho trình chế tạo hệ nano chứa lycopen Đã chế tạo 04 loại sản phẩm nano hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm: Nano lycopen, nano resveratrol, hệ nano lycopen/resveratrol hệ nano lycopen/pycnogenol Tất dạng nano thu dạng bột mịn, có khả phân tán tốt nước, hạt nano thu dạng hình cầu có phân bố kích thước hạt đồng đều: - Nano lycopen nano resveratrol chế tạo thành công phương pháp sấy phun sử dụng chất hoạt động bề mặt tween 80 (với tỷ lệ hợp chất/chất hoạt động bề mặt thích hợp 1/1) chất bao bọc vi nang PEG 6000 + Các sản phẩm nano lycopen có hàm lượng lycopen từ 4-12% tương ứng với kích thước hạt trung bình từ 55-289 nm Độ bền mẫu bột nano lycopen bảo quản nhiệt độ phòng chưa cao, hàm lượng lycopen lại sau 90 ngày mẫu nano lycopen (chứa 4% lycopen) 60,1%, mẫu nano lycopen (chứa 8% lycopen) 64,5% mẫu chứa 12% lycopen 69,0%; + Kích thước hạt trung bình mẫu nano resveratrol từ 12-38 nm, Kích thước hạt tỷ lệ thuận với tỷ lệ hàm lượng lycopen có mẫu bột nano Độ ổn định hình thái hạt nano resveratrol có thay đổi đáng kể phân tán môi trường pH khác Tại pH 4,5 hạt nano dễ bị kết tập, đường kính hạt tăng từ 12 nm lên tới 85 nm Tại pH hạt nano bị phân hủy nhanh chóng, sau 180 phút hàm lượng resveratrol lại mẫu nano 20,5% - Các mẫu hệ nano lycopen/resveratrol với tỷ lệ 4% lycopen/8% resveratrol, 6% lycopen/6% resveratrol 8% lycopen/4% resveratrol chế tạo thành công phương pháp sấy phun Sản phẩm thu có khả phân tán tốt nước, hạt có dạng hình cầu, kích thước hạt nhỏ dải từ 66-102 nm phân bố đồng Sau 90 ngày bảo quản -16oC, sản phẩm hệ nano lycopen/resveratrol (hàm 23 lượng lycopen/resveratrol ½) với có mặt chất chống oxy hóa vitamin E cho độ bền cao Hàm lượng lycopen lại sau tháng đạt 95,6% - Các mẫu hệ nano lycopen/pycnogenol với tỷ lệ 4% lycopen/8% pycnogenol, 6% lycopen/6% pycnogenol 8% lycopen/4% pycnogenol chế tạo thành công phương pháp đông khô Những hạt nano thu có kích thước hạt trung bình khoảng từ 73114 nm Hình thái hạt nano môi trường pH cho kết nano lycopen/pycnogenol dễ bị kết tập với dẫn tới kích thước hạt tăng lên Trong đó, mơi trường pH hạt nano phân bố tương đối đồng đều, khơng có tượng kết đám đường kính hạt trung bình khơng thay đổi nhiều so với ban đầu NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đã xây dựng quy trình chiết tách tinh chế lycopen từ màng gấc phương pháp đơn giản, an toàn dễ triển khai quy mô công nghiệp Lycopen thu có độ tinh khiết cao 98% sử dụng làm nguyên liệu cho ngành dược phẩm thực phẩm chức Hai hệ nano chứa lycopen bao gồm hệ nano lycopen/resveratrol hệ nano lycopen/pycnogenol hai hệ vật liệu nano Các sản phẩm bột nano có khả phân tán tốt nước, kích thước hạt nhỏ 100 nm có độ bền cao Các sản phẩm có tiềm ứng dụng làm nguồn nguyên liệu cho công ty dược phẩm nước Việc chiết tách lycopen có độ tinh khiết cao 98% chế tạo thành công bột nano chứa lycopen từ nguồn nguyên liệu gấc góp phần nâng cao giá trị kinh tế gấc Việt nam 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Ho Thi Oanh, Nhung Hac Thi, Thanh Nhan Nguyen, Tuyet Anh Dang Thi, Tuyen Van Nguyen, Mai Ha Hoang, “Co-encapsulation of lycopene and resveratrol in polymeric nanoparticles: Morphology and lycopene stability”, Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 21, 3156-3164, 2021 Hoàng Mai Hà, Đặng Thị Tuyết Anh, Hồ Thị Oanh, Hắc Thị Nhung, Nguyễn Đức Tuyển, Nguyễn Văn Tuyến, “Phương pháp chiết tách lycopen tinh khiết trực tiếp từ màng gấc”, Bằng Độc quyền sáng chế số 27630, cấp theo Quyết định số 1240w/QĐ-SHTT, ngày 29/01/2021 Hoàng Mai Hà, Đặng Thị Tuyết Anh, Hồ Thị Oanh, Hắc Thị Nhung, Nguyễn Đức Tuyển, Nguyễn Văn Tuyến, “Phương pháp sản xuất hệ nano lycopen/resveratrol”, Bằng Độc quyền sáng chế số 27629, cấp theo Quyết định số 1208w/QĐ-SHTT, ngày 29/01/2021 Hồ Thị Oanh, Nguyễn Thị Linh, Nguyễn Đức Tuyển, Đặng Thị Tuyết Anh, Hoàng Mai Hà, Chế tạo hạt nano lycopen/pycnogenol định hướng ứng dụng dược phẩm mỹ phẩm, Tạp chí Hóa học, 58(5E12), 276-281, 2020 Ho Thi Oanh, Nguyen Thanh Nhan, Hac Thi Nhung, Hoang Mai Ha, “Preparation and charaterization of lycopene nanoparticles”, 9th National Conference of the Vietnam Organic Chemistry Association, 81-83, 2019 Hồ Thị Oanh, Hoàng Mai Hà, “Chế tạo nghiên cứu độ ổn định hạt nano resveratrol”, Tạp chí Hóa học, 57(6E1,2), 125-129, 2019 Ho Thi Oanh, Hac Thi Nhung, Tran Thi Thanh Hop, Nguyen Duc Tuyen, Duong Thi Hai Yen, Pham Xuan Manh, Pham Duy Linh, Hoang Mai Ha, “Synthesis and characterization of polylactidee- based composites”, The international scientific conference on Chemistry for Sustainable Development, 2018 Ho Thi Oanh, Dang Thi Tuyet Anh, Nguyen Van Tuyen, Duong Thi Hai Yen, Hac Thi Nhung, Nguyen Duc Tuyen, Pham Xuan Manh, Pham Duy Linh, Pham Thi Ha Anh, Hoang Mai Ha, “Preparation and characterization of lycopene nanoparticles for pharmaceutical applications”, Vietnam Journal of Chemistry, 56(4e), 27-31, 2018 Ho Thi Oanh, Hac Thi Nhung, Nguyen Duc Tuyen, Le Thi Kim Van, Trinh Hien Trung, Hoang Mai Ha, “Extraction of Lycopene from Gac Fruit and Preparation of Nanolycopene”, Vietnam Journal of Chemistry, 55(6), 761-766, 2017 25 ... dụng làm chất bao bọc vi nang cho hệ nano tổ hợp chứa lycopen; - Nghiên cứu chế tạo nano lycopen, nano resveratrol có khả phân tán tốt nước Xác định hình thái, cấu trúc, tính chất mẫu nano phương... biệt hệ nano lycopen /resveratrol hệ nano lycopen /pycnogenol Chính vậy, nghiên cứu chế tạo hai hệ nano hướng nghiên cứu cần thiết Do đó, việc thực đề tài luận án: ? ?Nghiên cứu chế tạo, xác định hình. .. sát độ bền bột nano điều kiện bảo quản môi trường khác nhau; - Nghiên cứu chế tạo hệ nano lycopen /resveratrol hệ nano lycopen /pycnogenol Xác định hình thái, cấu trúc tính chất mẫu nano phương pháp