CÔNG NGHỆ SINH học

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC BỘ MÔN VI SINH – KÝ SINH - - BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NGHỆ SINH HỌC Danh sách sinh viên: Phạm Hữu Lộc Trịnh Hồ Hoàng Lộc Lê Minh Lợi Lớp DCQ2017 – Sáng thứ Nhóm 08 – Tiểu nhóm 01 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2020 Bài Chọn lọc giống vi sinh vật 1.1 Tóm tắt lý thuyết 1.1.1 Phân lập giống vi sinh vật chủng - Trong trình chọn lọc giống vi sinh vật chủng, bước phân lập chúng từ nơi sinh cư tự nhiên theo kiểu săn lùng (từ nơi thường có vi sinh vật tự do) theo kiểu định hướng (lấy mẫu có chủ đích) - Sau đó, người ta sử dụng mơi trường phân lập nuôi cấy chúng cách kiềm hãm giết vi sinh vật phổ biến kích thích cho vi sinh vật phát triển Nhờ đó, chọn lọc chủng vi khuẩn có đặc tính mong muốn Phương pháp thực tương đối dễ dàng, đặc tính chọn lọc phức tạp gây khó khăn cho q trình sàng lọc 1.1.2 Phát dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn STT Loại đột biến Amylase ngoại bào Protease ngoại bào Kháng sinh Không di động Không tạo nha bào Khuẩn lạc xù xì Kháng thuốc Kháng virus Bản chất thay đổi Dấu hiệu phát đột biến Thủy phân tinh bột môi trường nên tinh bột không tạo Tạo amylase ngoại bào màu tím với lugol Xung quanh khóm khuẩn có vịng sáng Thủy phân gelatine môi trường nên gelatine không bị tủa Tạo protease ngoại bào tráng lên môi trường TCA Xung quanh khóm khuẩn có vịng sáng Có khả ức chế tăng trưởng vi sinh vật khác Tạo kháng sinh cách tạo vùng ức chế xung quanh lỗ cấy Mất tiêm mao tiêm Khuẩn lạc mọc dính vào mao khơng hoạt động Mất thay dổi bề mặt màng nhầy Mất thay đổi lớp bên lipopolysaccharide Thay đổi khả thẩm thấu, ngăn cản xâm nhập vào tế bào loại thuốc, phá hủy thuốc Mất điểm tiếp nhân virus Khuẩn lạc bé, xù xì Khuẩn lạc nhiều hạt nhỏ, khơng Mọc mơi trường có thuốc nồng độ mà bình thường gây ức chế phát triển vi sinh vật Phát triển mơi trường ni cấy có mặt virus nồng độ cao 10 11 Thay đổi protein thiết Nhạy cảm với nhiệt yếu làm tăng nhạy cảm độ bình thường với nhiệt độ Mất enzym có khả Mất sắc tố tham gia tổng hợp sắc tố Lên men đường Mất enzym phân giải loại đường Phát triển có nhiệt độ thấp có thể, khơng phát triển nhiệt độ bình thường Có màu khác màu Không tạo biến đổi màu môi trường đặc trưng với chất thị màu 1.1.3 Kỹ thuật bảo quản giống vi sinh vật a Phương pháp cấy truyền vi sinh vật (thời gian cấy truyền tuần – tháng) - Cấy truyền mơi trường định kì cấy truyền sang mơi trường - Ưu điểm: đơn giản, dễ làm - Nhược điểm: tốn công sức, môi trường thời gian không ổn định b Phương pháp giữ giống môi trường thạch lớp dầu khoáng - Giữ giống – 5oC cho lên bề mặt lớp vaselin, parafin… (giữ chủng nhiều năm) - Ưu điểm: • Đơn giản, hiệu cao • Mơi trường khơng bị nước • Vi sinh vật bảo quản lâu so với cấy truyền vi sinh vật c Giữ giống vi sinh vật môi trường đất, cát hạt - Bảo quản vi sinh vật tạo bào tử - Thời gian bảo quản lâu (từ đến nhiều năm) d Phương pháp đông lạnh: làm lạnh ống môi trường chứa vi sinh vật tới -80oC thêm chất chống đơng thích hợp (glycerin, sữa,…) - Phương pháp đơn giản - Vi sinh vật giữ lâu tháng – 10 năm e Phương pháp đông khô vi sinh vật phương pháp đông khô trực tiếp - Làm khô nước theo phương pháp thăng hoa áp suất thấp - Làm giảm làm ngừng trình phân chia vi sinh vật - Vi sinh vật khơng bị biến đổi đặc tính di truyền - Thời gian lưu giữ lâu tới vài chục năm 1.2 Kết bàn luận 1.2.1 Phát vi sinh vật sinh enzym amylase protease a Hình ảnh đĩa phân lập phát khả sinh enzym Phân lập môi trường tinh bột Cấp pha lỗng: Phân lập mơi trường tinh bột tráng dung dịch Lugol Cấp pha loãng: Phân lập mơi trường gelatin Cấp pha lỗng: Phân lập mơi trường gelatin tráng TCA 50% Cấp pha lỗng: b Kết phân lập phát khả sinh enzym ngoại bào Bảng 1.1 Kết phân lập phát khả sinh enzym ngoại bào Chủng Mơ tả khuẩn lạc Mặt lồi, rìa cưa, màu trắng đục Đường kính 5mm Mọc mơi trường tinh bột Mặt phẳng, rìa trịn, màu trắng Đường kính 6mm Mọc mơi trường tinh bột Amylase Đường kính vịng sáng: 7mm Đường kính vịng sáng: 9mm Protease Mặt lồi, rìa cưa, màu trắng đục Đường kính 6mm Mọc mơi trường gelatin Mặt phẳng, rìa lượn sóng, màu trắng Đường kính 5mm Mọc mơi trường gelatin Đường kính vịng sáng: 12mm Đường kính vịng sáng: 8mm 1.2.2 Phát khả sinh kháng sinh E coli S aureus Bảng 1.2 Kết phát khả sinh kháng sinh Chủng E coli S aureus Bacillus - - Bacillus 14 mm - Bacillus 26 mm - Bacillus - - 1.2.3 Bàn luận a Phát vi sinh vật sinh enzym amylase protease ngoại bào - Chủng vi sinh vật mẫu đất sau phân lập môi trường thạch tinh bột ủ 37oC 24 có khả tiết amylase ngoại bào • Amylase ngoại bào thủy phân tinh bột môi trường, nên xung quanh khóm vi khuẩn tiết amylase có vịng sáng, khơng bắt màu tím với dung dịch Lugol (Iod) - Chủng vi sinh vật mẫu đất sau phân lập môi trường thạch gelatin ủ 37oC 24 có khả tiết protease ngoại bào • Protease ngoại bào thủy phân gelatin mơi trường, nên xung quanh khóm vi khuẩn tiết protease có vịng sáng, khơng bị đục màu với dung dịch TCA 50% • Do lượng gelatin thạch có nồng độ thấp nên đĩa thạch không đục rõ với TCA 50%, phải soi đèn huỳnh quang thấy vòng sáng mờ b Phát khả sinh kháng sinh - Trong thí nghiệm phát vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả ức chế tăng trưởng với vi sinh vật khác • S aureus lỗ gồm B1 – B4 lỗ chứng khơng xuất vịng ức chế xung quanh lỗ • E coli lỗ gồm B1 – B4 lỗ chứng có lỗ B2, B3 xuất vòng ức chế xung quanh lỗ - Kết luận: Trong chủng Bacillus: • Chủng Bacillus 2, sinh kháng sinh có hoạt tính tác động đến E coli • Khơng có chủng sinh kháng sinh có hoạt tính tác động đến S aureus Bài Đánh giá số đặc điểm có lợi vi khuẩn probiotic 2.1 Tóm tắt lý thuyết 2.1.1 Khái niệm probiotic - Probiotic vi sinh vật sống cung cấp với số lượng vừa đủ có lợi cho sức khỏe vật chủ (FAO/WHO 2001) - Các chủng vi sinh vật dùng chủ yếu chế phẩm probiotic Lactobacillus Bifidobacteria, nấm men Bacilli 2.1.2 Vai trò probiotic - Tăng cường hấp thu khoáng chất, vitamin - Hạ cholesterol, huyết áp - Tăng đáp ứng miễn dịch, giảm phản ứng viêm - Phòng ngừa tiêu chảy kháng sinh - Ngăn chặn vi sinh vật có hại bị stress - Có khả chống yếu tố gây ung thư… 2.1.3 Các yêu cầu vi khuẩn probiotic a Yêu cầu chung - Chủng vi sinh vật phải có đặc điểm phù hợp với u cầu cơng nghệ để đưa vào sản xuất - Có khả sống sót khơng bị biến đổi chức đưa vào sản phẩm - Khơng gây mùi khó chịu cho sản phẩm - Có khả sống sót qua đường tiêu hóa sử dụng qua đường đến nơi tác động chúng - Có khả thực chức định hướng b Yêu cầu an tồn - Được định danh xác - Phân lập từ đường tiêu hóa người khỏe mạnh, khơng có khả lây bệnh - Khơng gây khử liên hợp muối mật - Không mang gen đề kháng kháng sinh di truyền c Yêu cầu chức - Có khả dụng nạp với acid dịch vị người - Có khả dung nạp với muối mật - Có khả bám dính, tồn lâu dài, cạnh tranh với vi khuẩn có hại đường tiêu hóa - Có khả sản xuất kháng sinh vi sinh vật có hoạt tính chống lại tác nhân sinh vật gây bệnh khác d u cầu cơng nghệ - Có đặc tính tốt cảm quan - Đề kháng với thực khuẩn - Dễ sản xuất, tăng trưởng đủ mạnh, dễ thu hoạch - Có khả sống sót, ổn định q trình sản xuất bảo quản - Có thể đánh giá chất lượng trộn vào sản phẩm cuối 2.2 Kết bàn luận 2.2.1 Đánh giá đặc điểm có lợi vi khuẩn probiotic a Hình ảnh thử nghiệm khả chịu acid dịch vị nhân tạo - Mẫu chứng TBSD pha loãng cấp Bào tử pha loãng cấp TBSD pha loãng cấp Bào tử pha loãng cấp - pH = TBSD pha loãng cấp sau 60 phút TBSD pha loãng cấp sau 60 phút Bào tử pha loãng cấp sau 60 phút Bào tử pha loãng cấp sau 60 phút TBSD pha loãng cấp sau 90 phút TBSD pha loãng cấp sau 90 phút Bào tử pha loãng cấp sau 90 phút Bào tử pha loãng cấp sau 90 phút - pH = TBSD pha loãng cấp sau 60 phút TBSD pha loãng cấp sau 60 phút Bào tử pha loãng cấp sau 60 phút Bào tử pha loãng cấp sau 60 phút TBSD pha loãng cấp sau 90 phút TBSD pha loãng cấp sau 90 phút Bào tử pha loãng cấp sau 90 phút Bào tử pha loãng cấp sau 90 phút b Kết khả chịu acid dịch vị nhân tạo Bảng 2.1 Kết đánh giá khả chịu dịch vị nhân tạo pH Thời gian (phút) Đối chứng TBSD Bào tử 23.10 147.103 60 90 MT pH TBSD Bào tử MT pH TBSD Bào tử 121.102 3.102 15.102 1.102 123.103 121.103 102.103 93.103 Bảng 2.2 Kết phần trăm tế bào sóng sót pH dịch vị khác (%) Thời gian (phút) pH pH TBSD Bào tử TBSD Bào tử 60 52,61 83,67 6,52 69,39 90 1,30 82,31 0,43 63,27 Bảng 2.3 Kết đánh giá khả chịu dịch mật nhân tạo Nồng độ muối mật (%) Thời gian (giờ) Đối chứng TBSD Bào tử 13.10 230.103 0,3 0,5 TBSD Bào tử TBSD Bào tử 20.102 4.102 40.103 24.103 20.102 5.102 21.103 42.103 Bảng 2.4 Kết phần trăm tế bào sống sót nồng độ muối mật khác (%) Thời gian (giờ) 0,3% 0,5% TBSD Bào tử TBSD Bào tử 15,38 17,39 15,38 9,13 3,08 10,43 3,85 18,26 c So sánh khả chịu acid dịch vị muối mật dịch mật nồng độ khác - Dịch vị: • Khả chịu mơi trường dịch vị nhân tạo pH tốt môi trường dịch vị nhân tạo có pH Thời gian mơi trường thí nghiệm lâu, tỷ lệ % sống sót giảm • Bào tử chịu đựng sống sót tốt TBSD điều kiện khắc nghiệt dịch vị Điều là bào tử có khả chịu mơi trường dịch vị sinh trưởng nên tốc độ phát triển nhanh so với TBSD • Nhìn chung, khả chịu đựng dịch vị Bacillus subtilis tốt loại vi khuẩn sống ruột non, cần có khả chịu dịch vị dày để đến ruột non, chịu đựng tới pH nên ứng dụng để làm probiotic - Dịch mật: • Khả chịu môi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật 0,3% tốt mơi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật 0,5% Thời gian mơi trường thí nghiệm lâu, tỷ lệ % sống sót giảm • Bào tử chịu đựng sống sót tốt tế bào sinh dưỡng điều kiện khắc nghiệt dịch mật Điều hợp lý bào tử dạng biến đổi vi sinh vật nhằm chống lại điều kiện bất lợi từ mơi trường • Nhìn chung, khả chịu đựng muối mật Bacillus subtilis tốt loại vi khuẩn sống ruột non, có khả dung nạp muối mật, chịu đựng nồng độ lên tới – 5% nên ứng dụng để làm probiotic 2.2.2 Bàn luận - Qua thử nghiệm ta thấy, bào tử có khả chịu đựng mơi trường khắc nghiệt (pH dịch vị, dịch mật) tốt tế bào sinh dưỡng - pH acid (hoặc nồng độ muối mật cao) bào tử khó sống sót Sự sống sót bào tử giảm theo thời gian bào tử tiếp xúc với môi trường bất lợi - Giải thích: Bào tử vi khuẩn có cấu trúc vỏ dày, chịu điều kiện khắc nghiệt môi trường Vì bào tử mọc nhiều hơn, giảm so với tế bào sinh dưỡng Bài Tinh chế enzym amylase alginat 3.1 Tóm tắt lý thuyết 3.1.1 Vai trò enzym amylase - Amylase enzyme có nước bọt dịch mật người, có chức phân hủy tinh bột thành maltose sau thành glucose - Amylase ứng dụng nhiều công nghiệp thực phẩm - Trong y dược, amylase sử dụng để sản xuất glucose làm dung dịch tiêm truyền, sản xuất tinh bột biến tính làm tá dược 3.1.2 Sản xuất enzym amylase - Enzym amylase chiết từ nhiều nguồn khác nhau: thực vật, động vật, vi sinh vật… - Amylase dùng y dược phải có độ tinh khiết cao nên cần tinh chế từ enzyme thô - Nguyên tắc tinh chế amylase dùng chất tương tự tinh bột (alginat) để bắt giữ enzyme từ hỗn hợp thô Tủa phức hợp amylase-alginat cation Ca2+ ly trích lại enzyme tinh chế cách hòa tan ngược lại glucose Nhờ lực enzyme với glucose cao với alginate, ta thu enzyme tinh chế tan dung dịch glucose 3.2 Kết bàn luận 3.2.1 Hàm lượng protein Bảng 3.1 Hàm lượng protein enzym thơ tinh chế Mẫu OD280 Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg) Enzym thô 0,3845 Vthô = 10 76,90 Enzym tinh chế 0,6944 Vtinh chế = 22 15,28 3.2.2 Hoạt tính enzym a Đường chuẩn hoạt tính enzym OD560 Bảng 3.2 Thông số đường chuẩn tinh bột Ống U/ml 0,2 0,4 0,6 0,8 OD 0,1209 0,2697 0,3999 0,5502 0,6531 0.25 0.3 0.2 0.15 Đồ thị đường chuẩn xác định hoạt tính amylase y = 0.2443x + 0.0121 R² = 0.996 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 0.05 b Hoạt tính enzym Bảng 3.3 Hoạt tính enzym thơ tinh chế OD560 thử 0,6245 Độ pha lỗng Enzym thơ OD560 chứng 0,9726 100 524,6 6,82 Enzym tinh chế 0,9154 0,3684 10 180,5 11,81 Mẫu - Hiệu suất tinh chế (Hiệu suất cố định): 𝐻𝑇𝐶𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡𝑖𝑛ℎ 𝐻𝑆 = 𝑥 100% 𝐻𝑇𝐶𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 = - Mức tinh chế: Hoạt tính tổng Hoạt tính riêng enzym (U) (U/protein) 180,5 524,6 𝑥 100% = 34,41% 𝑡ℎô 𝐻𝑇𝑅𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡𝑖𝑛ℎ = 11,81 = 1,73 𝐻𝑇𝑅𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ℎô 6,82 c Nhận xét hiệu suất tinh chế mức tinh chế - Quá trình tinh chế amylase alginate đạt hiệu suất thấp: 34,41% - Sau tinh chế lượng enzym giảm nhiều hoạt tính chuyên biệt tăng 1,73 lần 3.2.3 Bàn luận a Tổng lượng protein - Tổng lượng mẫu dịch enzym thô = 76,90 (mg) - Tổng lượng mẫu dịch enzym sau tinh chế = 15,28 (mg) → Như vậy, trình tinh chế giúp loại lượng protein, có protein khơng phải enzym amylase Nhờ mẫu dịch enzym amylase sau tinh chế tinh khiết so với mẫu dịch enzym thô ban đầu b Tổng hoạt tính enzym - Tổng hoạt tính enzym thơ = 524,6 (U) - Tổng hoạt tính enzym sau tinh chế = 180,5 (U) → Như vậy, sau tinh chế tổng hoạt tính dịch enzym bị giảm so với dịch thơ c Hoạt tính chun biệt enzym - Hoạt tính riêng enzym thơ 6,82 (U/protein) - Hoạt tính riêng enzym tinh chế 11,81 (U/protein) - Mức tinh chế 1,73 lần → Như vậy, sau tinh chế hoạt tính enzym amylase mg protein tăng so với trước tinh chế d Quy trình tinh chế enzym 10 ml enzym thô + 30 ml sodium alginate 2% Khuấy đều, ủ + 20 ml CaCl2 0,7M Lọc lấy tủa + 20 ml glucose 2% Ở 4oC, 12 Lọc lấy dịch (amylase tinh chế) → Kết luận: Vậy q trình tinh chế có hiệu Bài Cố định CGTase lên alginat 4.1 Tóm tắt lý thuyết - Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) enzym có khả chuyển hóa tinh bột chất tương tự thành hỗn hợp cyclodextrin - Cố định giúp tận dụng tăng cường tính ổn định, hoạt tính CGTase đắt tiền - Phân loại phương pháp cố định: • Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion… • Phương pháp liên kết cộng hóa trị • Phương pháp bắt giữ enzym vào khn gel • Phương pháp tạo vi nang - Cố định CGTase lên chất mang alginat Xác định hàm lượng protein cố định thuốc thử Bradford, đo OD 595nm - Hoạt tính CGTase cố định đánh giá thơng qua lượng cyclodextrin CGTase tạo từ maltodextrin điều kiện xác định dựa vào khả hấp phụ làm màu phenolphtalein cyclodextrin 4.2 Kết bàn luận 4.2.1 Hàm lượng protein a Đường chuẩn BSA Bảng 4.1 Thông số đường chuẩn BSA Ống nghiệm Nồng độ BSA (mg/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 0,4970 0,6014 0,7098 0,7599 0,8521 0,9395 0,1044 0,2128 0,2629 0,3551 0,4425 OD595 nm ∆OD595 nm 0.3 y = 0.2412x + 0.0221 R² = 0.9659 ∆OD595 nm 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ BSA (mg/ml) 1.2 b Hàm lượng protein Bảng 4.2 Hàm lượng protein enzym thơ tinh chế OD595 Thể tích (ml) Hệ số pha loãng Hàm lượng protein (mg) Enzym ban đầu 0,8093 Vban đầu = 10 6,92 Enzym không CĐ theo bắt giữ 0,7929 Vgộp = 41 1/17 1,58 Mẫu Enzym CĐ theo bắt giữ 5,34 Enzym không CĐ theo hấp phụ 0,8065 Vgộp = 40 3/17 4,84 Enzym CĐ theo hấp phụ 2,08 4.2.2 Hoạt tính enzym a Đường chuẩn CD Bảng 4.3 Thông số đường chuẩn CD Số thứ tự Nồng độ CD (mg/ml) 10 ∆OD550 0,0776 0,1337 0,1856 0,2138 0,2456 0.3 y = 0.2412x + 0.0221 R² = 0.9659 ∆OD550 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ CD (mg/ml) 1.2 b Hoạt tính enzym Bảng 4.4 Hoạt tính enzym Mẫu OD550 chứng OD550 thử Hệ số pha loãng Hoạt tính chung (U) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Enzym ban đầu 0,6882 0,3982 30 19,57 2,828 Enzym CĐ theo bắt giữ 0,6015 0,3677 10/0,6 8,59 1,609 Enzym CĐ theo hấp phụ 0,6186 0,5282 10/0,6 2,77 1,332 - Hiệu suất cố định protein theo phương pháp bắt giữ: 𝐻% = 𝑚𝑝𝑟 𝑐ố đị𝑛ℎ 𝑚𝑝𝑟 𝑏𝑎𝑛 5,34 𝑥 100% = 77,17% 6,92 𝑥 100% = đầ𝑢 - Hiệu suất cố định protein theo phương pháp hấp phụ: 𝐻% = 𝑚𝑝𝑟 𝑐ố đị𝑛ℎ 𝑚𝑝𝑟 𝑏𝑎𝑛 2,08 𝑥 100% = 30,06% 6,92 𝑥 100% = đầ𝑢 - Tỉ lệ hoạt tính riêng enzym theo phương pháp bắt giữ: 𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑐ố đị𝑛ℎ 𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 𝑇𝐿𝐻𝑇 = 𝑥 100% = 1,609 𝑥 100% = 56,90% 2,828 - Tỉ lệ hoạt tính riêng enzym theo phương pháp hấp phụ: 𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑐ố đị𝑛ℎ 𝐻𝑇𝑅 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 𝑇𝐿𝐻𝑇 = 𝑥 100% = 1,332 𝑥 100% = 47,10% 2,828 c Nhận xét hiệu suất cố định tỉ lệ hoạt tính riêng enzym - Hiệu suất cố định: phương pháp bắt giữ có hiệu suất cố định cao phương pháp hấp phụ (gấp 2,57 lần) - Tỉ lệ hoạt tính riêng enzym: phương pháp bắt giữ có tỉ lệ hoạt tính riêng cao phương pháp hấp phụ (gấp 1,21 lần) 4.2.3 Bàn luận a Sơ đồ cố định CGTase phương pháp bắt giữ ml enzym + 10 ml alginate 2% Nhỏ giọt Cốc chứa 20 ml CaCl2 0,2M Lọc Dịch lọc Hạt gel Rửa 10 ml x lần đệm Tris-HCl Dịch rửa b Sơ đồ cố định CGTase phương pháp hấp phụ 10 ml alginate 2% Nhỏ giọt Cốc chứa 20 ml CaCl2 0,2M Lọc bỏ dịch Hạt gel + 20 ml đệm Tris-HCl pH Để yên 45 phút Lọc + ml enzym Dịch lọc Hạt gel Rửa 10 ml x lần đệm Tris-HCl Dịch rửa c Trong thực tập - Enzym cố định phương pháp hấp phụ bắt giữ - Nguyên tắc: Cho enzyme lẫn vào mạng lưới gel Ca–alginate, enzyme bám bề mặt (hấp phụ) nằm (bắt giữ) hạt gel - Đệm Tris-HCl pH để tạo môi trường ổn định cho enzyme hoạt động tối ưu Tránh dùng đệm phosphate gel alginate khơng bền Bài Tinh chế protein sắc ký lực 5.1 Tóm tắt lý thuyết - Nguyên tắc sắc ký lực: dựa vào gắn thuận nghịch nhóm chức protein đích vào pha tĩnh, protein khác khỏi cột, protein đích sau thơi khỏi cột chất cạnh tranh với (theo thứ tự chất có lực yếu trước, chất có lực mạnh sau) - Kỹ thuật đơn giản hiệu để tinh chế protein, song nhược điểm địi hỏi protein đích phải có nhóm chức mà khơng phải lúc có Tuy nhiên điều khắc phục kỹ thuật tái tổ hợp - Bài thực tập thực tinh chế protein có chứa his-tag IMAC (sắc ký lực ion kim loại) Các ion có lực với đoạn peptid có nhiều histidine (polyHistidine), đặc biệt – 10 histidine Chất dùng để protein imidazole nồng độ > 100mM - Trong sắc ký IMAC, vai trò Imidazol loại đệm: • Đệm chạy: Loại protein tạp khơng gắn với cột • Đệm rửa: Loại protein tạp gắn khơng đặc hiệu với cột • Đệm thơi: Loại protein đích có đoạn peptid chức 5.2 Kết bàn luận 5.2.1 Kết xác định hàm lượng protein Áp dụng kết đường chuẩn BSA có 𝑦 = 0,2412𝑥 + 0,0221 Bảng 5.1 Hàm lượng protein phân đoạn Mẫu A B D2 D3 D4 0,2555 0,1537 0,3072 0,1202 0,2497 0,2722 0,3408 0,2794 Thể tích 1ml 1ml 2,5ml 2,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml Pha loãng 15 10 1 1 1 14,515 5,456 2,955 1,017 0,472 0,518 0,661 0,533 D5 D6 D7 D8 D9 D10 A280 0,2489 0,2246 0,1811 0,1212 0,0719 0,0541 Thể tích 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 1 1 1 0,470 0,420 0,330 0,205 0,103 0,066 A280 Lượng Mẫu Pha loãng Lượng - Hiệu suất: 𝐻𝑆 = B1 C D1 𝑀ẫ𝑢 𝑔ộ𝑝 Mẫu gộp D 3,778 𝐷 𝑀ẫ𝑢 𝐴 100% = 14,515 3,778 𝑥 𝑥 100% = 26,03% → Nhận xét hiệu suất tinh chế: - Tổng lượng protein hứng dung dịch B, C, D so với ban đầu là: 5,456 + 2,955 + 1,017 + 3,778 x 100% = 90,98% 14,515 - Tồn q trình khơng thất nhiều - Sau q trình tinh chế, lượng protein đích thu chiếm khoảng 26,03% lượng protein ban đầu 5.2.2 Bàn luận a Sơ đồ tinh chế protein sắc ký lực Dịch A (protein đích + tạp) Dịch B Đệm chạy (protein tạp khơng có Histidin) Đệm rửa Đệm thơi Dịch C (protein tạp có Histidin) Dịch D (protein tinh chế) Cân bằng, bảo quản cột b Nguyên nhân hiệu suất tinh chế thấp - Bản chất phương pháp tinh chế dùng lực, lực liên kết protein nhựa sắc ký liên kết yếu, nên protein không gắn chắn dễ bị rửa trôi - Giai đoạn để yên 15 phút nhằm đảm bảo gắn kết protein nhựa sắc ký chưa đảm bảo đủ thời gian - Khi nạp dung dịch A q trình chạy cột nhanh nên protein chưa kịp gắn vào pha tĩnh - Lúc bổ sung thêm dung môi khiến hạt silicagel bị xáo trộn ảnh hưởng đến số đĩa lý thuyết - Chất lượng cột sắc ký: không đủ số đĩa lý thuyết yêu cầu hay pha tĩnh liên kết chưa tốt - Cột sắc ký không đủ dài nên thời gian lưu chưa đủ, dẫn đến pha tĩnh cột không đủ để bắt giữ hết protein cần tinh chế c Nguyên nhân sai số trình thao tác - Có thể trộn mẫu khơng dẫn đến sai số đo quang - Ghi nhận thể tích dung dịch bị sai sót nhỏ (thất dịch ống nghiệm hay eppendoft, đọc thể tích sai – chủ quan nhóm) d Dự đốn diện protein dịch thu - Dịch A: protein đích + protein tạp có khơng có His-tag - Dịch B: protein tạp khơng có His-tag - Dịch C: protein tạp có His-tag - Dịch D: protein đích Bài Điện di gel Polyacrylamide (PAGE) 6.1 Tóm tắt lý thuyết - Polyacrylamide polymer với monomer acrylamide Khi acrylamide trùng hợp xúc tác chất tạo gốc tự APS TMED tạo sợi polymer dài kết tủa khỏi dung dịch, nhiên, hỗn hợp monomer ban đầu có mặt Bisacrylamide trùng hợp tạo phân nhánh sợi polymer tạo thành hệ gel có cấu trúc lưới chiều sử dụng để phân tích điện di gel agarose - Hệ PAGE phân tích protein hay ADN chạy với chế độ biến tính chế độ khơng biến tính Hệ đệm dùng dùng liên tục không liên tục - Phần thực hành thực hệ PAGE biến tính (SDS-PAGE) với hệ đệm khơng liên tục Laemmli • Ưu điểm: ‣Chi phí dụng cụ, thuốc thử thấp ‣Dễ sử dụng, tiến hành ‣Phân tách nhanh chóng xác protein • Nhược điểm: ‣Làm biến tính protein ‣Khả ứng dụng thấp 6.2 Kết bàn luận 6.2.1 Kết - Nhận xét mẫu điện di: • Nhìn chung mẫu điện di chạy đủ thời gian, có tách băng rõ ràng • Phân đoạn B mẫu nhiều protein tạp khơng có His-tag Nhìn hình ta thấy nhiều băng loại protein tạp khác • Phân đoạn C mẫu dịch rửa cuối, khơng có diện protein Tuy nhiên sai sót thao tác thực hành nên phân đoạn C chứa băng protein • Mẫu D mẫu chứa protein đích tinh chế, tồn băng protein đích Tuy nhiên sai sót thao tác thực hành nên phân đoạn D ngồi băng protein đích cịn số băng protein tạp khác - Nhận xét protein đích phân đoạn B, C D: • Trong phân đoạn B: dường khơng có diện protein đích • Trong phân đoạn C: có diện protein đích rõ màu, băng tương kích thước ~ 31kDa • Trong phân đoạn D: diện protein đích rõ ràng, băng protein lớn với kích thước ~31 kDa 6.2.2 Bàn luận - Kết điện di chưa rõ ràng, đẹp đẽ nên dễ gây sai sót vấn đề nhận định kết Thao tác nạp mẫu cịn sai sót khiến mẫu tử giếng lan sang giếng khác - Nguyên nhân nạp mẫu nhanh dẫn đến tràn, kĩ thuật dẫn đến lan mẫu sang giếng khác… - Hàm lượng protein mẫu rõ ràng, ăn màu, đặc biệt băng protein đích phân đoạn D rõ ràng, kích thước băng lớn  ... khả sinh kháng sinh E coli S aureus Bảng 1.2 Kết phát khả sinh kháng sinh Chủng E coli S aureus Bacillus - - Bacillus 14 mm - Bacillus 26 mm - Bacillus - - 1.2.3 Bàn luận a Phát vi sinh vật sinh. .. đèn huỳnh quang thấy vòng sáng mờ b Phát khả sinh kháng sinh - Trong thí nghiệm phát vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả ức chế tăng trưởng với vi sinh vật khác • S aureus lỗ gồm B1 – B4 lỗ... ngừng trình phân chia vi sinh vật - Vi sinh vật không bị biến đổi đặc tính di truyền - Thời gian lưu giữ lâu tới vài chục năm 1.2 Kết bàn luận 1.2.1 Phát vi sinh vật sinh enzym amylase protease