SINH HỌC HAY VỀ TẾ BÀO

Kiến thức hay về sinh học trong lĩnh vực tế bào học được dùng trong chương trình học và ôn tập thi tốt nghiệp trung học phổ thông và ôn thi đại học, cao đẳng, bổ sung các kiến thức quan trọng về tế bào học

CHƯƠNG DÒNG NẮNG L U Ợ N TRONG CÁC HỆ THỐNC 8Ố N G Các động vật nói chung người nói riêng thưịng thu nhận lượng từ sản phẩm diDh dưỡng Các thực phẩm ngiiời srạo, đậu, khoai táy, táo thường nhận trực tiếp từ thực vật, thứ khác nhu thịt ỈỢn, thịt bị, sữa, cá, tơm, thi lại lấy từ động vật Nhimg động vật đến iKỢt lại nhận n&ng ỉitợng ản thực vật khác Suy đến động vật nhận tồn thức ăn nủng lượng từ thực vật Thực vật, để sinh trưỏng thi cần có nưóc, khí cacbonic, muối nitđ nhimg đặc biệt quan trọng đốỉ với chúng ỉà dịng lượng dồi dảo có tia sáng Mặt trời Như ánh sáng Mặt trời toàn nguồn nảng lượng sinh học hành tinh Nảng lượng tia sáng Mặt tròi xuất phát từ nảng lượng hạt nhán: nhiệt độ rấ t cao ỏ trung tâm Mặt trời, hydro biến thành nguyên tử heli giải phóng n&ng lượng ỉúc đầu ỉà ỏ dạng tỉa gama (y) Phân ứng xày theo phKơng trình; 4H -> He + 2c + h \ đầy h - số Planck (6,6261 X 10"®^ J.s); V - độ dài sóng gama Sau đó, dõ tướng tác cÃa tia gama vđi điận tử, n&Qg lượng lại giải phóng diẩới dạng photon ỉượng ánh sáng mà Mật tròi tỏa Nhưng Trái đất thu nhận phần nhỏ lượng ánh sáng Mặt trời tới, bồi ỉẽ Trái đất có khu vực khống có thực vật bào thân thực vật trinh quang hỢp sử dụng tới gần 3% nảng lượng đến với chứng để tổng hợp nên hợp chất hữu cd Khi thực vật bị động vật ăn bị vi sinh vật phân giải thi hợp chất hữu bị oxy hóa giải phóng nảng lượng Thường sơ' htợng tU(mg ứng với số ỉượng dừng để tổng hợp nên hợp chất hữu (định luật thứ nhiệt động học); nhimg phần nâng ỉượng biến thành nhiệt nghĩa không sử dụng vể sau (định luật thứ hai nhiệt động học) Nếu động vật &n động vật khác 98 nảng lượng có lợi ngày bị Cuối tồn ỉượng ánh sáng lúc đầu thực vặt hấp thụ trình quang hợp biến thành nhiệt tỏa mơi tnrịng xung quanh Những tính tốn đơn giàn tổng luợng gluxit tồn thực vật Trái đất sơng cạn, nưỏc cơ' định được, chiếm gần 200 tý tín nám Thực vật cạn tổng hợp gần 1/10 sơ' ỉượng đó, phần cịn lại thực vật biển, chủ yêu ỉoại tảo hiển vỉ ỏ biển tổng hợp Để tạo thành mol glucoza (180g) cần phải hấp thụ 680.000 calo nảng lượng ánh sáng Nếu tính cách đơn giản: tồn gỉuxit cơ' định đểu ỏ dạng gỉiicoza nàm cần có lo'* cal ỉượng sinh học Nếu túih nhửng mát đại lượng chung dòng nảng ỉượng sinh học tảng lên đến 0 lần tức ỉà khoảng ^' cal litợng Mặt trời thu nhận điíợc nảm Tiiy nhiên số chiêm khoảng 1/1000 toàn lượng Mặt trời (gần 13.10^* cal nảm, khoảng triệu tý tỷ calo giây) rơi vào Trái đất nàm Ngưịi ta tính ráng nhị hoạt động cáy xanh khí cacbonic khí hịa tan thủy vực điíỢc đổi vịng 300 năm, cịn tồn oxy cúa khí đổi mói sau 0 năm D Ạ N G C H U Y Ể N H Ó A NĂNG L Ư Ợ N G T H Ứ N H Ấ T : Q U A N G H Ợ P 4.1.1 Đại cuong vá quang hợp Quang hợp trinh tế bào xanh hấp thụ biến đổi liíỢng ánh sáng Mật trời thành ATP NADPH2 để tổng hợp nên phân tử hữii cđ từ khí cacbonic lutớc giải phóng oxy ph&n tử vào khí qiiyển Do ta biển diền quang hỢp phương trình đơn giản sau: C + H Anh Sàng Thụtvật [CH 2O] + H ịO + O Hydratcacbon Các hydratcacbon qiiaug hỢp tạo chứa nhiều lượng so vối ugiij’ên liệu ban đầu CO2 H^o Như vậy, nhờ tiêu thụ lượng Mặt tròi mà tế bào xanh có khả nảng biến đổi chất nghồo n&ng lượng CO2 H 2O thành hợp chất nhiều lượng: hydratcacbon Do coi qiiang hợp q trình biến híợng xạ Mặt trịi thành náng liíợng hóa học mơ thực vật 99 • Tầm q u an trọ n g quang hỢp Trái đất hành tinh tám ánh sáng Tất cà luơng thực, nhiên liệu hóa thạch (dầu UIỎ, than đá, khí đốt) nhiên liệu sinh học (sinh khôi) cho đời sốhg người đểu bát nguồn từ trình quang hợp cá khứ Quang hợp hấp thụ chưa đầy 1% luợng cùa ánh sáng vùng phổ nhìn thấy đến Trái đất mà cung cấp hđii 90% nàng lượng cho người sử dụng Các thể tự dưdng tạo thức ăn cho cho cà sinh vật dị dudng Không quang hợp cịn giâi phóiig oxy phân tử - chất nhặn điện tử cl cho hơ hấp hiến khí Quang hợp góp phầụ điểii hịa chu trình cacbon oxy tự nhiên Vi lẽ đó, phần ba tliế kỷ truớc đây, nảni 1960, nhà sinh học phán tử tiếng ngitòi Huugari Szeiit - Georgy đà viết: "Cái thúc đẩy sống hành tinh này? Đó dòng diệỉi nhò tê bào xanh hấp thụ từ áuh sáng Mạt trời" 4.1.2 Ánh sáng • Ánh sáng gồm nhiĩiig hạt nảug iượng uhô bé riêng nhau, không mang điện gọi photon Đồng thời ánh sáng có bân chất sóng Ánh sáng màu khác có độ dài sóiig định Các photon khơng phải tất câ đểu có mức Ợng: số photon chứa nhỉềii lượng, sơ' khác ỉại chứa náng lượng Năng iKỢng photon đitợc biểu thị bằug cơiỉg thức; c - tốic độ ánh sáng (3 Xlo " cin/s); ) - độ dài sóng; /i- hàng 8Ỏ Planck (6,6261 X 10 '** J.s) Nàng luợng ánh sáiig tỷ ỉệ nghịch với độ dài sóng ánh sáng Ánh sáng có độ dài sóng ngủn chứa photon có lượng cao photon ánh sáng sóng dài • Ánh sáng Mặt tròi gổin photon với mức nảng lượng khác nhau, có áiih sáng nhìn thấy măt câm nhận điíợc Photon có nâng lượng cao nhà't phổ điện từ tia gama vdi độ dài sóng chưa tới nanomet ( Inni), cịn photon có mức nàng lượng thấp với độ dài sóng hàng nghìn mét sóng radio 100 • Áiih sáng nhin thấy chi phần nhò phổ điện từ Trong phổ nliin thấy, ánh sáng xanh có dộ dài sóng ngắn nhát có photon luợng lỏn nhất, cịn ánh sủng đỏ có (tộ dài sóng dài có photon náng luợng thấp nhâ't Chiểu nang lưọng tang «A /W W \A A y\ -Chié ỉu bước sóng tăng OAịl nm r irn 10 100 nm 0,01 cm Tia gama 380rtm 430 nm Anh TìaX sáng 500 nm ỹm Hổng ngoại 1^ IOOị M Sóng vơ tuyốn S6Ồ nm 600 nm 750 f>m Phổdicn lìf • Như biết, diện tử chiếm mức ỉượng riêng quỹ đạo cÃa chúng, xung quanh hạt nhân nguyẽu tử Để nâng điện tứ đến mức lượng khác cần phải có số lượng tương ứng không không'kém Do đỏ, nguyên tử riêng biệt hấp ihụ uhữug photoii uào ciia ánh sáng có mức lượng tUdng ứng Một nguyên tử phán tứ cho, thường có vùng photon riêng hay mộc phổ háp thụ đặc tndtg Nói cách khảc, phổ hấp thụ uguyên tử phân tứ phụ thuộc vào mức ỉượng điện tử đnợc dừng ỏ ngun tử phân tử dó • Nảng hrợng cần clể cluiyển điện tử từ quỷ đạo sang quỹ đạo khác điíợc xác định bdi hiệu sơ mức nảng luợng tKơng ứng hai quỹ đạo Do ỉượng photon phải sử dụng toàn (không thể sử dụng phầii) Iihững quang tử mà lượng cúa chúng gảy (litợc chuyển điện tử sang quỹ đạo tiíđng ứng bị hấp thụ 101 • Phản ứng quang hóa phân ứng ngiiyên tử phán tử bị kích thích ảnh hường ánh sáng tham gia Vi thế, để phân ứng quang hóa xây ra, phân tử phải hấp thụ ánh sáng Thường sơ' photon bị hấp thụ sơ’ phân tử bị kích thích có tỷ lệ sơ* luỢĐg xác định Nếu phân tử hút photon, để chuyển phan tử gam vật chất (6.10^® phân tứ) sang trạng thái kích thích cần có 6.10^’ photon Đại lượng mol photon gọi ỉà einstein Có thể tính lượng einstein ChKơng sơ"của 2854 lo ’ cal vói độ dài sóng tính nanomet • Đối với phân ứng quang hóa có ý nghĩa đặc biệt to lớn cặp điện tứ không phân chia chứa phân tử có nguyên tử nitơ oxy khống tham gia vào hình thành liên kết Hai điện tử phân bô' cừng quỹ đạo phải quay theo hai hưổDg đối Khi hai điện tử kích thích nhờ hấp thụ photon chuyển quỹ đạo ngồi có mức nảng luợng cao hướng quay chúng đối (trạng thái singlet) giốhg (trạng thái triplet) Xác suất chuyển trực tiếp từ trạng thái gốc sang trạng thái triplet vô bé Thường trạng thái triplet đạt đuợc cách chuyển vị nội từ trạng thái singlet cấu hình điện tử Khi chuyển phản tử kích thích trạng thái sÌDglet trỏ trạng thái gốc thườne kèm theo huỳnh quang (Auorescence) Thời gian tắt rấ t ngắn ( 10 *“s) không phụ thuộc vào nhiệt độ Còn chuyển từ trạng thái singỉet sang trạng thái triplet gây phát quang (phosphorescence) Quá trinh kéo dài nhiều (từ icr^ đến s) • Tuy nhiên phản ứng quang hóa có ý nghĩa quan trọng mặt sinh học không liên quan đến phát quang, mà chuyển không phát xạ từ trạng thái trỉplet vể trạng thái gốc, thời gian đ6 nâng luợng không thẳi dạng ánh sáng mà chityển vào hợp chất hóa bọc phản ứng hộ thống khác Sự tham gia phân tử crong phản ứng hóa học trạng thái triplet có thời gian tồn lổn hđQ, có độ tin cậy idn hdn so với tham gia trạng thái singỉet TroDg quang hợp chuyển không phát xạ từ trạng thái triplet trạng thái gốc xảy phân tử nhất: phân tử clorophyl 4.1.3 Sắc tấ quang hợp v i thu luọng ánh séng liỏn Ici) hóa học Các phân tử hữii có khả hấp thụ ánh sáng gọi sắc tô 102 Khi nảng lượng ánh sáng đitợc thu giữ phán tử sắc tơ' luợng photon ctuợc SÍI dụng để náng điện tử phân tử sắc tơ' lên niức náng lượng cao Trong thiíc vật tào thiỉờng có mặt ba loại sắc tơí; clorophji carotenoit pliicobilin, clorophyl carotenoit hai sác tơ'chính Clorophyl sác tơ' làm cho thiíc vật có màu xanh lục đặc trưng, thực vật bậc cao tào thưịiig có hai dạng clorophj’l a b Clorophyl a có cơng thức ngun C5r,H7iN ;,Mg có khối lượng phán tử 892 Cloroph}i b có cóng thức ngun Cr,5H 7i,N,0 ,jMg có khơi lơợng phân tử ỉà 906 Clorophyl a có ìihóm CHa cịn clorophyl b có nhóm -CHO c ả hai dạng clorophyl chiếm khoâug 4% khốỉ lượng lục lạp (hình 4.2) Về cấu tạo, phân tử clorophyl gồm vòng porphyrin, nguyên tử Mg liên kết tám mộc ruợu phitol dài 20 cacbon liên kết vào bên cạnh Đậc biệt phán tử clorophyl có hệ thống nối đơi liên hợp Đó hệ cộng hưỏng chứa đựng đường khác phân bơ' lại điện tử ngồi mà khơng làin chuyển dịch vị trí Dgiiyên tử tạo thành phản tứ Chính kliâ cộng hilỏng vịng làm cho phân tử clorophyl ơn địuh Hệ cliịug Iiơl đôi liêu hợp chứa điệu tử Jt Unh động, chirỡiig không thiiộc ugiiyêu tử hay mộc liên kết uào mà thuộc hệ lièn kết nói chung Để chuyền điện tử n quỷ dạo thường cần mộr nâng lượng nhỏ Các photon hấp thii bỏi phân tử clorophyl kích thích diện rử vịng porphyrÌM, sau dó điện tíit chuyển sang hệ thịiig liên kêt cacbon Trong sơ' clorophyl tUiíịng có mặt tỷ lệ nhỏ clorophyl a chuyên hóa có tên gọi trung tâm phản ứng thlíđlìg đitợc ký hiệu P680 (trong quaug hệ II) P700 (trong quang hệ I) Hai dạng clorophyl a b chủ yêu hấp thụ miền ánh sáng xanh-tíin ánh sáng Clorophyl b có phổ hấp thụ chuyển dịch phía bưỏc sóng ánh sáng lục Clorophyl b đóng vai sắc tô”phụ quang hệ cùa nỏ hấp thụ phocon inà clorophyl a khơng thể hảp thụ (litợc mà làm tủng ctáng kể tỷ lượng photon ánh sáng Mặt trơi mà cáj’ thu hút Miền ánh sảng 500nm GOOnm thitịng khơng duợc clorophyi hấp tliụ nên điíợc phàn chiêxi bời Khi photon miền ánh sáng I1Ù3’ hà'p thụ retinal mắt chúng ta, chì mổi cảm nhận (tuợc niàn lục cíia chúng 103 500 550 600 Bước sóng.nm //ìm/i 4,2, (^áii tạo ciia phán lỉr clorophyl a b 104 Carotenoit sắc tố có mặt tlc vật bộc cao phần lớn tâo Carotenoit phổ biến Mhất |l-caroren Phân tử |ỉ-caroteji gồm hai vòng cacbon đuợc nối vdi mạch 18 cacbon với uối đỏi liên hỢp Khi IIƠI đơi liên kồ*t hai nửa phân tử Pcaroten bị đứt sẻ tạo điíỢc hai phản tử vitamin A Chính sẮc tơ' thị giác c h ủ chốt cúa mắt retinal tạo từ vitamin A CH, Oí, J0 P-Caroten CH3 i Oi, CH, ‘■ ”’^.CH-CH-C-CH-CH-CH-C-CH-CHiOH CH, ViậominA CH, CH3 CH, iiiễiii J Chu Iho P-carolcn VH SHClo Iht RẳMc V 100 I I V Ph^ hont đốno /V 80 ĩ o ủ a q u an g / ^100 ề ao f■5 60 CL ! 40 J / hĩ 20 •1 400 \ “ Clorophyl b Ị Í \ J \ \— Carotiinoỉt Ị _ ^ "40 íf ig 20 | f » 1 u \ 1Clorophyi \\ tv " ã 500 600 Bước s6ng,nm / 1 700 iĩềnh 4.4 So sắnh phổ hoạt dộns cửa qiiHRS hợp với phổ hấp Ihụ CÚH phan tử sác lị 105 Các sẮc tơ' carotenoit thiíịng hấp thụ photon cúa miền ánh sáng rộng (từ 500-600nm) thường truyền lượng thu cho clorophyl a Trừ clorophyl tnm g tâm phân ứng ra, toàn sắc tố quang hợp khác đểu "sắc tố anten" Sự có mật cùa sắc tơ* caroteDoid tạo khả náng để xanh sử dụne nhỉêit photon ánh sáng khác làm tăng hiệu quang hợp 4.1.4 C ic pha quang họp Uim k Sơ dò ba Irinh cũn (|U1IIIR hợp Quang hợp mộc chuỗi kiện phức tạp Kồm ba loại q trinh hóa học sau: - Q trình xáy trình tổng hợp ATP chế hóa thẩm thấu (chemiosmotic) nhị điện tử thu qua sử dụng ánh sáng Mặt trdi Các phản ứng tham gia q trình có tên gọi phản ứng sáng cúa quang hựp, bòi 10 tổng hợp ATP chi xây có mặt ánh sáng - Tiốp theo phản ứng sáng chuỗi phân ứng có enzim xúc tác sứ dụng ATP vừa tạo để tân tạo nên hợp chất hữu cđ từ khí cacbonic khí Các phàn ứng có tên "phản ứng không phụ thuộc ánh sáng" hày "phản ứng tôV' qitang hỢp bôi chúng xày dễ dàng vắng mặt cững nhi( c6 mặt ánh sáng miễn ATP sẵn có để dừng 106 - Ci cùng, sắc tô' đă hấp thụ ánh sáng lúc ban đầu ỉàm "trẻ lại" đê sẵn sàng khởi đầu phản ứng ánh sáng khác cách hấp thụ photon 4.Ỉ.4.I Phàn ứng sáng: hâ'p thụ nảng lượng Các phàn ứng sáng xây màng qiiang hợp Trong vỉ khuẩn quang hợp, màng quang hợp màng tế bào, ỏ thực vật tảo, tồn q trình qiiang hợp xảy lục lạp Lục lạp có nguồQ gốc tiến hóa từ vi khuẩn quang hợp màng qiiang hợp tồn bên lục lạp Phản ứng sáng xây theo ba giai đoạn sau: - Một photon ánh sáug hấp thụ bỏi sắc tế Kết kiện qiiang sơ cấp kích thích điện tứ ỏ sắc tố - Điện tử bị kích thích đitợc dẫn truyền dọc theo ỉoạt phân tử chất mang điện tử gán màng quang hợp tớỉ kinh bơm proton vát qua màng thi kích thích kênh chuyển proton qua màng Còn điện tứ thi chuyển đến chất tiếp nhận - Sự qua màng proton s i kfch thieh tổng hợp hóa thấm ATP 4.I.4.2 Phàn ứng tố'i vá cố dịnh COg Đó phân ứng hóa học có sử dụng ẠTP phản ứng sáng t « tiến hành cách dề dàng ỏ bóng tơ l Tuy nhỉễi) xáy dựng thể, tế bào khơng cầu ATP mà cịn cần phiicmg thức để chế tác phán tử hữu từ khí cacbonic Sô vdi CO2 thl ph&n tử hữu C0 coỉ ỉà d 49ng khữ vi chúng c6 chứa nhiểu liên kết C-H Vì vậy, để kiến tạo nên phâii tử hữu thi cắn phài có ngitồn cung cấp hj’dro điện tử để liên kết chứng vào cacbon Quang hợp sứ dụng nftng lượng ánh sáng để chiết rứt ỉực khử (các ngityên tứ hydro dạng NADPH2) từ nước đường mà giải thích sau Trong phản ứxig tối, CO2 khí kết hợp thành phân tử chứa cacbon, nên trình gọi cố định cacbon 4.I.4.3 Bổ sung diện tử cho sắc tơ' Sự kiện hóa học thứ ba xây trinh quang hợp tiến hành có liên quan đến điện tử vốn tước đoạt đitợc từ clorophyl bắt 107 Các tế bào chủầ đơn vị chép Các tố bào chứa ADN lạ ị Cấy truyền Tinh chế AON Cắt giới hạn Tinh repllcon Cát gỉối hạn n p M i^ a V e c to Đfch Tạo kiểu phần tử Chắp nối ADN ligaza Các đoạn ADN khác đuợc đánh số 1,2.3 v.v CácphantửAONtáltỉhợp ị BMbnạpADN v.v Mỉi tế bào chl chửa dạng AON tái tổ hợp Nuối cấy thạch 1.Cấytruyổn Mỗi quẩn lọc quẩn thể tế bào xác dinh diúa phân tửADN ridiig đS điọc tái lổ hợp TinhsẹchADNtáitổhợp 01 02 03 Các dòng AON ríẻng biệt Hiuh 10.4 Sơ đổ lách dịng ADN lế bào vi khuân 221 10.9 CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN Việc cải biến máy di truyền thể sinh vật c6 thể thực cải biên tế bào mầm (tế bào sinh sàn), kỹ thuật thao tác gen định, điều kiện bên thể (thao tác gen ÌD vitro) Q trình gọi kỷ thuật chuyển gen Đến nay, kỷ thuật đầ hồn thiện nhiều phịng thí nghiệm sinh học tiên tiến sản phẩm thương mại thị trưòng quốc tế đẫ mang lại hiộu kinh tế rấ t cao Các phương pháp chuyển gen thực hiẬn khơag gidi hạn lồi thực vật mà cịn tiến hành lồi động vật vi sinh vật ngày trỏ thành công nghệ, gọi công nghệ chuyển gen (trangenic technoỉogy) 10.9.1 Cơng nghệ chuyến g«n thực vật Những thông báo chuyển gen b đẩu xuất h^n từ nám tám mươi ký XX mỏ công nghệ mổi sản xuất chuyển gen tạo sàn phẩm dược phẩm, thực phẩm có phẩm chất cao, enzim protein có hoạt tính sinh học, kháng thể đđn dòng vacxin tái tổ hợp cho y học, chống chịu bệnh chống d Dhỉễm môi trưởng v.v Chuyển gen cho cáy tức ỉà đưa số gen lạ từ nguồn bất kỷ vào cho chúng làm cho chú&c đuộc biểu chuyển gen Đó hiỘQ tượng biến nạp, tạo cho căy có nhữnc đặc tính mđi vể trao đối chất cố sv phát triển, sinh lý đáp ứng mđi đối vổi tín lùệu cÀa iBối trưdng nhu từih chịu hạn chịu lạnh chịu muối Thêm vào đó, c&y điiợc chiiyểD gen lạ có khả náng Cạo sản phẩm mđi nói tdi d ăn Cơng ntl^^cỉiuyển gẹn ỏ th i^ vật trưdc tiên chực h ^ n "bắt chưđc" c« chế chuyln geiT tự nhiên nhơ Ỉ0 Ì vi k h ii^ Agrobacteriưm tutHeftưien», mộrvẽcM gẩỹ^Bặnru^BOlỉirxổ rềlcĩõw gảll tumour) đả truyền đoại gen ngán ADN pasmỉd vào genom thực vật (Chiỉton et aỉ 1977) Phác minh quan trọng Dày chỗ chủng gây độc A.twnefaeieru chứa plasmit ỉdn bên thể nhiễm sắc đ ^ gợi Ti pUsmit (nghĩa pỉaemit gây khôi u) “che giấir số geD g&y ung th« cho cáy Cơ BỞ ph&n tử hình thành khối u truyền càỉ dặt ỔDđịnh đoạn gen T - ADN cúa Ti - plasmit vào genom thực vẠt T - ADN mang ba geo mă hóa cho enzim tổng hợp hormon ò thực vật Sự tổni hợp hormon thực vật gáy tăng trưỏng u bưdu Đáy ỉà rí dụ điển hình kiểu chuyển gen tinh vi tự nhiên từ vectơ vi khuẩn đêu thực vật bậc cao Tuy nhiên tất lồi thực vật dược biến nạp gen (hay chuyển gen) nhờ vi kiuẩi] 222 Agrobacterium Đa số thực vật mầm (monocotyỉedons) khơng tiíơng thích vịi Agrobacterium nghĩa việc chuyển gen vào lồi nhị vi khuẩn thành công Mặc dù nhà khoa học cố gắng thủ nghiệm phUởng pháp chuyển gen khác sử dụng vectơ vmit, kỹ thuật dùng súng bắn gen vào nhán tê bào, biến nạp nguyên sinh chất nhờ xử lý polyetylen glycol, sứ dụng kỹ thuật xung điện để dung hợp nguyên sinh chất vào nhăn tè bào 10.9.1.1 Câu trú c Ti>plastnit vùng chức T -ADN Ti-plasmit đoạn phán tử ADN mạch vịng, sợi kép có trọng lượng phán tứ 3-5% so vdi trọng lượng phân tử thể nhiễm sắc vi khuẩn Với kích thước khoảng 200kb, tê bào chúng tồn đđn vị ché|) (lộc lập Mặc dù điíỢc tách chủng Agrobacterium khác nhau, song t:it câ Ti-plasmit qiia phán tích di tniyển cho thấy, chúng chứa đựng ba vùng quan trọng, hai ba vùng ỉà vùng gây độc v ữ (virulence) có liên quan trực tiếp đến hình thành khơi u Vùng cịn ỉại vùng dị hóa opin (opine catabolism region) Hồn tồn khác với tế bào thực vật bình thuờng, tê bào ung thií thực vật Agrobacterium gáy nên, phát triển vơ tổ chức điểu kiện thiếu hormon sinh trưỏng (auxỉn xytokinin) sỏ dĩ nhif Agrobacterium chuyển đoạn T-ADN sang genoni tế bào thực vật T-ADN điều khiển trình sinh tổng hợp iiorinon sinh ưưởng Nghiên cứu crinh tự gen vùng T-ADN Ti-plasmit khác ngiíời ta thấy T-ADN giới hạn bỏi đoạn trình t\Ị ỉặp lại gần nhu hoàn toàn khoảng 25 bp đitợc gọi trinh tự đầu biên (T-ADN border sequence) Chúng dấu hiệu nhận biết cho trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật ỏ đoạn đầu biên bên phải có chứa yến tỏc cis, cầH thiết cho trinh chuyển T-ADN vào tế bào chủ Đoạn đầu biên bên trái ghì vai trị đề q trình chuyển T-ADN kết thúc bình tliKịng Các nghiên cứti cho thây khơi u khơng hình thành bị suy giâm nếii bị cắt đoạn đầii bién bên phải Trong đoạn ranh giới bên trái ảnh hường đến hình thành khối u T-ADN mang r í t nhiều gen biéu q trìnli chuyển hóa cúa tê bào thực vật Các ph&n trình tự gen T-ADN cho thấy T-ADN cĩHig mang dấu hiệu khỏi đần phiên mã (hộp TATA) kết thúc phiên mã (hộp AATAAA) Gen tồn T-ADN đitợc chia làm hai hệ chính: - Hệ thứ gen gây ung thu onc, gen nà3' mã hóa cho sinh tổng hợp auxin xytokinín, làm cho tế bào phản chia liên tục biến đổi hình dạug tạo nồ't sần trẽn cáy - Hệ gen thứ hai inâ hóa C ỈIO enzim cần thiết qviá trình tổng 223 hợp opine Vi khuẩn sử dụng opin làm nguổn luợng cung cấp cacbon n itơ Mô "ung thư" sinh tổng liỢp opin axit aniin dẫn xuất ciìa đường Dạng opin đitợc tơug hợp khỏi u ià nopalin, octopin, agropin, manopiu agroinopiu phụ thuộc vào chúng Agrobacterium sinh khối u ban đầu Đảy sờ để phân loại chủng Agrobacterium Saii câu trúc cúa octopin nopalin; NH NH,-C-NH(CH,),-(pH-COOH NH n h ,- c - n h (CH,);,-(|:h - c o o h NH NH (j:H-COOH (j:h - c o o h Õctopin CH, N o p a lin COOH Vùng gen độc tơ’ (vừ) phụ trách qiiá trình gây câm ứng tạo đoạn T-ADN vận chuyển T-ADN tới nhản tê bào vật Có tới 24 gen vir nằm vùng cúa Ti-plasmit dạng octopin Các geii đuợc bơ trí operon ký hiệu vir A đếii virH, tạo thành cấu trúc regulon Sự biểu gen vir đitợc điểu khiển hệ thống gồm hai thành phần protein vừA protein vữG Protein vữ A định vị màng tế bào, có khả náng tự phoephoryl hóa gốc histidin 474 gốc phosphat chuyển tới protein virG Sau protein hoạt hóa cho pliièn mã gen vữ khác Tuy nhiên hoạt đệng cấn thiết cho trinh T-ADN hình thành phức hợp T (T-complex) gen vừC, virD virE điều khiển Operon cúa vir D mâ hóa cho sinh tổng hợp bôn protein virDl, vir D2, virD3, virD4, virD2 endonucleaza cỏ chức nảng nhận biết làm đứt gẫy T-ADN vùng đầu biên ci\ng với có mặt virDl Doạn ADN "định vị nhân" gen vữD2 giúp cho định hướng phức hợp T tới nhán tê bào thực vật Hai proteỉn virCl vừC2 mã hóa bồi locut virC, protein virCl giữ vài trò thúc đẩy tạo thành T-ADN nhò stí liên két với trình tụ đoạn gia tốc (overdrive) operon virE mã hóa cho sinh lổng hợp protein virEl virE2, vữE2 liên kết với T-ADN ỏ đoạn khơng đặc hiện, có chííc năiig giữ cho T-ADN khơng bị đứt gãy Hơn virE2 giữ cho T-ADN có cáu trúc thẳng không bị gấp quấn đoạn "định vị nhản" virE2 đă giúp cho fự vận chuyển phức hợp T tới nhân tê bào thực vật 224 Có thể nói locut lớn vùng vữ vir B, mã hóa cho 11 protein từ virB l-virB ll Một số protein nằm màng dường chúng tạo lỗ màng cần thiết cho trình vận chuyển phức hợp T vào tế bào thực vật 10.9.1.2 Cơ c h ế chuyển gen Agrobacterium Qiiá trình chuyển nạp đoạn T-ADN từ Agrobacteríum vào tế bào thực vật bao gồm giai đoạn: hưóng hóa Agrobacterium tới tế bào thực vặt bị thương: gắn với tế bào thực vật; cảm ứng gen vir để tạo T-ADN; tạo phức hợp T, vận chuyển phức hợp T vào tế bào thực vật gắn T-ADN vào genom thực vật Qiiá trinh hKớng hóa cho thấy chủng A tumefaciens hướng động bị dẫn dụ phía axit amin ỉoại đuờng đường sacaroza, glucoza, fructoza có tế bào thực vật bị thương Quá trình gắn Agrobacterium với tế bào thực vật xảy nhờ thụ thể bề mặt tế bào thực vật dành riêng phân tử bể mặt Agrobacterium Trong trinh tiếp xúc, Agrobacterium tạo sợi xenỉuloza sợi kết hợp tụ thành bó gán lên bể mặt tế bào thực vật Sau nhận phân tử tín hiệu từ thực vật, trình cảm úng gen vir xảy nhờ hệ thống truyền cảm ứng bao gồm hai yếu tố protein vữA proCein vứG Ngoài phần tử gây tín hiệu từ vết thương chực vật chất phenol vịng đơn, iỉavonoid đưdng đơn cồn có tác nhãn khác pH axit, đói phosphat opin có tín hiệu gây cảm ứng gen vir, Protein vừa định vị màng sinh chất tế bào vi khuẩn, có khả cảm nhận phân tử tíu hiệu tự phoshoryl hóa Sự phosphoryl hóa vira tạo chuyển nhóm phosphat tới vữG vữG dược phosphoryl hóa đóng vai trị chất hoạt hóa tự phiên mâ tấ t cà gen vir hình thức gắn vào đoạn gồm 12 bp gọi "hộp vir" (vừ boxes) Hầu hết "hộp vừ" tìm thấy ỏ tất đoạn khỏi động gen vữ Sự hình thành phức hỢp vận chuyển T-ADN bao gồm trình sau: Sản phẩm gen virD2 endomicỉeaza, nhặn biết trình tự đầu biên bên phải bazơ thứ ba thứ tií tính từ trái sang tách T-ADN thành hai mạch đơn Một đoạn mạch đơn chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5’ trước Đoạn mạch đơn cịn lại Ti-plasmit làm khn để tổng 225 hợp nên mạch ADN bổ trợ Trong trinh di chuyển, sợi đơn ADN phải chui qua rấ t nhiều màng triíớc vào nhân tế bào thực vật Vì vậj' để tránh đứt gãy, T-ADN sợi đơn gán với protein vữE sản phẩm gen virD2 liên kết cộng hóa trị với đầii 5' sợi T-ADN đơn liên kết khơng cộng hóa trị với vữE2 T-ADN, tạo phức hợp T-ADN điíỢc vận chuyển tới tế bào thực vật dạng phức hợp T hoạt tính nucleotit bảo vệ cà Agrobacterium tế bào thực vật Dây chuyền vận chuyển phức hỢp T protein điíỢc mã hóa từ gen vừB Các sàn phẩm virBl, vữB2, vừB3, virB5, vừB7, virB9 vừBlO có cấu trúc cần thiết cho việc liên kết với màng, sản phẩm cúa virB 11 Dằm bên màng có khâ nảng liên kết vói ATP, có hoạt tính ATPaza tự động phosphor>'l hóa, nên có thc cung cấp litợng cho trình vận chuyển T-ADN qua màng tê bào Hoạt tính "khơng cho gấp lại" (imĩoldase) sản phẩm gen vừE giữ cho T-ADN có cấu tnic thảng khơng bị gấp quấn tạo điều kiện dễ dàng cho qiiá trình vận chuyển cúa qua phức hợp lỗ màng Hướng nhân phức hợp T gắn T-ADN vào genom thực vật trinh cho thấy T-ADN đuợc vận chuyển tới nhán té' bào thực vật gắii hóa trị vào genom thực vật Việc định hướiig tới nháii T-ADN nhu gán với genom thực vật xày dễ dàng nhị có "đoạn định vị nhâu" sân phẩm virD2 virE2 phức hợp T Sau đuợc gắn vào genont thực vật T-ADN phiên mã nhờ ARN polyineraza II Kích thước lớn cúa Tỉ-plasmit gáy khơiig khó khản chuyển nạp gen thông qua Agrobactei-iuin Mặt khác enzim giới hạn cỏ thể cốt ADN Ti-plasmit nhiều chỗ khác nhau, cơng nghệ chuyển gen lại cần có Vị trí cắt cho hoạt động số eiizim giới hạn Ngoài mặc dừ gen onc dừng iàni thị chọn lọc có tính trội, nhimg chúng lại cân trỏ trình.tái sinh bình thitờng thực vật Với lý đậy nhà khoa học dã câi tiếu Ti- plasiuit bàng cách cất bỏ hầu hết geu khơug cần thiết nhu gen IC gen tổng hợp opiu, láp thêm sô’ chành phần 1) replicon để ADN piasmit tự nhân E.coli Agrobactcrium: 2) gen chọn lọc, gen đánh clâii 3) vùng gán có đa điểm enzim giới hạn để cài đặt gen mong muôu Yêu cầvi qiiaiầ trọng phải thu nhỏ kích thước pỉasmit nhi(ng có vị trí đặc hiệu cho enzim giới hạn Trước công việc chuyển gen thông qiia Agrobacteriụm thành còng chủ yêu ò thực vật hai inầni Thông qua Agrobactcrium ugưởi ta dà tạo nhiều cáy trồng chuyển gen có giá trị thuộc lớp nhu thuôc (lậu tương, cáy họ đậu nhiệt dới bâp câi, khoai táy 226 Mặc dù mầm vật cúa Agrobacterium, sơ' nghiên cứu dã chứng minh Agrobacterium chuyển gen vào sơ' lồi mầm Năm 1985, De Cleene nghiên cứu 258 loài mầm thông báo theo thứ tự từ Loa kẻn (Liliales) đến Ráy (Arales) có mẫn cảm với Agrobacterium Schafer cộng đă thực biến nạp Dioacorca bulbiỷĩorra với Agrobacterium đưa chứng khâ nàng gắn T- ADN genom thực vật kỹ thuật lai Southern Tiếp sa\i đó, loại trồng mầm có ý nghĩa kinh tế cao lúa (Oryza sativa L.), ngơ {Zea maỵti) đà chuyểíi gen thƠDg qua Agrobactcrium Cơng trình Raineri cộng thông báo bỉén nạp cáy lứa Agrobacterium Họ dùng chủng Agrobacterium hoang dại để tạo mô sẹo u chủng mang gen khâm npt II để tạo mô sẹo kháng kanamycin giốhg lúa ơaponica Chan cộng chông báo việc chu3’ển T-ADN biến nạp lúa Indỉca Agrobacterium Li cộng (1992) đă xác định sô' yếu tố ảnh hưỏng lên trình biến nạp gen nhờ Agrobacterium phân tích biểu gen Gus ố mơ lúa Tất câ 21 giông lúa Indica biểii hiẹn gen Gus ị tần suất cao Tuy nhiên có iiía Indica biến nạp tái sinh phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium Hiệu quà biến nạp gen thông qua Agrobacterium ố thực vật phụ thuộc vào số yếu tố kiêu mô nuôi nhiềm nồng độ vi khuẩn thời gian niiỏi nhiễm, tiền xử lý mơ thực vật Khi phân tích biểu cúa gen Gus mô lúa, Hiei cộng (1994), đă phát mô sẹo từ scutellum vật liệu phù hợp để chuyển gen thóng Kỵnai Agrobacterium 80 vài loại mô khác (inô đỉnh sinh trưỏng, đầii rể) Thđị gian nuôi nhỉểm cũug ảỉlh hitỏng tâi tẩn euất biến nạp, ỏ lứa khống thịi gian nuôi nhiễm từ 2-3 ngày lý tưởng An công thây ràng nồng độ vi khuẩn cao (10'"/ml) tăng hiệu biến nạp gen nồng độ thấp (10*^/1111) thấy thuốc Arabidopitùt Tuy nhĩêo, nồng độ vi khiiân không ânh hiràng đến hiệu biến nạp gen Petunia Các nghiên cứu cho biết tăng mức độ biểu cúa gen vữ cãi thiện hiệu quà biến nạp gen Agrobacterium Tăng khả biểu gen vir đạt cách gãy tiền cảm tlỉng vi khuẩn với chất axetBsyringon (AS) AS + opin Tiền xử lý mơ mơi trưịng chứa AS làm tăng tần xiiất biến nạp gen ỏ thuốc Bổ sung AS vào mơi trưịng ni nhiễm môi trường nuôi cộng sinh ảnh hưỏng tới hiệu 227 chuyển gen Agrob(utcriĩ4m.ìigồi nhân tơ' pH, nồng độ phosphst mdi trường nhiệt độ ni cày ảnh hirỏng trực tiếp tói chuyển nạp T-ADN vào tế bào thực vật thông qua câm ứng gen phụ thuộc vào chủng Agrobacterium Khà câni ứng gen vừ táng nồng độ phosphat mơi tnràng thâ'p Nhiệt độ thích hợp cho sàm ứng gen vữ từ 25 - 28"c,ồ nhiệt độ thấp dẫn đến làm má'! Ti-plasmit chủng Agrobacterium, nhiệt độ cao làm giàm chức gen vừ 10.9^ Cơng nghệ chuyển g«n động vật Muốn thực công nghệ chuyển gen cho động vặt, vấn đề quan trọng trước tiên ià phải hoàn thiện cơng nghệ ni cấy tê bào động vật Việc hồn thiện cơng nghệ ni cấy tế bào động vật có ý nghĩa khoa học thực tién cao, bỏi tế bào động vật điíỢc câi biến di tniyền sản xuất khối lượng lớn sản phẩm chất điều hòa miễn dịch, kháng thể, vacxỉn tái tổ hợp, enzim chữa bệnh (như chất hoạt hóa pỉasminogen chữa bệnh tắc nghẽn mạch), chất chống ung thit kháng nguyên chuẩn đoán ung thư, v.v Bân thản tế bào nuôi cấy có giá trị thưtmg mại rấ t cao Chẳng hạn ngu}'ên bào sợi (íibroblast) dùng để cấy ghép cho bệnh nhân bị bỏng, tê bào tủy xương số dạng tế bào khác nuôi cấy dể sử dụng điều trị ung thit, cấy ghép cđ quan chda nhỉềii bộnh hiểm nghẻo khác to^.2.1 Gơng nghệ tạo dịng cho tế bào dộng vật Một giải pháp quan trọng để giải hiệu suất thấp sân xuất sân phẩm procein hoẠc chất hoạt tính sinh học từ tế bào động vẠt sử' dụng công nghệ tái tồ hợp ADN (đã diiợc trình bày ỏ phẩn trước) TiMng tự tê' bào thực vật, người ta đưa số luợng 0en ỉạ (ADN ngoại iai) nhò vectơ vào loại tế bào động vật Nhiều nghiên cứw biến nạp (chuyển gen) cho thấy, người ta sử dụng vectđ vừut s v 40, Adrenovinis, vaccinia vuriis, BP vừus (papiUoma virus bị), BacTilovmis Retrovinis Đơi vđi vứiis vaccinia, gen ngoại lai cài đặt bên cạnh trình tự promoter, nằm xen promoter gen timidiii kinaza virus vaccinia đă đưa từ tritớc vào pỉasmit vi khuẩn E.coli Khi đó, plasmit tái tổ hợp lớn kích thưóc viriis vaccinia hoang dại đuợc nhiễm vào dòng tế bào khỉ Kết q\iả dạng virion tái tổ hợp hình thành 228 từ té bào khỉ có đặc tính khả nâng tổng hợp timidin kmaza chọn có tính chỗng chịu lại 5-bromodeoxyuridin Hiện nay, tất câ protein có giá trị lớn cơng nghiệp dược phẩm đểu sản xuất cách imơi cấy dịng tê bào tái tổ hỢp Hàng 10.4 !\1ộl số prulcin có hoỊỊil lính sinh học din;N; sả n x u t nhờ chuyên gcn inviiro vào lé bào d ọ n s vật P r o te in C h ả t h o t h ó a p la s m in o g e n c ủ a K íc h th c 52 axit a m in m ô (tpA) ứng dụng Chữ a bệnh tắ c nghôn m ạch c ủ a n g i (th ro m b o s is ) In telơkln 133 axit a m in C h ữ a u n g th Y ế u tố h o a t tử u ( T N F ) 157 axit a m ín C h ữ a u n g th Y ế u tố VIII 3 axit a m in Chữa bệnh ưa ch ả y m áu Y ế u tố IX axit a m in Chữa bồnh c h r im a s m ột b ệ n h iía c h ả y m ổ u c tỉn h E ry th ro p o ỉe tin 166 axit a m ln C h ữ a b ệ n h th iế u m u In te rte ro n p 164 axit am ín C h ữ a u n g th ỈO.9.2.2 Công nghệ sản x u ấ t dộng v ật chuyển gen Việc sản xuất đỘQg vật chuyển gen thực nhò phKđng pháp đưa gen lạ (ADN ngoại ỉai) vào tế bào dộng vật bằBK vectd v ữ u t (như trình bày), dimg hợp bọng màng chứa ADN lạ với tế bào đỉch, xuDg điện tạo lỗ (đưa ADN lạ nhò dòng điện) vào tế bào đích, phitơng pháp vi tiêm ADN vào tê' bào trứng dã thụ tiìih Sau đâ thực hiộn phương ])háp vi tiêm, ngitđi ta đUa trứng vào cớ thể động vật với tư cách COII mẹ mang thaL Trong chực nghiệm, ngưòi ta sân xiiất nhỉểu ỉoại động vật cluiột nhắt chuyển gen bàng cách tiêm khoảng 2picoỉit (2 X 10'“ lit) đệm có chứa ADN plasmit đă tách dịng cho tiển nhân tế bào trứug Người ta thường chọn tiền nháu cùa tinh trùng Idn h(Ai tiề& nhán tế bào trứng Saii đó, tiền nhân dung hợp để tạo uháỉỉ litdng bội (thể nhán dịploit) trứng đă thụ tinh Tiếp theo tilíQig thụ tinh đitợc ni cấy invitro cho sơ' giai đoạn phân chia tố bào p h ^ điiợc đưa vào thể mẹ mang thai Khoảng đến 4% động vật phát rriển cìr phơi có chứa bàn ADN ngoại ỉaỉ kết hỢp với thể nhiễm săc cúa tê bào trứug đitợc chuyển gen lạ 229 Tất thí nghiệm chuyên gen trước đáy đểxi sử dụng promoter gen metaỉotioneịn chuột (MMT) Gen MMT mã hóa cho polypeptit giàu xystẹin tham gia vào trình nội cân kim loại nặng Bằng cách gán promoter MMT với gen timidìn kinaza (TK) vữ ut herpes, sau điía vào chuột chuyển gen, tạo cho chúng cảm ứng với ion cadmi Thực nghiệm chứng minh đưa gen lạ từ v ữ u t kết hợp vào genom chuột Điểu quan trọng gen TK điíỢc di truyền cho cháu kết hợp vào thể nhiễm sắc Tuy nhiên mức độ biểu gen chuyển vào cháu phụ thuộc đáng kể vào cha mẹ chúng Các động vật chuyển gen sản xuất vitợt trội protein có hoạt tính sinh học Chẳng hạn chuột chuyển gen sản xuất vuợt trội, nghĩa sản xuất rấ t nhiều protein có hoạt tính đuợc tiết với sữa động vật chuyển gen Ví dụ, chất hoạt hóa plasminogen urokinaza cùa ngưdỉ ỉà yếu tô' quan trọng cd chế điều hịa đơng cầm máii tổng hợp ỏ nồng độ cao (2mg/ml) với sữa cừu chuyển gen Trong khỉ đó, khơng có cừu chuyển gen biểu đặc tính sinh lý bất thường Những Chực nghiệm cho phép cung cấp mô hình sản xuất động vật chuyển gen có khả tổng hợp ỏ mức độ cao số loại protein tái tổ hợp có hoạt tinh sinh học Mơ hình động vật chuyển gen có bệnh tương tự nsưdi tạo từ chuột chuyển gen Các ví dụ trình bày ỏ bàng O.5 BềÌMjf Ị0.5 Các loại chuột mác bệnh lươBR tv nbtf BRUỜi I90 Irong chuyển Rc-n Bi6 n đổi di truyền Phương pháp thay đổi gen Các bệnh tưong đưdng người Đưa gen đột biến colagen vào chuốt hoang dại Vi tidm minigen cảm úng vào nhơn B«nh hình thành xữơng khống đẩy đủ Gãy đột biến locus cũa bénh loạn dinh dơOng cỡ liÀi kểt X Gây đột biền giống đực sau xác định mang bénh Mác bdnh toạn dinh dưong co €>(M g*n ung thư ras C.myc có hoạt tính ngudi Vi tíốm minigen cảm ứng vào nhân Cảm úhg gãy ung thư ác tính €H«I mơt at«n đột biến z a - antitrypsin người Vi tiôm mành ADN mang alen đột biốn Gãy bệnh viAm gan sơ sinh Đưa gen renin chuột nh&t VI tiém vào trứng chuòt cống Gảy bệnh tăng huyết àp 230 Các mơ hình bệnh động vặt chuyển gen khờng cho phép tim hiểu chê hóa sinh di truyểii bệnh Iigitời mà cịn giúp chiíug ta lựa chọn phudng thiiỏc chữa bệnh có hiệu qiiã Hiện nhà khoa học thử nghiệm điía gen sinh triíờng vào sô’ động vặt để tạo động vặc khổng lồ, cho suất thu hoạch cao Một kliía cạnli việc nghiên cứu chuyển gen hậu qiiả tác động đối vói cán sinh thái môi trường phạm trù đạo đức xã hội học cíing để cập tỏi tương lai TÓ M T Ắ T Nguyên tắc công nghệ tái tổ hợp ADN lựa chọn đoạn phân tử ADN (một trình tự gen) mă hóa cho protein có ích, sau cài đặt đoạn gen vào vectơ tách dịng (cloning vector) Có khả chốp hay tái tê' bào vật chủ lựa chọn thích hợp Từ tê' bào vật chử sã tổng hợp sản phẩm gen có ich Trong cơng nghè tái tổ hợp ADN nguởí ta thưởng dùng enãm endonudeaza cắt giới hạn (restriction enzyme - RE) phân tử ADN môt cách chọn lọc ba loại endonucleaza cắt giói hạn, loại endonucleaza có tinh cắt đăc hiệu trình tự nudeotit nhẩt định cho sản phẩm mảnh cắt giới hạn nucleotit Các RẼ úhg dụng cống nghệ tái tổ hợpADN, (rong nghiốn cớu đa dạng AON sinh vật (phuong pháp RFLP) nhiều ứng dựng khoa học khác Cùng với enzim tổng họp ligaza tạo nẻn gắn két đoạn polynucleotit (các mảnh ADN), RẼ góp phần tạo nén nhiếu ADN tái tổ hợp độc biệt vectơ tái tổ hợp hữu ích cơng nghệ tải tổ hợp ADN Công nghệ tải tổ hợp ADN ln ln liên quan đến việc tách dịng ADN (ADN cloning) Có hai phưdng pháp tách dịng ADN tách dòng ADN tiên sỏ té bào tách dịng ADN khơng cần lế bào, • Tảch dịng ADN sỏ tẽ bào gôm bước: ) thiết kế ADN tái tổ hợp tạo đơn vị chép độc lập (replication) với nhiẻm sắc tế bào vật chủ; ) nhân dịng tơ bào có chọn lọc; 3) tách dịng AON tải tổ hợp từ khuẩn lạc tế bào nuôi cấy chọn lọc chọn lọc ADN tái tổ hợp 231 Sự táoh dệng AON khồng cẩn tê bào đưọc thực phản ứng chuỗi trùng hợp (polymeras« Chain Reaction; PCR) Nguyên tắc kỹ thuật trinh tự AON Sd khai cho biổt thông tin cấu trúc cùa trình tự ADN đich, cho phép thiết kế mẠt trình tự mổi xi (foreword prímer) trinh tự mổi ngược (reverse prímoi^ Khi thém cảc đoạn mổi vào ADN genom mỏ xoắn (bị biến tinh) doạn mổi s6 li«n kết bổ sung dọc theo đoạn trình tự ADN đích Khi có mặt enzym AON — polymerase chịu nhiệt (thuởng tà tag - polymerase), tiền chất thơm dNTP (d-nucle(Mit trí phosphat) đoạn ADN đích mong muốn sẻ tổng hợp Quá trình đUdc lập lại theo nhiều chu kỳ sợi ADN mdl tổng hợp s6 iàm khuôn mẫu cho tổng hợp đoạn tiếp (heo ADN Sau khoảng 30 chu kỳ, •ỏn phẩm PCR đạt khoảng 10‘ trình tự ADN sồ diMc ttìấy rơ điộn dí dạng băng ADN đậm nét có chiáu dài trình tự nucieotit mong muốn Nhở phuong pháp tách dịng ADN người ta tạo lập ngản hàng gen ưiiKt lộp thư viốn ADN cho tập hạp cá thể quẩn thề, thiổt lập ngân hèng ADN genom ngân hàng ADN bổ sung Trong quế trinh tách dòng AON, người ta luốn luỏn phải dùng vectơ tách dòng tự nhidn, chủ yéu ià thỉA kế vecto tách dòng tái tổ hợp nhân tạo Cuối két cửa q trình tách dịng tạo cd hội biểu diẻn cho sản phẩm gen duới dạng protein có hoạt tính sinh học có ich phục vụ cho mục đich sinh học, y dudc nống nghiệp Một số phiMng pháp sinh học phân tử đâ sử dụng nghiồn cúu đa dạng cửa AON genom nhúhg cá thể loài khác loài, đáng ỷ kỹ thuật phãn tích da dạng chiéu dài đoạn cắt giói hạn (RFư*) ngơởi ta sử dụng cảc enxim cắt ADN giới hạn đặc híéu (restriction enãm) Trèn C0 sỏ đó, việc phân tích A(^ g«nom dẫn đến phát hiồn thay đổi di truyỂn liòn quan dấn bệnh Đối với bệnh nhiểin tiùng vi khuẩn vimt, nhữhg ADN tác nhân gây bộnh phát nhở kỹ ttiuật RFLP kết hạp với PCR cQng cho phép chẩn đoán bệnh tlm “thù phạm’ mức độ ADN Phương pháp chuyổn thổm ADN cịn gọi Souem Blottỉng bao gổm giai đoạn tảch chiất ADN đốl tưạng nghièn cứu, hòa cắt ADN enztm gidi hạn đậc hiệu, điện di phân tich đoạn cắt ADN, truyền thắm đoạn cắt ADN từ 90 l agaioxa (hoặc gel polyaoylamit) sang màng cúhg njưoxenluloza (hoặc nikm), giai đoạn lai ghép với ADN dò (DMA probe) đảnh dấu phóng xạ huỳnh quang đế phát hiộn biến đổi gen Cồng nghệ chuyến gen thực vật động vật ttiành tựu to lón cửa cơng nghé sinh học phân tử ỏ cuối kỷ XX Cống nghệ chuyển gen ỏ thực vật truớc tifeì đuọc thục “bắt chưàc' chế chuyển gen tự nhiôn nhờ vi khuẩn 232 Agrobacterium tumeíaciens, vectơ gây b è n h u cổ rẻ truyền đoạn gen plasmit vào ADN genom thụt vật Phát minh tạo sỏ cho nghiôn cúu úhg dụng Ti-plasmit nhiéu loại vectơ chuyển gen tái tổ khác, ứhg dụng cho công nghệ chuyền gen ỏ thực vật, vi sinh vật động vật sỏn xuất ví sinh vật, thực vật động vật chuyển gen có ích cho việc tạo sản phẩm công nghệ chuyển gen chất có hoạt tính sinh học, hoạt tính dược học, loại thực vật động vật chống chịu bệnh 233 T Ả I U Ệ U THAM KHẲO Alberts B„ Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D 1990 Molecular Biology of the Cell Chrispeels M.J., Sonnewald u 1997 Plaiit transformation and its application to agricultural Biotechnology, in: Prontier in Biolog}' Genetic language, Araaldi F and Attardi G, Eds Vol Christophers K.M., Van Holde K.E 1990 Biochemistry The Benjaniin / Ciimming Publishing Company Inc Compeland R.A 2000 Enzymes Second Edition A John Wiley & Sons Inc Publication Hames B.D., Hooper N.M., Houghton J.D 1997 In stan t Notes in Biochemistry Bioscientific Publishers Horton H., Moran L Ochs R., Rawn J., Scrimgeour K 1993 Principles of Biochemistr>’ by Neil Patterson Publishers Primrose S.B 1991 Molecular Biotechnology Blackwell Sci Publication Raven B.H., Johnson G.B 1995 Updated Version Biolog>' Third Edition WWCB Publishers Sambrook J., Pritsch E.F., Maniatis T 1989 Moleciilar Cỉoning, A laboratory Manuaỉ Second Edition Cold spring Harbor Laborator>’ Press 10 Strachan T., Read A.p 1998 Hiiman moleciilar Genetics Bios Scientic Publishers 11 Watsoii J.d., Hopkins N.H., Roberts J.w „ Steitz J.A., Weiner A.M 1990 Molecular Biolog>’ of the Gene Fourth Edition bj’ BCP Company 12 Youvan D.C., Marrs B.L 1987 Molecular Mechanism of Photosyiithesis ScientiTic American Books 234 LÊ NGỌC TÚ - ĐỖ NGỌC LIÉN ĐẶNGTHỊ THU (dồng c hủ biên) TÊ BÀO & C Á C QUÁ TRÌNH SINH HỌC Chịu trảvtì nhiệm xuất bản: PGS TS TƠ ĐĂNG HÀI NGUYỄN KIM ANH Biên tập: Vẽ bia: HƯƠNG LAN NHẢ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỶ THUẬT 70 Ti ần Hung Đạo - Hà Nội KHKT-2002 ... ADN đảm bào cho tê bào chứa hai hệ gen giông hệt Thành tế bào điíỢc hình thành bao lấy màng nguyên sinh châ't tê bào inột té bào nguyên thủy hình thành nên hai tế bào 5.3 S ự PHÂN CHIA TÊ BÀO NHÂN... CHIA TẾ BÀO NGUYỀN NHIỄM (NGUYÊN PHÂN HAY MITOSE) Tất sinh vật từ vi khuẩn sinh vật đa bào có đặc tính sinh trưỏng sinh sân Sự sinh trưởng tăng trưởng thể tế bào ố vi khuẩn không thấy rõ băng mắt... đôi tế bào Sự phân đôi tế bào phân chia tể bào Chành hai nửa hoậc gần nhau, nguyên liệ» đitợc thêm vào hai vị trí đửih ADN màng nguyên sinh chất th lại lộn vào bên hình thành hai nửa tế bào Q